Devenir environnemental des antidépresseurs dans les rejets urbains par chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem

Les troubles reliés à la dépression, l’épuisement professionnel et l’anxiété sont de plus en plus répandus dans notre société moderne. La consommation croissante d’antidépresseurs dans les différents pays du monde est responsable de la récente détection de résidus à l’état de traces dans les rejets urbains municipaux. Ainsi, ces substances dites « émergentes » qui possèdent une activité pharmacologique destinée à la régulation de certains neurotransmetteurs dans le cerveau suscitent maintenant de nombreuses inquiétudes de la part de la communauté scientifique. L’objectif principal de ce projet de doctorat a été de mieux comprendre le devenir de plusieurs classes d’antidépresseurs présents dans diverses matrices environnementales (i.e. eaux de surfaces, eaux usées, boues de traitement, tissus biologiques) en développant de nouvelles méthodes analytiques fiables capables de les détecter, quantifier et confirmer par chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-QqQMS, LC-QqToFMS). Une première étude complétée à la station d’épuration de la ville de Montréal a permis de confirmer la présence de six antidépresseurs et quatre métabolites N-desmethyl dans les affluents (2 - 330 ng L-1). Pour ce traitement primaire (physico-chimique), de faibles taux d’enlèvement (≤ 15%) ont été obtenus. Des concentrations d’antidépresseurs atteignant près de 100 ng L-1 ont également été détectées dans le fleuve St-Laurent à 0.5 km du point de rejet de la station d’épuration. Une seconde étude menée à la même station a permis l’extraction sélective d’antidépresseurs dans trois tissus (i.e. foie, cerveau et filet) de truites mouchetées juvéniles exposées à différentes concentrations d’effluent dilué traité et non-traité à l’ozone. Un certain potentiel de bioaccumulation dans les tissus (0.08-10 ng g-1) a été observé pour les spécimens exposés à l’effluent non-traité (20% v/v) avec distribution majoritaire dans le foie et le cerveau. Une intéressante corrélation a été établie entre les concentrations de trois antidépresseurs dans le cerveau et l’activité d’un biomarqueur d’exposition (i.e. pompe N/K ATPase impliquée dans la régulation de la sérotonine) mesurée à partir de synaptosomes de truites exposées aux effluents. Une investigation de l’efficacité de plusieurs stations d’épuration canadiennes opérant différents types de traitements a permis de constater que les traitements secondaires (biologiques) étaient plus performants que ceux primaires (physico-chimiques) pour enlever les antidépresseurs (taux moyen d’enlèvement : 30%). Les teneurs les plus élevées dans les boues traitées (biosolides) ont été obtenues avec le citalopram (1033 ng g-1), la venlafaxine (833 ng g-1) et l’amitriptyline (78 ng g-1). Des coefficients de sorption expérimentaux (Kd) calculés pour chacun des antidépresseurs ont permis d’estimer une grande sorption des composés sertraline, desméthylsertraline, paroxetine et fluoxetine sur les solides (log Kd > 4). Finalement, un excellent taux d’enlèvement moyen de 88% a été obtenu après ozonation (5 mg L-1) d’un effluent primaire. Toutefois, la caractérisation de nouveaux sous-produits N-oxyde (venlafaxine, desmethylvenlafaxine) par spectrométrie de masse à haute résolution (LC-QqToFMS) dans l’effluent traité à l’ozone a mis en lumière la possibilité de formation de multiples composés polaires de toxicité inconnue.

Study on the activation of the biceps brachii compartments in normal subjects

Les prothèses myoélectriques modernes peuvent être dotées de plusieurs degrés de liberté ce qui nécessite plusieurs signaux musculaires pour en exploiter pleinement les capacités. Pour obtenir plus de signaux, il nous a semblé prometteur d'expérimenter si les 6 compartiments du biceps brachial pouvaient être mis sous tension de façon volontaire et obtenir ainsi 6 signaux de contrôle au lieu d'un seul comme actuellement. Des expériences ont donc été réalisées avec 10 sujets normaux. Des matrices d'électrodes ont été placées en surface au-dessus du chef court et long du biceps pour recueillir les signaux électromyographiques (EMG) générés par le muscle lors de contractions effectuées alors que les sujets étaient soit assis, le coude droit fléchi ~ 100 ° ou debout avec le bras droit tendu à l'horizontale dans le plan coronal (sur le côté). Dans ces deux positions, la main était soit en supination, soit en position neutre, soit en pronation. L'amplitude des signaux captés au-dessus du chef court du muscle a été comparée à ceux obtenus à partir du chef long. Pour visualiser la forme du biceps sous les électrodes l'imagerie ultrasonore a été utilisée. En fonction de la tâche à accomplir, l'activité EMG a était plus importante soit dans un chef ou dans l'autre. Le fait de pouvoir activer préférentiellement l'un des 2 chefs du biceps, même si ce n'est pas encore de façon complètement indépendante, suggère que l'utilisation sélective des compartiments pourrait être une avenue possible pour faciliter le contrôle des prothèses myoélectriques du membre supérieur.

