Étude de la résistance aux antibiotiques des entérocoques d'origine animale du Québec

Les entérocoques font partie de la flore normale intestinale des animaux et des humains. Plusieurs études ont démontré que les entérocoques d’origine animale pouvaient représenter un réservoir de gènes de résistance aux antibiotiques pour la communauté humaine et animale. Les espèces Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium sont importantes en santé publique; elles sont responsables d’environ 12% de toutes les infections nosocomiales aux États-Unis. Au Canada, les cas de colonisation et/ou d’infections à entérocoques résistants à la vancomycine ont plus que triplé de 2005 à 2009. Un total de 387 isolats E. faecalis et E. faecium aviaires, et 124 isolats E. faecalis porcins ont été identifiés et analysés pour leur susceptibilité aux antibiotiques. De hauts pourcentages de résistance envers les macrolides et les tétracyclines ont été observés tant chez les isolats aviaires que porcins. Deux profils phénotypiques prédominants ont été déterminés et analysés par PCR et séquençage pour la présence de gènes de résistance aux antibiotiques. Différentes combinaisons de gènes de résistance ont été identifiées dont erm(B) et tet(M) étant les plus prévalents. Des extractions plasmidiques et des analyses par hybridation ont permis de déterminer, pour la première fois, la colocalisation des gènes erm(B) et tet(M) sur un plasmide d’environ 9 kb chez des isolats E. faecalis porcins, et des gènes erm(B) et tet(O) sur un plasmide de faible poids moléculaire d’environ 11 kb chez des isolats E. faecalis aviaires. De plus, nous avons démontré, grâce à des essais conjugatifs, que ces plasmides pouvaient être transférés. Les résultats ont révélé que les entérocoques intestinaux aviaires et porcins, lesquels peuvent contaminer la viande à l’abattoir, pouvaient représenter un réservoir de gènes de résistance envers la quinupristine-dalfopristine, la bacitracine, la tétracycline et les macrolides. Afin d’évaluer l’utilisation d’un antisérum polyclonal SA dans l’interférence de la résistance à de fortes concentrations de bacitracine (gènes bcrRAB), lors d’un transfert conjugatif répondant aux phéromones, un isolat multirésistant E. faecalis aviaire a été sélectionné. Après induction avec des phéromones produites par la souche réceptrice E. faecalis JH2-2, l’agrégation de la souche donatrice E. faecalis 543 a été observée ainsi que des fréquences de transfert élevées en bouillon lors d’une courte période de conjugaison. Le transfert conjugatif des gènes asa1, traB et bcrRAB ainsi que leur colocalisation a été démontré chez le donneur et un transconjugant T543-1 sur un plasmide de 115 kb par électrophorèse à champs pulsé (PFGE) et hybridation. Une CMI de > 2 048 µg/ml envers la bacitracine a été obtenue tant chez le donneur que le transconjuguant tandis que la souche réceptrice JH2-2 démontrait une CMI de 32 µg/ml. Le séquençage des gènes asa1, codant pour la substance agrégative, et traB, une protéine régulant négativement la réponse aux phéromones, a révélé une association de cet élément génétique avec le plasmide pJM01. De plus, cette étude présente qu’un antisérum polyclonal SA peut interférer significativement dans le transfert horizontal d’un plasmide répondant aux phéromones codant pour de la résistance à de fortes doses de bacitracine d’une souche E. faecalis aviaire multirésistante. Des isolats cliniques E. faecium d’origine humaine et canine ont été analysés et comparés. Cette étude rapporte, pour la première fois, la caractérisation d’isolats cliniques E. faecium résistants à l’ampicilline (EFRA) d’origine canine associés à CC17 (ST17) au Canada. Ces isolats étaient résistants à la ciprofloxacine et à la lincomycine. Leur résistance envers la ciprofloxacine a été confirmée par la présence de substitutions dans la séquence en acides aminés des gènes de l’ADN gyrase (gyrA/gyrB) et de la topoisomérase IV (parC/parE). Des résistances élevées envers la gentamicine, la kanamycine et la streptomycine, et de la résistance envers les macrolides et les lincosamides a également été observées. La fréquence de résistance envers la tétracycline était élevée tandis que celle envers la vancomycine n’a pas été détectée. De plus, aucune résistance n’a été observée envers le linézolide et la quinupristine-dalfopristine. Les données ont démontré une absence complète des gènes esp (protéine de surface des entérocoques) et hyl (hyaluronidase) chez les isolats canins EFRA testés tandis qu’ils possédaient tous le gène acm (adhésine de liaison au collagène d’E. faecium). Aucune activité reliée à la formation de biofilm ou la présence d’éléments CRISPR (loci de courtes répétitions palindromiques à interespaces réguliers) n’a été identifiée chez les isolats canins EFRA. Les familles de plasmide rep6 and rep11 ont significativement été associées aux isolats d’origine canine. Les profils PFGE des isolats d’origine humaine et canine n'ont révélé aucune relation (≤ 80%). Ces résultats illustrent l'importance d'une utilisation judicieuse des antibiotiques en médecine vétérinaire afin d’éviter la dissémination zoonotique des isolats EFRA canins. Nous pensons que ces résultats contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes de résistance aux antibiotiques et de leurs éléments mobiles ainsi qu’à de nouvelles stratégies afin de réduire le transfert horizontal de la résistance aux antibiotiques et des facteurs de virulence.

