Le vieillissement chronologique de Schizosaccharomyces pombe : Implication des voies de détection du glucose

La première augmentation de la longévité en laboratoire fût observée à la suite d’une intervention nutritionnelle consistant en une réduction de l’apport alimentaire chez le rat. Plus tard, ce phénomène a été reproduit dans de très nombreuses espèces et référé en tant que restriction calorique. Le développement des techniques de biologie moléculaire moderne a permis de montrer dans des organismes modèles simples que cette flexibilité du processus de vieillissement était régulée par des facteurs génétiques. De fait, plusieurs mécanismes cellulaires ont alors pu être identifiés comme responsables de ce contrôle du vieillissement. Ces voies de régulation ont révélées être conservées entre les espèces, depuis les levures jusqu’aux organismes multicellulaires tels que le nématode, la mouche ou la souris, suggérant l’existence d’un programme universel de vieillissement dans le vivant. La levure s’est avéré à plusieurs reprises être un modèle puissant et fiable pour la découverte de gènes impliqués dans ce phénomène. Mon étude a consisté au développement d’un nouveau modèle unicellulaire d’étude du vieillissement à travers l’espèce Schizosaccharomyces pombe appelée aussi levure à fission. La première étape de mon travail a montré que les voies de détection des nutriments gouvernées par la sérine/thréonine protéine kinase A (Pka1) et la sérine/thréonine kinase Sck2 contrôlent le vieillissement chronologique de ces cellules comme il était connu dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Ceci permit de valider l’utilisation de la levure à fission pour l’étude du vieillissement. Ensuite, nous avons analysé plus en détail l’effet pro-vieillissement du glucose en étudiant le rôle de sa détection par le récepteur membranaire Git3 couplé à la protéine G (Gpa2) en amont de la kinase Pka1. La perte du signal du glucose par la délétion de Git3 imite partiellement l’effet d’augmentation de longévité obtenu par baisse de la concentration en glucose dans le milieu. De plus, l’effet néfaste du signal du glucose est maintenu en absence de tout métabolisme du glucose suite à la mutation des hexokinases, premières enzymes de la glycolyse. L’ensemble de ces résultats suggèrent que la signalisation du glucose est prédominante sur son métabolisme pour son effet pro-vieillissement. D’autre part, à la fois la suppression de cette signalisation et la baisse de niveau de glucose disponible allongent la durée de vie en corrélation avec une augmentation de la résistance au stress, une hausse d’activité mitochondriale et une baisse de production de radicaux libres. Finalement, le criblage d’une banque de surexpression d’ADNc a permis d’identifier plusieurs gènes candidats responsables de ces effets en aval de la voie de signalisation Git3/PKA. La recherche sur les mécanismes moléculaires du vieillissement propose une nouvelle approche, un nouvel angle de vue, pour la compréhension des fonctions cellulaires et promet d’apporter de précieuses clefs pour mieux comprendre certaines maladies. En effet, le vieillissement est la première cause d’apparition de nombreuses affections comme les cancers, les maladies cardiovasculaires et métaboliques ou les maladies neurodégénératives tels que les syndromes d’Alzheimer et de Parkinson.

Endothelin-1 and H2O2-induced signaling in vascular smooth muscle cells : modulation by CaMKII and Nitric oxide