Les prostanoïdes contrôlent la circulation placentaire : implication dans la prééclampsie

Au cours de la grossesse, une perfusion placentaire adéquate est indispensable au bon développement du fœtus. Dans certaines maladies comme la prééclampsie, celle-ci est altérée, compromettant ainsi la vie du fœtus, mais aussi celle de sa mère. Le retrait du placenta mène à la disparition des symptômes de la prééclampsie, suggérant un rôle central de ce dernier dans la maladie. Le placenta étant dépourvu d’innervation autonome, le tonus vasculaire placentaire doit être sous le contrôle de facteurs humoraux et tissulaires. Les vaisseaux placentaires sont très réactifs aux prostanoïdes. Le rapport thromboxane A2 (TXA2)/prostacycline (PGI2) est fortement augmenté dans les placentas de grossesses avec prééclampsie. De plus, le taux d’isoprostane, marqueur du stress oxydatif, est accru dans les placentas de femmes avec prééclampsie. Finalement, la prééclampsie s’accompagne d’un stress oxydatif placentaire marqué. Les espèces réactives de l’oxygène sont connues d’une part, pour oxyder l’acide arachidonique (AA), formant ainsi des isoprostanes et d’autre part, pour augmenter la production de TXA2 dans différents tissus, suite à l’activation des cyclooxygénases (COXs). Nous proposons que : 1. les prostanoïdes sont parmi les molécules endogènes qui contrôlent le tonus vasculaire placentaire. 2. la maladie modifie la réponse aux isoprostanes dans les vaisseaux placentaires. 3. l’induction d’un stress oxydatif placentaire entraîne une réponse vasoactive par activation de la voie du métabolisme de l’AA. Nous avons tout d’abord montré, dans des placentas obtenus de grossesses normotensives, que l’U-46619, un mimétique de la TXA2, de même que l’isoprostane, 8-iso-prostaglandine E2 (8-isoPGE2), ont augmenté fortement la pression de perfusion dans les cotylédons perfusés in vitro et la tension dans les anneaux d’artères chorioniques suspendus dans des bains à organe isolé. En revanche, dans les artères chorioniques de placentas obtenus de grossesses avec prééclampsie, ces réponses étaient modifiées puisque la réponse maximale à l’U-46619 était augmentée et celle à la 8-isoPGE2 diminuée. D’autre part, nous avons montré que les réponses maximales aux deux prostanoïdes étaient augmentées dans les vaisseaux placentaires de grossesse normale ou avec prééclampsie issus d’une délivrance prématurée par rapport à ceux d’une délivrance à terme. Ceci suggère une évolution de la réactivité des artères placentaires au cours du 3e trimestre de grossesse. En outre, les vaisseaux placentaires ont répondu aux prostanoïdes de façon semblable qu’ils aient été issus d’un accouchement vaginal ou d’une césarienne élective. Ceci indique que les prostanoïdes placentaires n’interviennent pas dans le processus de délivrance. D’un autre côté, l’utilisation de bloqueurs spécifiques des récepteurs TP à la TXA2, le SQ29,548 et l’ICI192,605, et des récepteurs EP à la prostaglandine E2, l’AH6809, nous ont permis de mettre en évidence le fait que l’U-46619 et la 8-isoPGE2 pouvaient agir de façon non-sélective sur l’un ou l’autre des récepteurs. Ces résultats supportent donc nos 2 premières hypothèses : les prostanoïdes font partie des molécules endogènes qui peuvent contrôler le tonus vasculaire placentaire et la prééclampsie modifie la réponse aux isoprostanes dans les artères chorioniques d’une manière compatible avec l’augmentation de la production de ces substances qui elle, est probablement le résultat du stress oxydatif. En revanche, en ce qui concerne les substances capables de jouer la contrepartie vasodilatatrice, l’utilisation d’un inhibiteur des synthases de monoxyde d’azote, le L-NAME, et celle d’inhibiteurs des COXs, l’ibuprofène, l’indométacine et le N-2PIA, ne nous a pas permis de mettre en évidence un quelconque rôle du monoxyde d’azote ou des prostanoïdes vasodilatatrices à ce niveau. Finalement, nous avons montré que l’induction d’un stress oxydatif dans les cotylédons perfusés in vitro et les artères chorioniques entraînait une vasoconstriction marquée. Celle-ci semble résulter de l’action des prostanoïdes puisqu’un blocage des récepteurs TP ou des COXs diminuait significativement la réponse maximale au peroxyde d’hydrogène. Les prostanoïdes impliquées dans la réponse au stress oxydatif proviendraient essentiellement d’une activation des COXs puisque l’étude ne nous permet pas de conclure à une quelconque implication des isoprostanes dans cette réponse. Ces observations confirment donc notre hypothèse que, dans le placenta, le stress oxydatif possède des propriétés vasoactives par activation du métabolisme de l’AA. En résumé, les résultats obtenus dans les placentas de grossesses normotensives et avec prééclampsie suggèrent que les prostanoïdes sont des molécules d’importance dans la régulation du tonus vasculaire placentaire. Le fait que la prééclampsie modifie la réponse aux prostanoïdes pourrait expliquer pourquoi la perfusion placentaire est altérée chez ces patientes. En outre, il apparaît évident qu’il existe un lien étroit entre le stress oxydatif et la voie de synthèse des prostanoïdes placentaires. Cependant d’autres études sont nécessaires pour mieux comprendre la nature de ce lien, qui pourrait, d’une certaine façon, jouer un rôle important dans le développement de la prééclampsie.

Conception, synthèse et diversification de l'azaGly-Pro : un mime de tour beta, outil d'étude structure-activité : application au développement d'un nouvel agent tocolytique