Étude dans la cellule bêta pancréatique de voies inhibitrices de la sécrétion d'insuline liées au métabolisme des lipides

Le diabète de type 2 (DT2) est une maladie métabolique complexe causée par des facteurs génétiques mais aussi environnementaux, tels la sédentarité et le surpoids. La dysfonction de la cellule β pancréatique est maintenant reconnue comme l’élément déterminant dans le développement du DT2. Notre laboratoire s’intéresse à la sécrétion d’insuline par la cellule β en réponse aux nutriments calorigéniques et aux mécanismes qui la contrôle. Alors que la connaissance des mécanismes responsables de l’induction de la sécrétion d’insuline en réponse aux glucose et acides gras est assez avancée, les procédés d’inhibition de la sécrétion dans des contextes normaux ou pathologiques sont moins bien compris. L’objectif de la présente thèse était d’identifier quelques-uns de ces mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique, et ce en situation normale ou pathologique en lien avec le DT2. La première hypothèse testée était que l’enzyme mitochondriale hydroxyacyl-CoA déshydrogénase spécifique pour les molécules à chaîne courte (short-chain hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, SCHAD) régule la sécrétion d’insuline induite par le glucose (SIIG) par la modulation des concentrations d’acides gras ou leur dérivés tels les acyl-CoA ou acyl-carnitine dans la cellule β. Pour ce faire, nous avons utilisé la technologie des ARN interférants (ARNi) afin de diminuer l’expression de SCHAD dans la lignée cellulaire β pancréatique INS832/13. Nous avons par la suite vérifié chez la souris DIO (diet-induced obesity) si une exposition prolongée à une diète riche en gras activerait certaines voies métaboliques et signalétiques assurant une régulation négative de la sécrétion d’insuline et contribuerait au développement du DT2. Pour ce faire, nous avons mesuré la SIIG, le métabolisme intracellulaire des lipides, la fonction mitochondriale et l’activation de certaines voies signalétiques dans les îlots de Langerhans isolés des souris normales (ND, normal diet) ou nourries à la dière riche en gras (DIO) Nos résultats suggèrent que l’enzyme SCHAD est importante dans l’atténuation de la sécrétion d’insuline induite par le glucose et les acides aminés. En effet, l’oxydation des acides gras par la protéine SCHAD préviendrait l’accumulation d’acyl-CoA ou de leurs dérivés carnitine à chaîne courtes potentialisatrices de la sécrétion d’insuline. De plus, SCHAD régule le métabolisme du glutamate par l’inhibition allostérique de l’enzyme glutamate déshydrogénase (GDH), prévenant ainsi une hyperinsulinémie causée par une sur-activité de GDH. L’étude de la dysfonction de la cellule β dans le modèle de souris DIO a démontré qu’il existe une grande hétérogénéité dans l’obésité et l’hyperglycémie développées suite à la diète riche en gras. L’orginialité de notre étude réside dans la stratification des souris DIO en deux groupes : les faibles et forts répondants à la diète (low diet responders (LDR) et high diet responder (HDR)) sur la base de leur gain de poids corporel. Nous avons mis en lumières divers mécanismes liés au métabolisme des acides gras impliqués dans la diminution de la SIIG. Une diminution du flux à travers le cycle TG/FFA accompagnée d’une augmentation de l’oxydation des acides gras et d’une accumulation intracellulaire de cholestérol contribuent à la diminution de la SIIG chez les souris DIO-HDR. De plus, l’altération de la signalisation par les voies AMPK (AMP-activated protein kinase) et PKC epsilon (protéine kinase C epsilon) pourrait expliquer certaines de ces modifications du métabolisme des îlots DIO et causer le défaut de sécrétion d’insuline. En résumé, nous avons mis en lumière des mécanismes importants pour la régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique saine ou en situation pathologique. Ces mécanismes pourraient permettre d’une part de limiter l’amplitude ou la durée de la sécrétion d’insuline suite à un repas chez la cellule saine, et d’autre part de préserver la fonction de la cellule β en retardant l’épuisement de celle-ci en situation pathologique. Certaines de ces voies peuvent expliquer l’altération de la sécrétion d’insuline dans le cadre du DT2 lié à l’obésité. À la lumière de nos recherches, le développement de thérapies ayant pour cible les mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline pourrait être bénéfique pour le traitement de patients diabétiques.