L’endothéline-1 (ET-1) est un peptide vasoactif extrêmement puissant qui possède une forte activité mitogénique dans les cellules du muscle lisse vasculaire (VSMCs). Il a été démontré que l’ET-1 est impliquée dans plusieurs maladies cardio-vasculaires, comme l’athérosclérose, l'hypertension, la resténose après l'angioplastie, l’insuffisance cardiaque et l'arythmie. L’ET-1 exerce ses effets via plusieurs voies de signalisation qui incluent le Ca2+, les protéines kinases activées par les mitogènes (MAPKs) y compris les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2) et la voie de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/protein kinase B (PKB). Plusieurs études ont démontré que les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) peuvent jouer un rôle important dans la signalisation d’ERK1/2 et de PKB induite par plusieurs facteurs de croissance et hormones. Nous avons précédemment montré que l'ET-1 produit des ROS qui agissent comme médiateur de la signalisation cellulaire induite par l’ET-1. Le peroxyde d’hydrogène (H2O2), une molécule qui appartient à la famille des ROS, peut activer les voies de la MAPK et de la PKB dans les VSMCs. Par ailleurs, nos résultats suggèrent également que le Ca2+ et la calmoduline (CaM) sont essentiels pour la phosphorylation d’ERK1/2, de p38 et de PKB induite par le H2O2 dans les VSMCs. La Ca2+/CaM-dependent protein kinases II (CaMKII) est une sérine/thréonine protéine kinase multifonctionnelle activée par le Ca2+/CaM. Il a été montré que la CaMKII est impliquée dans les voies de signalisation induite par le H2O2 dans les cellules endothéliales. Cependant, le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de la proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) induite par l’ET-1 et le H2O2, de même que son rôle dans l’effet hypertrophique et prolifératif de l’ET-1 dans les VSMCs demeure inexploré. Le monoxyde d’azote (NO) est une molécule vasoactive impliquée dans la régulation de plusieurs réponses hormonales. Le NO peut moduler la signalisation contrôlant la croissance cellulaire induite par plusieurs agonistes d’où son rôle protecteur dans le système vasculaire. Des études ont montré que le NO peut inhiber la voie de Ras/Raf/ERK1/2 et la voie de PKB induite par le facteur de croissance endothélial (EGF) et l’angiotensine II (Ang II). Beaucoup d’autres travaux ont mis en évidence un cross-talk entre les voies de signalisation activées par l’ET-1 et le NO. La capacité du NO à inhiber la signalisation intracellulaire induite par l’ET-1 dans les VSMCs demeure inconnue. Le travail présenté dans cette thèse vise à déterminer le rôle du système Ca2+-CaM-CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 et le H2O2 ainsi que son rôle dans la croissance et la prolifération cellulaire induites par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également testé le rôle du NO dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 ainsi que la synthèse protéique induite par l’ET-1. Dans la première partie de notre étude, nous avons examiné le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs en utilisant trois approches différentes i.e. l'usage d'inhibiteurs pharmacologiques, un peptide auto-inhibiteur de la CaMKII (CaMKII AIP) et la technique de siRNA. Nous avons démontré que la CaMKII est impliquée dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Des études précédentes ont montré à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques comme le KN-93 que l'Ang II et les agents induisant une augmentation de la concentration en Ca2+ intracellulaire comme l’ionomycine, provoquent la phosphorylation d’ERK1/2 via la CaM dans les VSMCs. Cependant, en utilisant différentes approches, nos études ont montré pour la première fois une implication de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également rapporté pour la première fois, un rôle crucial de la CaMKII dans la pathophysiologie vasculaire associée à l’ET-1 puisque l’activation de la CaMKII joue un rôle important dans l’hypertrophie et la croissance cellulaire. Dans la deuxième partie, à la lumière des études précédentes qui montraient que les ROS agissent comme médiateurs de la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs, nous avons examiné si la CaMKII est également impliquée dans l’activation des voies d’ERK1/2 et de PKB induite par le H2O2. En utilisant des approches pharmacologiques et moléculaires, nous avons montré, comme pour l’ET-1, que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par le H2O2. Nous avons précédemment montré que la transactivation du récepteur de type I de l’insulin-like growth factor (IGF-1R) est nécessaire à l’activation de PKB induite par le H2O2. Pour cette raison, nous avons examiné l'effet de l'inhibition de la CaMKII par l’inhibiteur pharmacologique ou par le knock-down de la CaMKII sur la phosphorylation d’IGF-1R induite par le H2O2. Les résultats démontrent que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et d’IGF-1R induite par le H2O2. Dans la troisième partie de notre étude, nous avons également examiné le mécanisme moléculaire par lequel le NO exerce ses effets anti-mitogéniques et anti-hypertrophiques dans la signalisation induite par l’ET-1. En testant l'effet de deux différents donneurs de NO (S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), sodium nitroprusside (SNP)) et un inhibiteur de NO synthase, le N (G)-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1, nous avons observé que le NO a un effet inhibiteur sur la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Par ailleurs, le 8-Br-GMPc, un analogue du GMPc, a un effet similaire à celui des deux donneurs du NO, tandis que l’oxadiazole quinoxaline (ODQ), un inhibiteur de la guanylate cyclase soluble, inverse l'effet inhibiteur du NO. Nous concluons que le NO diminue la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 d’une manière dépendante du GMPc. Le NO inhibe aussi les effets hypertrophiques de l’ET-1 puisque le traitement avec le SNAP diminue la synthèse des protéines induite par l’ET-1. En résumé, les études présentées dans cette thèse démontrent que l’ET-1 et le H2O2 sont des activateurs de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 dans les VSMCs et que la CaMKII s’avère nécessaire pour ce processus, en agissant en amont de l’activation de IGF-1R induite par le H2O2 dans les VSMCs. Elles montrent également que le NO inhibe la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1. Enfin, nos travaux suggèrent aussi que l’activation de la CaMKII stimule la synthèse des protéines et de l’ADN induites par l’ET-1 alors que le NO inhibe la synthèse des protéines induite par ET-1. Mots clés: Endothéline ; Peroxyde d'hydrogène ; CaMKII ; Monoxyde d’azote ; Système vasculaire ; PKB; ERK1/2; IGF-1R; Hypertrophie.