Les accouchements prématurés constituent un problème médical majeur en constante augmentation et ce, malgré tous les efforts mis en œuvre afin de contrer le déclenchement des contractions avant terme. Cette thèse relate du ''design'' rationnel d'un nouvel agent thérapeutique (i.e., tocolytique) qui serait capable de 1) arrêter les contractions, et 2) prolonger la gestation. Pour ce faire, une nouvelle cible, la prostaglandine F2α et son récepteur ont été sélectionnés et le peptidomimétisme a été choisi afin de résoudre cette problématique. L'introduction contient un historique rapide de la conception à la synthèse (''drug design'') du peptide parent, le PDC113, premier peptide a avoir démontré des aptitudes tocolytiques suffisantes pour faire du peptidomimétisme. La deuxième partie de l'introduction présente les concepts du peptidomimétisme appliqués au PDC113 qui ont permis d'accéder au PDC113.824, inhibiteur allostérique du récepteur de la prostaglandine F2α, et explique comment ce mime nous a permis d'élucider les mécanismes de signalisation intracellulaire impliqués dans la contraction musculaire lisse. Cette thèse présente la conception, la synthèse et l'étude structure-activité de mimes de repliement de tour β au sein du mime peptidique original (PDC113.824) dans lequel nous avons remplacé l'azabicycloalkane central (l'indolizidin-2-one) par une série d'autres azabicycloalcanes connus et des acides aza-aminés dont nous avons élaboré la synthèse. Dans un premier temps, une nouvelle stratégie de synthèse en solution de l'aza-glycyl-proline à partir de la diphényle hydrazone et du chloroformate de p-nitrophényle a été réalisée. Cette stratégie a permis d'éliminer les réactions secondaires de cyclisation intramoléculaires communément obtenues lors de l'introduction d'acides aza-aminés avec les protections traditionnelles de type carbamate en présence de phosgène, mais aussi de faciliter l'accès en une étape à des dérivés peptidiques du type aza-glycyle. L'élongation de l'aza-glycyl-proline en solution nous a permis d'accéder à un nouveau mime tetrapeptidique du Smac, un activateur potentiel de l'apoptose au sein de cellules cancéreuses. Par la suite, nous avons développé une stratégie de diversification sélective de l'azote α du résidu azaglycine en utilisant différents types d'halogénures d'alkyle en présence de tert-butoxyde de potassium. Afin de valider le protocole d'alkylation de l'aza-dipeptide, différents halogénures d'alkyle ont été testés. Nous avons également démontré l'utilité des aza-dipeptides résultants en tant que ''building block'' afin d'accéder à une variété d'azapeptides. En effet, l'aza-dipeptide a été déprotégée sélectivement soit en N-terminal soit en C-terminal, respectivement. D'autre part, la libération de l'amine de l'ester méthylique de l'aza-alkylglycyl-proline a conduit à une catégorie de composés à potentiel thérapeutique, les azadicétopipérazines (aza-DKP) par cyclisation intramoléculaire. Enfin, notre intérêt quant au développement d'un nouvel agent tocolytique nous a amené à développer une nouvelle voie de synthèse en solution du PDC113.824 permettant ainsi d'élucider les voies de signalisation intracellulaires du récepteur de la prostaglandine F2α. Afin de valider l'importance de la stéréochimie et d'étudier la relation structure/ activité du mime, nous avons remplacé l'indolizidin-2-one (I2aa) centrale du PDC113.824 par une série d'autres azabicycloalcanes et azadipeptides. Les azabicycloalcanes D-I2aa, quinolizidinone, et indolizidin-9-one ont été synthétisés et incorporés au sein du dit peptide ne donnant aucune activité ni in vitro ni ex vivo, validant ainsi l'importance du tour β de type II' pour le maintien de l'activité biologique du PDC113.824. Finalement, l'insertion d'une série de dérivés aza(alkyl)glycyl-prolyles a mené à de nouveaux inhibiteurs allostériques du récepteur de la PGF2α, l'un contenant l'azaglycine et l'autre, l'azaphénylalanine. Cette thèse a ainsi contribué, grâce à la conception et l'application de nouvelles méthodes de synthèse d'aza-peptides, au développement de nouveaux composés à potentiel thérapeutique afin d'inhiber le travail prématuré.

Films minces supramoléculaires de copolymères de PS-P4VP réalisés par trempage

Bien que ce soit un procédé industriel répandu, les films de copolymères à blocs préparés par trempage (« dip-coating ») sont moins étudiés que ceux obtenus par tournette (« spin-coating »). Pourtant, il est possible grâce à cette technique de contrôler précisément les caractéristiques de ces films. Au-delà de la méthode de fabrication, la capacité de modifier la morphologie des films trempés à l’aide d’autres facteurs externes est un enjeu primordial pour leur utilisation dans les nanotechnologies. Nous avons choisi, ici, d’étudier l’influence d’une petite molécule sur la morphologie de films supramoléculaires réalisés par « dip-coating » à partir de solutions de poly(styrène-b-4-vinyl pyridine) (PS-P4VP) dans le tétrahydrofurane (THF). En présence de 1-naphtol (NOH) et d’1-acide napthoïque (NCOOH), qui se complexent par pont hydrogène au bloc P4VP, ces films donnent, respectivement, une morphologie en nodules (sphères) et en stries (cylindres horizontaux). Des études par spectroscopie infrarouge ont permis de mesurer la quantité de petite molécule dans ces films minces, qui varie avec la vitesse de retrait mais qui s’avère être identique pour les deux petites molécules, à une vitesse de retrait donnée. Cependant, des études thermiques ont montré qu’une faible fraction de petite molécule est dispersée dans le PS (davantage de NOH que de NCOOH à cause de la plus faible liaison hydrogène du premier). La vitesse de retrait est un paramètre clé permettant de contrôler à la fois l’épaisseur et la composition du film supramoléculaire. L’évolution de l’épaisseur peut être modélisée par deux régimes récemment découverts. Aux faibles vitesses, l’épaisseur décroît (régime de capillarité), atteint un minimum, puis augmente aux vitesses plus élevées (régime de drainage). La quantité de petite molécule augmente aux faibles vitesses pour atteindre un plateau correspondant à la composition de la solution aux vitesses les plus élevées. Des changements de morphologie, à la fois liés à l’épaisseur et à la quantité de petite molécule, sont alors observés lorsque la vitesse de retrait est modifiée. Le choix du solvant est aussi primordial dans le procédé de « dip-coating » et a été étudié en utilisant le chloroforme, qui est un bon solvant pour les deux blocs. Il s’avère qu’à la fois la composition ainsi que la morphologie des films de PS-P4VP complexés sont différentes par rapport aux expériences réalisées dans le THF. Premièrement, la quantité de petite molécule reste constante avec la vitesse de retrait mais les films sont plus riches en NCOOH qu’en NOH. Deuxièmement, la morphologie des films contenant du NOH présente des stries ainsi que des lamelles à plat, tandis que seules ces dernières sont observables pour le NCOOH. Ce comportement est essentiellement dû à la quantité différente de petite molécule modulée par leur force de complexation différente avec le P4VP dans le chloroforme. Enfin, ces films ont été utilisés pour l’adsorption contrôlée de nanoparticules d’or afin de guider leur organisation sur des surfaces recouvertes de PS-P4VP. Avant de servir comme gabarits, un recuit en vapeurs de solvant permet soit d’améliorer l’ordre à longue distance des nodules de P4VP, soit de modifier la morphologie des films selon le solvant utilisé (THF ou chloroforme). Ils peuvent être ensuite exposés à une solution de nanoparticules d’or de 15 nm de diamètre qui permet leur adsorption sélective sur les nodules (ou stries) de P4VP.