Impact de l’expression de l’isoforme p35 de la chaîne invariante humaine chez des souris déficientes en CD74 endogène

La chaîne invariante (Ii ; CD74) est une protéine membranaire de type II qui joue un rôle majeur dans la présentation antigénique. Dans le réticulum endoplasmique (RE), Ii favorise l’assemblage du CMH II et prévient la liaison indésirable de polypeptides. Grâce à son motif di-leucine, la chaîne invariante cible le CMH II dans les endosomes. Une fois dans ces compartiments acides, Ii est dégradé, permettant la liaison de peptides de forte affinité qui seront ensuite présentés aux cellules T CD4+. Chez les souris déficientes en Ii murin (mIi), le CMH II présente une conformation non compacte typique des molécules vides ou liées faiblement à un peptide. Le transport du CMH II est aberrant ce qui conduit à une réduction de son expression en surface ainsi qu’à un défaut de présentation antigénique. De plus, Ii diversifie le répertoire de peptides et assure la sélection thymique des cellules T CD4+. Enfin, il a un rôle dans la maturation des cellules B et les souris déficientes en Ii présentent des nombres réduits de cellules B matures folliculaires (FO). L’isoforme mineure humaine p35 (Iip35) n’existe pas chez la souris et possède une extension cytoplasmique de 16 acides aminés contenant un motif R-x-R de rétention dans le RE. La sortie du RE est conditionnelle à la liaison du CMH II qui permet de masquer le motif de rétention. Iip35 agit comme dominant et impose la rétention aux autres isoformes d’Ii. Cependant, le rôle physiologique du motif R-x-R et, plus globalement, celui d’Iip35, demeurent nébuleux. Pour mieux cerner la fonction d’Iip35, nous avons généré des souris transgéniques (Tg) exprimant l’isoforme humaine Iip35 et avons analysé la conformation et le trafic du CMH II, la sélection thymique et la maturation des cellules B ainsi que la présentation antigénique. Nos résultats ont démontré qu’Iip35 favorise l’assemblage du CMH II dans le RE. Il induit également une conformation compacte du CMH II et augmente l’expression du CMH II en surface. De plus, Iip35 cible le CMH II dans les endosomes où un peptide de forte affinité se lie dans la niche peptidique. Par ailleurs, Iip35 diversifie le répertoire de peptides et rétablit totalement la sélection des cellules T CD4+ ainsi que le niveau d’expression du TCR de ces dernières. Iip35 restaure également la présentation antigénique de l’ovalbumine dont la présentation requiert l’expression d’Ii. Par contre, Iip35 rétablit la présentation des superantigènes mais à un niveau moindre que celui des souris sauvages. Ensuite, Iip35 permet le rétablissement de la sélection des cellules iNKT démontrant qu’il assiste la présentation des lipides par les molécules CD1d. Enfin, les résultats ont démontré qu’Iip35 restaure le développement des cellules B matures folliculaires (FO) mais pas celui des cellules B de la zone marginale. Ceci suggère qu’Iip35 est capable d’induire le développement des cellules FO sans stimulation préalable par le MIF (macrophage migration inhibitory factor). Ainsi, l’ensemble de ces résultats démontre qu’Iip35 est fonctionnel et assure la majorité des fonctions d’Ii. Cependant, Iip35 ne remplace pas mIi endogène concernant la maturation des cellules B MZ suggérant qu’il pourrait avoir un rôle de régulateur.