Études du remodelage vasculaire utérin durant la grossesse : caractérisation du rôle de l’œstrogène et de son action vasorelaxante

La grossesse est un état physiologique particulier où de nombreux changements fonctionnels et structuraux surviennent. Chez la rate, pour répondre aux besoins grandissants du fœtus, l’artère utérine se développe pour atteindre le double de son diamètre original avant parturition. Par conséquent, le débit sanguin utérin augmente d’environ vingt fois. Pour ce faire, les vaisseaux utérins sont l’objet d’un remodelage caractérisé par une hypertrophie et une hyperplasie des différentes composantes de la paroi. De plus, ce remodelage est complètement réversible après la parturition, par opposition au remodelage vasculaire « pathologique » qui affecte les artères systémiques, dans l’hypertension chronique, par exemple. La grossesse s’accompagne aussi de modifications hormonales importantes, comme les œstrogènes dont la concentration s’accroît progressivement au cours de cette période. Elle atteindra une concentration trois cents fois plus élevée avant terme que chez une femme non gravide. Cette hormone possède de multiples fonctions, ainsi qu’un mode d’action à la fois génomique et non génomique. Considérant l’ensemble de ces éléments, nous avons formulé l’hypothèse que l’œstradiol serait responsable de modifier la circulation utérine durant la grossesse, par son action vasorelaxante, mais aussi en influençant le remodelage de la vasculature utérine. Nous avons montré que le 17β-Estradiol (17β-E2) produit une relaxation due à un effet non génomique des artères utérines en agissant directement sur le muscle lisse par un mécanisme indépendant du monoxyde d’azote et des récepteurs classiques aux œstrogènes (ERα, ERβ). De plus, la relaxation induite par le 17β-E2 dans l’artère utérine durant la gestation est réduite par rapport à celle des artères des rates non gestantes. Ceci serait attribuable à une diminution de monoxyde d’azote provenant de la synthase de NO neuronale dans les muscles lisses des artères utérines. Nos résultats démontrent que le récepteur à l’œstrogène couplé aux protéines G (GPER), la protéine kinase A (PKA) et la protéine kinase G (PKG) ne sont pas impliqués dans la signalisation intracellulaire associée à l’effet vasorelaxant induit par le 17β-E2. Cependant, nous avons montré une implication probable des canaux potassiques sensibles au voltage, ainsi qu’un rôle possible des canaux potassiques de grande conductance activés par le potentiel et le calcium (BKCa). En effet, le penitrem A, un antagoniste présumé des canaux potassiques à grande conductance, réduit la réponse vasoralaxante du 17β-E2. Toutefois, une autre action du penitrem A n’est pas exclue, car l’ibériotoxine, reconnue pour inhiber les mêmes canaux, n’a pas d’effet sur cette relaxation. Quoi qu’il en soit, d’autres études sont nécessaires pour obtenir une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la relaxation non génomique sur le muscle lisse des artères utérines. Quant à l’implication de l’œstrogène sur le remodelage des artères utérines durant la gestation, nous avons tenté d’inhiber la synthèse d’œstrogènes durant la gestation en utilisant un inhibiteur de l’aromatase. Plusieurs paramètres ont été évalués (paramètres sanguins, réactivité vasculaire, pression artérielle) sans changements significatifs entre le groupe contrôle et celui traité avec l’inhibiteur. Le même constat a été fait pour le dosage plasmatique de l’œstradiol, ce qui suggère l’inefficacité du blocage de l’aromatase dans ces expériences. Ainsi, notre protocole expérimental n’a pas réussi à inhiber la synthèse d’œstrogène durant la grossesse chez le rat et, ce faisant, nous n’avons pas pu vérifier notre hypothèse. En conclusion, nous avons démontré que le 17β-E2 agit de façon non génomique sur les muscles lisses des artères utérines qui implique une action sur les canaux potassiques de la membrane cellulaire. Toutefois, notre protocole expérimental n’a pas été en mesure d’évaluer les effets génomiques associés au remodelage vasculaire utérin durant la gestation et d’autres études devront être effectuées.

Modulation of Endothelin-1 and Insulin-like Growth Factor Type 1-induced Signaling by Curcumin in A-10 Vascular Smooth Muscle Cells