La protection de l'animal en droit constitutionnel

L'étude porte sur une norme juridique déterminée, identifiée par sa valeur ­ constitutionnelle ­ et par son objet ­ qui est de protéger l'animal pour lui-même. La recherche a été conduite sans délimitation a priori du champ des pays étudiés. Il n'y a pas eu à proprement parler de choix des pays puisque tous ont été intégrés à la présente étude, sans critère d'exclusion ou de discrimination (tel que le niveau de développement ou le type de système juridique dont ils relèvent). Les Constitutions actuellement en vigueur de tous les Etats unitaires ou fédéraux ont été passées au crible de l'analyse. En revanche, les Constitutions des entités fédérées n'ont pas fait l'objet d'une analyse systématique mais seulement d'une étude sélective. L'objectif de la recherche était de réaliser une étude générale en apportant des réponses aux interrogations suivantes : quelles sont les normes constitutionnelles de protection de l'animal ? Pourquoi et comment ont-elles été adoptées ? Quelle est leur portée dans les ordres juridiques concernés ? De cette recherche ressortent principalement trois enseignements. Premièrement, le phénomène de la consécration de normes constitutionnelles de protection de l'animal est récent et en plein développement. Deuxièmement, ces normes présentent des formulations différentes et procèdent de deux considérations distinctes : le respect de l'animal en Inde, la prise en compte de sa sensibilité dans les autres pays (essentiellement les pays occidentaux). Troisièmement, ces normes revêtent le plus souvent la nature d'objectif constitutionnel, ce qui leur permet de justifier au nom du respect, du bien-être ou de la protection de l'animal les limitations apportées aux droits constitutionnels, notamment la liberté du commerce, la liberté artistique et la liberté de la recherche.

Spéciation chimique des nanoparticules d'argent dans les sols

À cause de leurs propriétés antibactériennes, les nanoparticules d’argent sont couramment utilisées dans un grand nombre de produits tels les tissus, les savons et les produits médicaux. Dans cette industrie en pleine croissance, ces nanoparticules sont produites en grandes quantités et s’accumuleront éventuellement dans l’environnement. Pour comprendre le destin, le transport et la biodisponibilité des nanomatériaux, il est essentiel de comprendre leurs propriétés physicochimiques. Entre autres, il est particulièrement important de quantifier la dissolution des nanoparticules à l’aide de mesures de spéciation chimique. En effet, l’objectif de cette recherche est de déterminer la spéciation chimique des nanoparticules d’argent dans différents sols. Pour y parvenir, différentes concentrations de nanoparticules d’argent ont été incorporées dans un sol et après un certain laps de temps, la forme ionique a été mesurée à l’aide d’une électrode sélective d’argent tandis que l’argent total est mesuré par absorption atomique ou par ICP-MS. L’analyse de la spéciation dans trois sols différents révèle que les caractéristiques des sols influencent grandement la spéciation chimique, plus particulièrement la quantité de matière organique ainsi que le pH du sol. Ainsi, la tendance des résultats semble indiquer que plus un sol est acide, il y aura plus d’ions argent libres tandis que la matière organique adsorbe fortement les ions argent les rendant ainsi moins disponibles en solution. L’observation de la spéciation chimique à long terme indique aussi que les nanoparticules tendent à éventuellement se dissocier et ainsi émettre un plus grand nombre d’ions dans l’environnement. Ces résultats ont des implications importantes dans la détermination des risques environnementaux des nanoparticules métalliques.

Impact d’un épisode asphyxique périnatal associé à des convulsions sur le développement des interneurones corticaux : rôle de l’adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK)