Étude de la dynamique des interactions des constituants du complexe de biosynthèse et d’insertion de la sélénocystéine dans la traduction des sélénoprotéines in vivo

Les sélénoprotéines sont des protéines auxquelles des sélénocystéines, soit le 21e acide aminé, sont incorporées durant leur traduction. Plus précisément, la sélénocystéine (Sec) est un dérivé métabolique de la sérine, mais structurellement équivalent à une cystéine dont on a remplacé l'atome de soufre par du sélénium. Elle se distingue des autres acides aminés puisqu’elle possède sa propre synthétase qui sert à convertir la sérine en Sec alors que le résidu est déjà fixé à l’ARNt. La position d’une Sec sur l’ARNm est indiquée par le codon UGA étant habituellement un signal STOP introduisant le concept de recoding. Grâce à une machinerie métabolique spécifique à l'ARNtSec et à la présence d’un SecIS (Selenocystein Insertion Sequence) sur l’ARNm, ce codon permet la présence d'une Sec dans la protéine. Il est connu que la synthèse débute avec l’acétylation de l’ARNt[Ser]Sec par la seryl-ARNt synthétase (SerRS) afin de donner la seryl-ARNt[Ser]Sec. Cette dernière est subséquemment phosphorylée par l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec kinase (PSTK) qui donnera l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec. Par la suite, un complexe de plusieurs protéines et cofacteurs, agissant comme machinerie pour l’incorporation des Sec durant la traduction, s’associe avec l’ARNt[Ser]Sec puis l’ARNm et, finalement, les composantes du ribosome. Parmi ces protéines, SepSecS catalyse l’étape finale de la synthèse des Sec en convertissant le O-phosphoseryl-ARNt[Ser]Sec en selenocysteinyl-ARNt[Ser]Sec utilisant le sélénophosphate comme source de sélénium. Des études récentes montrent que l’association avec SECp43 serait nécessaire pour que SepSecS joue son rôle et soit ségrégée au noyau pour s’associer à la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines, soit le complexe moléculaire qui reconnaît le codon UGA. Parmi les protéines de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines que nous avons analysées, il y a eEFSec, RPL30, SPS2, SPS1, SBP2 et NSEP1. Nos résultats d’analyse de la dynamique de l’interaction entre les constituants de la machinerie de biosynthèse et d’incorporation des Sec, confirment plusieurs données de la littérature, mais remettent en question le modèle jusqu’à maintenant établi. Une meilleure compréhension de la dynamique des interactions entre ses constituants et la régulation de cette dynamique permet d’émettre des hypothèses quant au rôle de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines et de l’importance de sa complexité. Nous avons analysé les interactions in vivo dans des cellules HEK293T au moyen de la technique de Protein-Fragment Complementation Assay (PCA) en couplant, par un clonage moléculaire, les gènes de chacune des protéines d’intérêt avec des fragments des gènes de la protéine luciférase (hRluc). Nous avons ainsi réalisé une fusion en N-terminal et en C-terminal des fragments de luciférase pour chacune des protéines d’intérêt. Puis, nous avons analysé la dynamique des interactions avec les composantes de la machinerie de biosynthèse des Sec. D’autres travaux seront essentiels afin de bâtir sur les résultats présentés dans cette recherche.

Impact d'un repas méditerranéen complet sur les fonctions métaboliques et endothéliales postprandiales en comparaison à un repas riche en acides gras saturés chez des hommes sains.