Les maladies cardio-vasculaires (MCV), telles que l’hypertension et l’athérosclérose, s’accompagnent de modifications structurales et fonctionnelles au niveau vasculaire. Un fonctionnement aberrant de la migration, l’hypertrophie et la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sont des évènements cellulaires à l’origine de ces changements. L’endothéline-1 (ET-1) contribue à la pathogénèse des anomalies vasculaires, notamment via l’activation des protéines MAPK et PI3-K/PKB, des composantes clés impliquées dans les voies prolifératives et de croissance cellulaires. Il a été suggéré que le stress oxydant jouerait un rôle intermédiaire dans les effets pathophysiologiques vasculaires de l’ET-1. En conséquence, une modulation de la signalisation induite par l’ET-1 peut servir comme éventuelle stratégie thérapeutique contre le développement des MCV. Il apparaît de nos jours un regain d’intérêt dans l’utilisation des agents phyto-chimiques pour traiter plusieurs maladies. La curcumine, constituant essentiel de l’épice curcuma, est dotée de plusieurs propriétés biologiques parmi lesquelles des propriétés anti-oxydantes, anti-prolifératrices et cardio-protectrices. Cependant, les mécanismes moléculaires de son effet cardio-protecteur demeurent obscurs. Dans cette optique, l’objectif de cette étude a été d’examiner l’efficacité de la curcumine à inhiber la signalisation induite par l’ET-1 dans les CMLV. La curcumine a inhibé la phosphorylation des protéines IGF-1R, PKB, c-Raf et ERK1/2, induite par l’ET-1 et l’IGF-1. De plus, la curcumine a inhibé l’expression du facteur de transcription Egr-1 induite par l’ET-1 et l’IGF-1, dans les CMLV. Ces résultats suggèrent que la capacité de la curcumine à atténuer ces voies de signalisation serait un mécanisme d’action potentiel de ses effets protecteurs au niveau cardiovasculaire.

Rôle de l’enzyme PAS kinase dans la régulation du facteur de transcription PDX-1 dans la cellule bêta pancréatique.

Le diabète de type 2 (DT2) se caractérise par une production insuffisante d'insuline par le pancréas ainsi qu'une résistance des tissus périphériques à l'action de l'insuline. Dans les cellules bêta pancréatiques, le glucose stimule la production de l'insuline en induisant la transcription de son gène et la traduction ainsi que la sécrétion de sa protéine. Paradoxalement, une exposition prolongée et simultanée de ces cellules à de hautes concentrations de glucose en présence d'acides gras conduit à la détérioration de la fonction bêta pancréatique et au développement du DT2. Toutefois, les mécanismes moléculaires responsables de ces effets du glucose ne sont que partiellement connus. L'objectif du travail décrit dans cette thèse est d'identifier les mécanismes responsables de la régulation de la transcription du gène de l'insuline. PDX-1 (de l’anglais pour pancreatic and duodenal homeobox 1) est un facteur de transcription majeur et essentiel tant pour le développement du pancréas que pour le maintien de sa fonction à l'état adulte. En réponse au glucose, PDX-1 se lie au promoteur du gène de l'insuline et induit sa transcription. Ceci est inhibé par l'acide gras palmitate. Dans la première partie des travaux effectués dans le cadre de cette thèse, nous avons identifié deux mécanismes de régulation de la transcription du gène de l'insuline: le premier via ERK1/2 (de l'anglais pour extracellular-signal-regulated protein kinases 1 and 2) et le second par l’enzyme PASK (pour per-arnt-sim kinase). Nous avons également mis en évidence l'existence d'un troisième mécanisme impliquant l'inhibition de l'expression du facteur de transcription MafA par le palmitate. Nos travaux indiquent que la contribution de la signalisation via PASK est majeure. L'expression de PASK est augmentée par le glucose et inhibée par le palmitate. Sa surexpression dans les cellules MIN6 et les îlots isolés de rats, mime les effets du glucose sur l'expression du gène de l'insuline ainsi que sur l'expression de PDX-1 et prévient les effets délétères du palmitate. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons identifié un nouveau mécanisme par lequel PASK augmente la stabilité protéique de PDX-1, soit via la phosphorylation et l'inactivation de la protéine kinase GSK3 bêta (de l'anglais pour glycogen synthase kinase 3 beta). Le glucose induit la translocation de PDX-1 du cytoplasme vers le noyau, ce qui est essentiel à sa liaison au promoteur de ses gènes cibles. L'exclusion nucléaire de PDX-1 a été observée dans plusieurs modèles ex vivo et in vivo de dysfonction de la cellule bêta pancréatique. Dans le dernier volet de cette thèse, nous avons démontré l'importance de l'utilisation de cellules primaires (îlots isolés et dispersés) pour étudier la translocation nucléaire de PDX-1 endogène étant donné que ce mode de régulation est absent dans les lignées insulino-sécrétrices MIN6 et HIT-T15. Ces études nous ont permis d'identifier et de mieux comprendre les mécanismes régulant la transcription du gène de l'insuline via le facteur de transcription PDX-1. Les cibles moléculaires ainsi identifiées pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement du diabète de type 2. Mots-clés : Diabète, îlots de Langerhans, cellule bêta pancréatique, gène de l'insuline, PDX-1, PASK, GSK3 bêta, ERK1/2, PKB, glucose, palmitate.