L’encéphalopathie hypoxique-­‐ischémique cause des milliers de victimes à travers le monde chaque année. Les enfants survivants à un épisode hypoxique-­‐ischémique sont à risque de développer des problèmes neurologiques incapacitants comme une paralysie cérébrale, un retard mental, une épilepsie ou des troubles d’ordre comportemental. Les modèles animaux ont amélioré nos connaissances sur les mécanismes sous-­‐jacents aux dommages cérébraux, mais elles sont encore trop incomplètes pour être capables de prévenir les problèmes neurologiques. Ce projet vise à comprendre l’impact d’un épisode asphyxique périnatale associé à des convulsions ainsi que l’activation de l’adenosine monophosphate-­‐activated protein kinase (AMPK) sur les circuits GABAergiques inhibiteurs en développement chez la souris. Dans le but d’investiguer le sort des neurones inhibiteurs, appelés interneurones, suite à un épisode asphyxique périnatal associé à des convulsions avec des animaux transgéniques, nous avons pris avantage d’un nouveau modèle d’hypoxie permettant d’induire des convulsions chez la souris. Deux populations d’interneurones représentant ensemble environ 60% de tous les interneurones corticaux ont été étudiées, soit les cellules exprimant la parvalbumine (PV) et les cellules exprimant la somatostatine (SOM). L’étude stéréologique n’a montré aucune mort neuronale de ces deux populations d’interneurones dans l’hippocampe chez les souris hypoxique d’âge adulte. Par contre, le cortex des souris hypoxiques présentait des zones complètement ou fortement dépourvues de cellules PV alors que les cellules SOM n’étaient pas affectées. L’utilisation d’une lignée de souris transgénique exprimant une protéine verte fluorescente (GFP) dans les cellules PV nous a permis de comprendre que les trous PV sont le reflet de deux choses : 1) une diminution des cellules PV et 2) une immaturité des cellules PV restantes. Puisque les cellules PV sont spécifiquement affectées dans la première partie de notre étude, nous avons voulu étudier les mécanismes moléculaires sous-­‐jacents à cette vulnérabilité. L’AMPK est un senseur d’énergie qui orchestre le rétablissement des i niveaux d’énergie cellulaire dans le cas d’une déplétion énergétique en modulant des voies de signalisation impliquant la synthèse de protéines et l’excitabilité membranaire. Il est possible que l’activation d’AMPK suite à un épisode asphyxique périnatal associé à des convulsions soit néfaste à long-­‐terme pour le circuit GABAergique en développement et modifie l’établissement de l’innervation périsomatique d’une cellule PV sur les cellules pyramidales. Nous avons étudié cette hypothèse dans un modèle de culture organotypique en surexprimant la forme wild-­‐type (WT) de la sous-­‐unité α2 d’AMPK, ainsi qu’une forme mutée dominante négative (DN), dans des cellules PV individuelles. Nous avons montré que pendant la phase de formation synaptique (jours post-­‐natals équivalents EP 10-­‐18), la surexpression de la forme WT désorganise la stabilisation des synapses. De plus, l’abolition de l’activité d’AMPK semble augmenter le nombre de synapses périsomatiques faits par la cellule PV sur les cellules pyramidales pendant la phase de formation et semble avoir l’effet inverse pendant la phase de maturation (EP 16-­‐24). La neurotransmission GABAergique joue plusieurs rôles dans le cerveau, depuis la naissance jusqu’à l’âge adulte des interneurones, et une dysfonction des interneurones a été associée à plusieurs troubles neurologiques, comme la schizophrénie, l’autisme et l’épilepsie. La maturation des circuits GABAergiques se fait majoritairement pendant la période post-­‐natale et est hautement dépendante de l’activité neuronale et de l’expérience sensorielle. Nos résultats révèlent que le lourd fardeau en demande énergétique d’un épisode asphyxique périnatal peut causer une mort neuronale sélective des cellules PV et compromettre l’intégrité de leur maturation. Un des mécanismes sous-­‐ jacents possible à cette immaturité des cellules PV suite à l’épisode hypoxique est l’activation d’AMPK, en désorganisant leur profil d’innervation sur les cellules pyramidales. Nous pensons que ces changements dans le réseau GABAergique pourrait contribuer aux problèmes neurologiques associés à une insulte hypoxique.

Use of cellular impedance to characterize ligand functional selectivity at G protein-coupled receptors