Contexte L’américanisation des habitudes de vie, notamment de l’alimentation, semble être en grande partie responsable de l’augmentation incessante de l’incidence élevée des maladies cardiovasculaires. La période postprandiale, où l’homéostasie vasculaire et métabolique est mise à l’épreuve, est d’une importance considérable dans le développement ou la prévention de l’athérosclérose et représente maintenant la majeure partie du temps d’éveil. La compréhension de l’influence de la composition d’un repas sur son impact postprandial est donc essentielle dans notre lutte dans la prévention de ces maladies. Objectifs L’objectif principal de ce projet de recherche était d’étudier les réponses endothéliale et métabolique à un repas de type méditerranéen mixte (MMM), puisqu’elles sont inconnues. Ce projet avait aussi pour objectifs d’évaluer l’impact microvasculaire d’un tel repas et de caractériser la composition postprandiale des acides gras plasmatiques. À titre comparatif, ces éléments ont aussi été étudiés suite à un repas riche en gras saturés (HSFAM). Méthodes Vingt-huit (28) hommes sains, exempts de facteurs de risque de maladies cardiovasculaires ont reçu de façon randomisée les deux repas à l’étude. Le MMM, composé de saumon frais et de légumes cuits dans l'huile d'olive, contenait 7.87g de SFA et 2.29g d’acides gras polyinsaturés oméga-3, tandis que le HSFAM, composé d'un sandwich déjeuner avec œuf, saucisse et fromage, contenait 14.78g de SFA. Les mesures de la fonction endothéliale mesurée par échographie brachiale (FMD), de la fonction microvasculaire mesurée par spectroscopie proche de l’infrarouge (NIRS) et de la composition des acides gras plasmatique ont été effectuées à jeun et en période postprandiale. Résultats Deux sous-groupes de répondeurs aux repas à l’étude se sont dégagés de ces travaux. Un premier sous-groupe de sujets ayant une triglycéridémie à jeun élevée, mais normale (hnTG) a démontré des altérations endothéliales seulement suivant le repas HSFAM. Un second sous-groupe de sujets ayant une triglycéridémie plus faible et normale (lnTG) n’a quant à lui pas subi d’altérations endothéliales suivant les deux repas à l’étude. Les sujets hnTG ont aussi démontré une charge triglycéridémique postprandiale (iAUC) plus importante et qui était de surcroît enrichie en acide stéarique suivant la HSFAM et en acide gras polyinsaturés oméga-3 suivant le MMM. L’évaluation par NIRS de la fonction microvasculaire nous révèle un ralentissement de la réoxygénation post-ischémique qui suggère une altération postprandiale du recrutement capillaire chez les sujets hnTG seulement. De telles altérations, qui semblent être plus importantes suivant le HSFAM, pourraient être en partie responsables de l’impact endothélial de ce repas. Conclusions Cet essai clinique démontre donc de façon novatrice qu’un repas MMM n’a pas d’effet endothélial délétère et que cette neutralité est indépendante de la triglycéridémie à jeun. De plus, une triglycéridémie à jeun élevée mais normale semble indiquer des dysfonctions endothéliales et métaboliques à des épreuves nutritionnelles tel un repas HSFAM. La consommation de repas méditerranéens par des individus sains à la triglycéridémie marginale serait bénéfique, peut-être même davantage que pour des individus de triglycéridémie plus faible, dans la prévention de l’athérogénèse et des maladies cardiovasculaires.

L’étude des stratégies de séparations préparatrices de protéines par électrophorèse capillaire