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) représentent la plus grande famille de cibles thérapeutiques pour le traitement d’une panoplie de pathologies humaines. Bien que plusieurs décennies de recherche aient permis de façonner nos connaissances sur ces protéines membranaires, notre compréhension des déterminants moléculaires de leur activité signalétique reste encore limitée. De ces domaines de recherche, une avancée récente a mis à jour un nouveau phénomène, appelé sélectivité fonctionnelle des ligands, qui a bouleversé les paradigmes décrivant leu fonctionnement de ces récepteurs. Ce concept émane d’observations montrant que l’activité pharmacologique de certains ligands n’est pas nécessairement conservée sur tout le répertoire signalétiques connu du récepteur et peu se restreindre à l'activation sélective d’un sous-groupe de voies de signalisation.Ce nouveau modèle pharmacologique de l'activation des RCPG ouvre de nouvelles possibilités pour la découverte de médicaments plus efficace et sûr, ciblant les RCPGs. En effet, il permet la conception de molécules modulant spécifiquement les voies signalétiques d’intérêt thérapeutique, sans engager les autres voies qui pourraient mener à des effets secondaires indésirables ou de la tolérance. Cette thèse décrit l'utilisation d'une nouvelle approche sans marquage, basée sur la mesure du changement l'impédance cellulaire. Par la mesure des changements cellulaires, comme la morphologie, l’adhésion et/ou la redistribution des macromolécules, cette approche permet de mesurer de façon simultanée l'activité de plusieurs voies de signalisation impliqués dans ces réponses. Utilisant le récepteur β2-adrénergique (β2AR) comme modèle, nous avons démontré que les variations dans l’impédance cellulaire étaient directement liées à l’activation de multiples voies de signalisation suite à la stimulation du récepteur par son ligand. L’agoniste type du β2AR, l’isoprotérénol, s’est avéré induire une réponse d’impédance dose-dépendante constituée, dans le temps, de plusieurs caractéristiques distinctes pouvant être bloquées de façon compétitive par l’antagoniste ICI118,551 Par l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs, nous avons été en mesure de déterminer la contribution de plusieurs voies signalétiques canoniques, comme les voies dépendantes de Gs et Gi, la production d’AMPc et l’activation de ERK1/2, sur ces changements. De plus, la dissection de la réponse d’impédance a permis d’identifier une nouvelle voie de mobilisation du Ca2+ contribuant à la réponse globale des changements initiés par la stimulation du β2AR. Dans une autre étude, nous avons rapporté que la réponse calcique induite par le β2AR serait attribuable à une transactivation Gs-dépendant du récepteur purinergique P2Y11, lui-même couplé à la protéine Gq. La mesure d’impédance permettant de distinguer et de décrire une pléiade d’activités signalétiques, nous avons émis l’hypothèse que des ligands arborant des profils signalétiques différents généreraient des réponses d’impédance distinctes. Le criblage d’une librairie de ligands spécifiques au β2AR a révélé une grande variété de signatures d’impédance. Grâce au développement d’une approche computationnelle innovatrice, nous avons été en mesure de regrouper ces signatures en cinq classes de composés, un regroupement qui s’est avéré hautement corrélé avec le profil signalétique des différents ligands. Nous avons ensuite combiné le criblage de composés par impédance avec l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs de voies signalétiques afin d’augmenter la résolution du regroupement. En évaluant l’impact d’une voie signalétique donnée sur la signature d’impédance, nous avons été en mesure de révéler une plus grande variété de textures parmi les ligands. De plus, cette méthode s’est avérée efficace pour prédire le profil signalétique d’une librairie de composés non caractérisés, ciblant le β2AR. Ces travaux ont mené à l’élaboration d’une méthode permettant d’exprimer visuellement la sélectivité fonctionnelle de ligands et ont révélé de nouvelles classes de composés pour ce récepteur. Ces nouvelles classes de composés ont ensuite été testées sur des cardiomyocytes humains, confirmant que les composés regroupés dans différentes classes produisent des effets distincts sur la contractilité de ces cellules. Globalement, ces travaux démontrent la pertinence de l’utilisation de l’impédance cellulaire pour une évaluation précise des différences fonctionnelles parmi les composés ciblant les RCPGs. En fournissant une représentation pluridimensionnelle de la signalisation émanant des RCPGs à l’aide d’un seul essai ne requérant pas de marquage, les signatures d’impédance représentent une stratégie simple et innovante pour l’évaluation de la fonctionnalité sélective des ligands. Cette méthode pourrait être d’une grande utilité dans le processus de découverte de nouveaux médicaments.

Développement et radiosynthèse de ligands du récepteur tyrosine kinase neurotrophique type 2 (TrkB) marqués aux carbone-11 et fluor-18 pour l’imagerie cérébrale par tomographie d’émission de positons

Ce mémoire présente mes travaux ayant menés au développement d’une première génération de radioligands marqués au fluor-18 (t1/2 = 110 min) et au carbone-11 (t1/2 = 20.4 min) destinés à l’imagerie cérébrale in vivo du récepteur tyrosine kinase neurotrophique de type 2 (TrkB) en tomographie par émission de positons (TEP). Ces travaux reposent sur l’identification récente de ligands de TrkB non peptidiques à hautes affinités dérivés du 7,8-dihydroxyflavone. La synthèse d’une série de dérivés du 7,8-dihydroxyflavone non-radioactifs de même que des précuseurs à l’incorporation du fluro-18 et du carbone-11 a d’abord été effectuée. Partant des précurseurs adéquats synthétisés, la radiosynthèse de deux radioligands, l’un marqué au fluor-18 et l’autre au carbone-11, a été développée. Ces radiosynthèses reposent respectivement sur une 18F-radiofluorination nucléophile aromatique nouvelle et hautement efficace et sur une 11C-méthylation N-sélective. Les radiotraceurs de TrkB ainsi obtenus ont ensuite été évalués in vitro en autoradiographie et in vivo en tant que traceurs TEP dans des rats. L’évaluation des propriétés physico-chimique de même que de la stabilité in vitro des radiotraceurs sont présentées. Partant d’une série d’analogues cristallisés de ces flavones synthétiques, une étude de relation structure-activité a été menée. La combinaison de cette étude, de pair avec l’évaluation in vivo de la première génération de radiotraceurs de TrkB a aussi permis d’investiguer les pharmacophores nécessaires à l’affinité de ces ligands de même que d’identifier des fragments structurels associés au métabolisme des radiotraceurs. La radiosynthèse d’un troisième radioligand de TrkB et son évaluation TEP in vivo de même que la mise en lumière des modifications structurelles utiles au développement d’une seconde génération de radioligands de TrkB avec des propriétés optimisées pour fin d’imagerie TEP sont aussi détaillés.

Évolution moléculaire : un modèle Markov-modulé pour les processus de substitution

Les processus Markoviens continus en temps sont largement utilisés pour tenter d’expliquer l’évolution des séquences protéiques et nucléotidiques le long des phylogénies. Des modèles probabilistes reposant sur de telles hypothèses sont conçus pour satisfaire la non-homogénéité spatiale des contraintes fonctionnelles et environnementales agissant sur celles-ci. Récemment, des modèles Markov-modulés ont été introduits pour décrire les changements temporels dans les taux d’évolution site-spécifiques (hétérotachie). Des études ont d’autre part démontré que non seulement la force mais également la nature de la contrainte sélective agissant sur un site peut varier à travers le temps. Ici nous proposons de prendre en charge cette réalité évolutive avec un modèle Markov-modulé pour les protéines sous lequel les sites sont autorisés à modifier leurs préférences en acides aminés au cours du temps. L’estimation a posteriori des différents paramètres modulants du noyau stochastique avec les méthodes de Monte Carlo est un défi de taille que nous avons su relever partiellement grâce à la programmation parallèle. Des réglages computationnels sont par ailleurs envisagés pour accélérer la convergence vers l’optimum global de ce paysage multidimensionnel relativement complexe. Qualitativement, notre modèle semble être capable de saisir des signaux d’hétérogénéité temporelle à partir d’un jeu de données dont l’histoire évolutive est reconnue pour être riche en changements de régimes substitutionnels. Des tests de performance suggèrent de plus qu’il serait mieux ajusté aux données qu’un modèle équivalent homogène en temps. Néanmoins, les histoires substitutionnelles tirées de la distribution postérieure sont bruitées et restent difficilement interprétables du point de vue biologique.

Voies de signalisation non-canoniques du récepteur V2 de la vasopressine

Le récepteur V2 (V2R) de la vasopressine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG), jouant un rôle fondamental dans le maintien de l’homéostasie hydrosodique. À l’instar de nombreux RCPGs, il est capable d’interagir avec plusieurs types de protéines G hétérotrimériques et possède des voies de signalisation peu explorées aux mécanismes mal compris. Ces voies non canoniques font l’objet des travaux exposés dans ce mémoire. Il s’agit d’explorer les caractéristiques et mécanismes de la signalisation de V2R via G12, et de la voie d’activation d’ERK 1/2 par transactivation du récepteur de l’insulin-like growth factor 1, IGF1R. Par des études de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), nous exposons la capacité de V2R à interagir avec la sous-unité Gα12 ainsi que la modulation de la conformation de l’hétérotrimère G12 par l’agoniste de V2R, l’arginine-vasopressine. Ces travaux dévoilent également la modulation de l’interaction entre Gα12 et son effecteur classique RhoA, suggérant un engagement de RhoA, ainsi que la potentialisation via Gα12 de la production d’AMP cyclique. À l’aide de diverses méthodes d’inhibition sélective, nos résultats précisent les mécanismes de la transactivation. Ils supportent notamment le rôle initiateur de l’activation de Src par V2R et l’absence d’implication des ligands connus d’IGF1R dans la transactivation. La métalloprotéase MMP 3 apparaît par ailleurs comme un bon candidat pour réguler la transactivation. Ce projet met en lumière des modes de signalisation peu explorés de V2R, dont l’implication physiologique et physiopathologique pourrait s’avérer significative, au-delà d’un apport fondamental dans la compréhension de la signalisation des RCPGs.

Attention! Prêt? On s’enTraine! Étude d’efficacité d’un programme d’entraînement intensif des processus attentionnels chez des jeunes ayant subi un traumatisme craniocérébral

Les dysfonctions attentionnelles suivant un traumatisme craniocérébral (TCC) compliquent souvent la reprise des activités de la vie quotidienne et influencent négativement le pronostic de réinsertion socio-académique et professionnelle. Or, les cliniciens de réadaptation disposent d’un nombre limité d’outils de remédiation cognitive dont l’efficacité est démontrée et qui sont adaptés à une population francophone. Cette étude vise à démontrer l’efficacité d’un protocole d’entrainement intensif des fonctions attentionnelles : « Attention! Prêt? On s’enTraine! » (Séguin, Lahaie & Beauchamp, 2012), basé sur une adaptation française de l’« Attention Process Training-I » (APT-I; Sohlberg & Mateer, 1987). Dix-sept participants ayant subi un TCC et présentant des déficits attentionnels ont reçu 15 séances d’entrainement attentionnel avec le programme « Attention! Prêt? On s’enTraine! » (n = 8) ou de l’aide aux devoirs (n = 9). Suite à l’intervention, les participants du groupe expérimental ont amélioré leur rendement dans plusieurs fonctions ciblées par l’intervention attentionnelle, notamment au niveau du balayage visuel, de l’attention sélective et de l’alternance attentionnelle. De plus, les gains se sont généralisés à des fonctions connexes, puisqu’une meilleure performance a été retrouvée dans des tâches de mémoire de travail, d’inhibition, de flexibilité cognitive et de planification visuoconstructive. La démonstration de l’effet positif d’un entrainement intensif sur le rendement attentionnel pourrait inciter les cliniciens et chercheurs à développer et à valider d’autres protocoles de remédiation cognitive francophones, pour les fonctions attentionnelles ou d’autres sphères de la cognition. Par le fait même, le pronostic fonctionnel de la clientèle pédiatrique en traumatologie en sera potentialisé.

Role of the ASPP Family in the Regulation of p53-Mediated Apoptotic Death of Retinal Ganglion Cells after Optic Nerve Injury