La protéomique est un sujet d'intérêt puisque l'étude des fonctions et des structures de protéines est essentiel à la compréhension du fonctionnement d'un organisme donné. Ce projet se situe dans la catégorie des études structurales, ou plus précisément, la séquence primaire en acides aminés pour l’identification d’une protéine. La détermination des protéines commence par l'extraction d'un mélange protéique issu d'un tissu ou d'un fluide biologique pouvant contenir plus de 1000 protéines différentes. Ensuite, des techniques analytiques comme l’électrophorèse en gel polyacrylamide en deux dimensions (2D-SDS-PAGE), qui visent à séparer ce mélange en fonction du point isoélectrique et de la masse molaire des protéines, sont utilisées pour isoler les protéines et pour permettre leur identification par chromatographie liquide and spectrométrie de masse (MS), typiquement. Ce projet s'inspire de ce processus et propose que l'étape de fractionnement de l'extrait protéique avec la 2D-SDS-PAGE soit remplacé ou supporté par de multiples fractionnements en parallèle par électrophorèse capillaire (CE) quasi-multidimensionnelle. Les fractions obtenues, contenant une protéine seule ou un mélange de protéines moins complexe que l’extrait du départ, pourraient ensuite être soumises à des identifications de protéines par cartographie peptidique et cartographie protéique à l’aide des techniques de séparations analytiques et de la MS. Pour obtenir la carte peptidique d'un échantillon, il est nécessaire de procéder à la protéolyse enzymatique ou chimique des protéines purifiées et de séparer les fragments peptidiques issus de cette digestion. Les cartes peptidiques ainsi générées peuvent ensuite être comparées à des échantillons témoins ou les masses exactes des peptides enzymatiques sont soumises à des moteurs de recherche comme MASCOT™, ce qui permet l’identification des protéines en interrogeant les bases de données génomiques. Les avantages exploitables de la CE, par rapport à la 2D-SDS-PAGE, sont sa haute efficacité de séparation, sa rapidité d'analyse et sa facilité d'automatisation. L’un des défis à surmonter est la faible quantité de masse de protéines disponible après analyses en CE, due partiellement à l'adsorption des protéines sur la paroi du capillaire, mais due majoritairement au faible volume d'échantillon en CE. Pour augmenter ce volume, un capillaire de 75 µm était utilisé. Aussi, le volume de la fraction collectée était diminué de 1000 à 100 µL et les fractions étaient accumulées 10 fois; c’est-à-dire que 10 produits de séparations étaient contenu dans chaque fraction. D'un autre côté, l'adsorption de protéines se traduit par la variation de l'aire d'un pic et du temps de migration d'une protéine donnée ce qui influence la reproductibilité de la séparation, un aspect très important puisque 10 séparations cumulatives sont nécessaires pour la collecte de fractions. De nombreuses approches existent pour diminuer ce problème (e.g. les extrêmes de pH de l’électrolyte de fond, les revêtements dynamique ou permanent du capillaire, etc.), mais dans ce mémoire, les études de revêtement portaient sur le bromure de N,N-didodecyl-N,N-dimethylammonium (DDAB), un surfactant qui forme un revêtement semi-permanent sur la paroi du capillaire. La grande majorité du mémoire visait à obtenir une séparation reproductible d'un mélange protéique standard préparé en laboratoire (contenant l’albumine de sérum de bovin, l'anhydrase carbonique, l’α-lactalbumine et la β-lactoglobulin) par CE avec le revêtement DDAB. Les études portées sur le revêtement montraient qu'il était nécessaire de régénérer le revêtement entre chaque injection du mélange de protéines dans les conditions étudiées : la collecte de 5 fractions de 6 min chacune à travers une séparation de 30 min, suivant le processus de régénération du DDAB, et tout ça répété 10 fois. Cependant, l’analyse en CE-UV et en HPLC-MS des fractions collectées ne montraient pas les protéines attendues puisqu'elles semblaient être en-dessous de la limite de détection. De plus, une analyse en MS montrait que le DDAB s’accumule dans les fractions collectées dû à sa désorption de la paroi du capillaire. Pour confirmer que les efforts pour recueillir une quantité de masse de protéine étaient suffisants, la méthode de CE avec détection par fluorescence induite par laser (CE-LIF) était utilisée pour séparer et collecter la protéine, albumine marquée de fluorescéine isothiocyanate (FITC), sans l'utilisation du revêtement DDAB. Ces analyses montraient que l'albumine-FITC était, en fait, présente dans la fraction collecté. La cartographie peptidique a été ensuite réalisée avec succès en employant l’enzyme chymotrypsine pour la digestion et CE-LIF pour obtenir la carte peptidique.

Développement de matériaux à base de protéines extraites du byssus de la moule bleue Mytilus edulis

Le byssus est un amas de fibres que les moules produisent afin de s’ancrer aux surfaces immergées sous l’eau. Ces fibres sont pourvues de propriétés mécaniques impressionnantes combinant rigidité, élasticité et ténacité élevées. De plus, elles possèdent un comportement d’auto-guérison de leurs propriétés mécaniques en fonction du temps lorsque la contrainte initialement appliquée est retirée. Les propriétés mécaniques de ces fibres sont le résultat de l’agencement hiérarchique de protéines de type copolymère blocs riches en collagène et de la présence de métaux formant des liens sacrificiels réversibles avec certains acides aminés comme les DOPA et les histidines. Bien que cette fibre soit très intéressante pour la production de matériaux grâce à son contenu élevé en collagène potentiellement biocompatible, cette ressource naturelle est traitée comme un déchet par les mytiliculteurs. L’objectif de cette thèse était de valoriser cette fibre en extrayant les protéines pour générer une nouvelle classe de matériaux biomimétiques. Un hydrolysat de protéines de byssus (BPH) riche en acides aminés chargés, i.e. ~30 % mol, et permettant de former des films a pu être généré. Lorsque solubilisé à pH 10.5, le BPH forme un hydrogel contenant des structures en triple hélice de collagène et des feuillets β anti-parallèles intra- et inter-moléculaires. Suite à l’évaporation de l’eau, le film de BPH résultant est insoluble en milieu aqueux à cause des structures secondaires très stables agissant comme points de réticulation effectifs. Les propriétés mécaniques des films de BPH sont modulables en fonction du pH. Au point isoélectrique (pI = 4.5), les interactions électrostatiques entre les charges opposées agissent comme points de réticulation et augmentent la rigidité des films et leur contrainte à la rupture sans affecter la déformation à la rupture. À pH plus élevé ou plus bas que le pI, les performances mécaniques des films sont plus faibles à cause de la répulsion entre les groupements fonctionnels de même charge qui interagissent plutôt avec les molécules d’eau et causent le gonflement de la matrice protéique des films. Le BPH contenant un nombre élevé d’acides aminés chargés et réactifs, nous avons pu réticuler les films de manière covalente à l’aide d’EDC ou de glutaraldéhyde. Les propriétés mécaniques des films sont modulables en fonction de la concentration d’EDC utilisée lors de la réticulation ou en employant du glutaraldéhyde comme agent réticulant. Les films sont à la fois plus rigides et plus forts avec un degré de réticulation élevé, mais perdent leur extensibilité à mesure que les segments libres de s’étirer lors d’une traction deviennent entravés par les points de réticulation. La réticulation augmente également la résistance à la dégradation enzymatique par la collagénase, les films les plus fortement réticulés lui étant pratiquement insensibles. La spectroscopie infrarouge montre enfin que la réticulation entraîne une transition de feuillets β anti-parallèles inter-moléculaires vers des structures de type hélices de collagène/PPII hydratées. Des liens sacrificiels ont été formés dans les films de BPH par traitement au pI et/ou avec différents métaux, i.e. Na+, Ca2+, Fe3+, afin de moduler les propriétés mécaniques statiques et d’évaluer le rôle de ces traitements sur le comportement d’auto-guérison lors de tests mécaniques cycliques avec différents temps de repos. Plus la valence des ions métalliques ajoutés augmente, plus les propriétés mécaniques statiques affichent un module, une contrainte à la rupture et une ténacité élevés sans toutefois affecter la déformation à la rupture, confirmant la formation de liens sacrificiels. Les tests mécaniques cycliques montrent que les traitements au pI ou avec Ca2+ créent des liens sacrificiels ioniques réversibles qui mènent à un processus d’auto-guérison des performances mécaniques dépendant du pH. L’ajout de Fe3+ à différentes concentrations module les performances mécaniques sur un plus large intervalle et la nature plus covalente de son interaction avec les acides aminés permet d’atteindre des valeurs nettement plus élevées que les autres traitements étudiés. Le Fe3+ permet aussi la formation de liens sacrificiels réversibles menant à l’auto-guérison des propriétés mécaniques. Les spectroscopies Raman et infrarouge confirment que le fer crée des liaisons avec plusieurs acides aminés, dont les histidines et les DOPA. Les résultats dans leur ensemble démontrent que les films de BPH sont des hydrogels biomimétiques du byssus qui peuvent être traités ou réticulés de différentes façons afin de moduler leurs performances mécaniques. Ils pourraient ainsi servir de matrices pour des applications potentielles dans le domaine pharmaceutique ou en ingénierie tissulaire.