Le glaucome est la première cause de cécité irréversible à travers le monde. À présent il n’existe aucun remède au glaucome, et les thérapies adoptées sont souvent inadéquates. La perte de vision causée par le glaucome est due à la mort sélective des cellules rétiniennes ganglionnaires, les neurones qui envoient de l’information visuelle de la rétine au cerveau. Le mécanisme principal menant au dommage des cellules rétiniennes ganglionnaires lors du glaucome n’est pas bien compris, mais quelques responsables putatifs ont été proposés tels que l’excitotoxicité, le manque de neurotrophines, la compression mécanique, l’ischémie, les astrocytes réactifs et le stress oxidatif, parmis d’autres. Indépendamment de la cause, il est bien établi que la perte des cellules rétiniennes ganglionnaires lors du glaucome est causée par la mort cellulaire programmée apoptotique. Cependant, les mécanismes moléculaires précis qui déclenchent l’apoptose dans les cellules rétiniennes ganglionnaires adultes sont mal définis. Pour aborder ce point, j’ai avancé l’hypothèse centrale que l’identification de voies de signalisations moléculaires impliquées dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires offrirait des avenues thérapeutiques pour ralentir ou même prévenir la mort de celles-ci lors de neuropathies oculaires telles que le glaucome. Dans la première partie de ma thèse, j’ai caractérisé le rôle de la famille de protéines stimulatrices d’apoptose de p53 (ASPP), protéines régulatrices de la famille p53, dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires. p53 est un facteur de transcription nucléaire impliqué dans des fonctions cellulaires variant de la transcription à l’apoptose. Les membres de la famille ASPP, soit ASPP1, ASPP2 et iASPP, sont des protéines de liaison de p53 qui régulent l’apoptose. Pourtant, le rôle de la famille des ASPP dans la mort des cellules rétiniennes ganglionnaires est inconnu. ASPP1 et ASPP2 étant pro-apoptotiques, l’hypothèse de cette première étude est que la baisse ciblée de ASPP1 et ASPP2 promouvrait la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires après une blessure du nerf optique. Nous avons utilisé un modèle expérimental bien caractérisé de mort apoptotique neuronale induite par axotomie du nerf optique chez le rat de type Sprague Dawley. Les résultats de cette étude (Wilson et al. Journal of Neuroscience, 2013) ont démontré que p53 est impliqué dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires, et qu’une baisse ciblée de ASPP1 et ASPP2 par acide ribonucléique d’interference promeut la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires. Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai caractérisé le rôle d’iASPP, le membre anti-apoptotique de la famille des ASPP, dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires. L’hypothèse de cette seconde étude est que la surexpression d’iASPP promouvrait la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires après axotomie. Mes résultats (Wilson et al. PLoS ONE, 2014) démontrent que le knockdown ciblé de iASPP exacerbe la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires, et que la surexpression de iASPP par virus adéno-associé promeut la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes régulateurs sous-jacents la perte de cellules rétiniennes ganglionnaires par apoptose et pourraient fournir des pistes pour la conception de nouvelles stratégies neuroprotectrices pour le traitement de maladies neurodégénératives telles que le glaucome.

Synthèse totale du méthyl ester de la zincophorine et étude DFT du transfert d’hydrogène diastéréosélectif impliquant des intermédiaires radicalaires vicinaux à un ester

Cet ouvrage traite d’une méthodologie pour l’induction de centres stéréogènes au sein des motifs propionates par la chimie des radicaux et de son application à la synthèse totale du méthyl ester de la zincophorine. Cet ionophore, aux propriétés biologiques intéressantes, présente plusieurs défis synthétiques dont une séquence de type polypropionate anti, anti, anti, anti difficilement accessible ainsi qu’un tétrahydropyrane trans trisubstitué. Récemment, l’intérêt renouvelé pour ces composés polyéthers, en tant qu’agents anticancéreux, accentue l’importance de stratégies versatiles permettant l’accès à ces structures ainsi qu’à leurs analogues. Depuis quelques années, notre groupe s’intéresse à la synthèse d’unités propionates acycliques par une séquence réactionnelle contrôlée uniquement par le substrat. La première étape découle d’une aldolisation de Mukaiyama entre un aldéhyde alpha-chiral et un énoxysilane tétrasubstitué portant une liaison carbone-halogène, et où l’issue stéréochimique dépend de la nature monodentate ou bidentate de l’acide de Lewis employé. La seconde réaction-clé implique la formation d’un radical tertiaire, vicinal à un ester, pouvant être réduit diastéréosélectivement en présence d’hydrure d’étain. La première section décrit l’élaboration de motifs tétrahydropyranes trisubstitués et l’induction des centres stéréogènes vicinaux par une réduction radicalaire. Nous avons révélé que l’issue diastéréosélective de la réaction de cyclisation par une iodoéthérification était dictée par le groupement gamma-méthyle des esters alpha,beta-insaturés de départ. Nous avons ensuite démontré que les produits de la réaction radicalaire anti et syn pouvaient être obtenus sélectivement à partir d’un intermédiaire commun, respectivement en prenant appui sur l’effet exocyclique ou endocyclique lors de la réduction. Par une stratégie complémentaire, nous avons révélé que le précurseur radicalaire pouvait également être obtenu par une réaction de cycloéthérification en présence d’un énoxysilane tétrasubstitué. Une étude systématique des substituants du cycle a révélé que certaines relations stéréochimiques conduisaient à une perte de sélectivité au détriment du produit anti. La seconde section concerne l’étude DFT au niveau BHandHLYP/TZVP des intermédiaires radicalaires impliqués lors du transfert d’hydrogène. Par une étude de décomposition de l’énergie d’activation, nous avons été en mesure de rationaliser l’issue diastéréosélective de la réaction sur la base des énergies de distorsion (∆Ed‡) et d’interaction (∆Eint‡) requises pour accéder à la paire d’états de transition pro-anti et pro-syn. De plus, nous avons démontré qu’une analyse NBO permettait de relativiser l’impact des interactions stéréoélectroniques. Par la suite, l’évaluation des intermédiaires radicalaires borinates et aluminates nous a permis de révéler que l’encombrement stérique de la chaîne propionate était la cause principale de la formation sélective des produits anti ou syn lors d’une réduction en présence d’un acide de Lewis. La dernière section décrit l’élaboration de la séquence polypropionate de la zincophorine, et de ses isomères, à partir du fragment tétrahydropyrane substitué. Au cours de notre étude, nous avons identifié que le nombre de sites de chélation potentiels devait être limité à trois lors de l’aldolisation en condition Cram-chélate. De plus, nous avons démontré que les différents motifs acétates sont accessibles sélectivement par l’utilisation d’un énoxysilane encombré. Par ailleurs, nous avons révélé qu’une même séquence réactionnelle pouvait être employée pour la synthèse du fragment C17–C25 de son analogue naturel CP-78,545, et avons complété la plus récente synthèse totale du méthyl ester de la zincophorine.