Régulation de la proprotéine convertase subtilisine / kexine type 9 (PCSK9) dans les cellules intestinales Caco-2/15

La proprotéine convertase subtilisine/kexine type 9 (PCSK9) favorise la dégradation post-transcriptionnelle du récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLr) dans les hépatocytes et augmente le LDL-cholestérol dans le plasma. Cependant, il n’est pas clair si la PCSK9 joue un rôle dans l’intestin. Dans cette étude, nous caractérisons les variations de la PCSK9 et du LDLr dans les cellules Caco-2/15 différentiées en fonction d’une variété d’effecteurs potentiels. Le cholestérol (100 µM) lié à l’albumine ou présenté en micelles a réduit de façon significative l’expression génique (30%, p<0,05) et l’expression protéique (50%, p<0,05) de la PCSK9. Étonnamment, une diminution similaire dans le LDLr protéique a été enregistrée (45%, p<0,05). Les cellules traitées avec le 25-hydroxycholestérol (50 µM) présentent également des réductions significatives dans l’ARNm (37%, p<0,01) et la protéine (75%, p<0,001) de la PCSK9. Une baisse des expressions génique (30%, p<0,05) et protéique (57%, p<0,01) a également été constatée dans le LDLr. Des diminutions ont aussi été observées pour la HMG CoA réductase et la protéine liant l’élément de réponse aux stérols SREBP-2. Il a été démontré que le SREBP-2 peut activer transcriptionnellement la PCSK9 par le biais de la liaison de SREBP-2 à son élément de réponse aux stérols situé dans la région proximale du promoteur de la PCSK9. Inversement, la déplétion du contenu cellulaire en cholestérol par l’hydroxypropyl-β-cyclodextrine a augmenté l’expression génique de la PCSK9 (20%, p<0,05) et son contenu protéique (540%, p<0,001), en parallèle avec les niveaux protéiques de SREBP-2. L’ajout des acides biliaires taurocholate et déoxycholate dans le milieu apical des cellules intestinales Caco-2/15 a provoqué une baisse d’expression génique (30%, p<0,01) et une hausse d’expression protéique (43%, p<0,01) de la PCSK9 respectivement, probablement via la modulation du FXR (farnesoid X receptor). Ces données combinées semblent donc indiquer que la PCSK9 fonctionne comme un senseur de stérols dans le petit intestin.

Modulation de l’expression du gène CFTR par le produit du gène FIC1 responsable de la cholestase familiale intra-hépatique progressive de type 1 : Identification des mécanismes moléculaires impliqués

Réalisé en cotutelle avec l'Université de Cergy-Pontoise

Caractérisation de la toxicocinétique de l’octylphénol chez le rat en vue d’une meilleure analyse de risque toxicologique des perturbateurs endocriniens

Le p-tert-octylphénol est un produit présent dans l’environnement et issu de la dégradation des alkylphénols éthoxylés. Ce composé a la capacité de se lier au récepteur œstrogénique et d’exercer ainsi un léger effet œstrogénique. Les objectifs de cette étude étaient de 1) développer une méthode d'identification de l'octylphénol dans le sang et les tissus à l'aide de la chromatographie en phase gazeuse jumelée à la spectrométrie de masse, 2) caractériser la toxicocinétique sanguine et tissulaire de l’octylphénol chez le rat Sprague-Dawley mâle et femelle et 3) développer un modèle toxicocinétique à base physiologique permettant de décrire la cinétique sanguine et tissulaire de l’octylphénol inchangé. Pour ce faire, des rats mâle et femelle Sprague-Dawley ont reçu des doses uniques d’octylphénol par les voies intraveineuse, orale et sous-cutanée. Deux autres groupes ont reçu des doses répétées d'octylphénol par voie orale pour une durée de 35 jours consécutifs pour les femelles ou 60 jours pour les mâles. Les concentrations sanguines et tissulaires d’octylphénol ont été mesurées à différents moments après administration à partir d’une méthode d’analyse développée dans nos laboratoires dans le cadre de ce projet. Les expériences impliquant des administrations uniques ont montré que les concentrations sanguines et tissulaires d'octylphénol étaient en général plus élevées chez les femelles que chez les mâles. Des expériences réalisées avec des microsomes hépatiques ont confirmé que ces différences étaient vraisemblablement reliées au métabolisme de l'octylphénol. Les expériences impliquant des administrations répétées ont montré qu'il n'y avait pas d'accumulation d'octylphénol dans l'organisme aux doses étudiées. Les résultats obtenus expérimentalement ont servi à développer et valider un modèle toxicocinétique à base physiologique. Ce modèle a permis de simuler adéquatement les concentrations sanguines et tissulaires d'octylphénol suite à des expositions intraveineuses, orales et sous-cutanées. En conclusion, cette étude a fourni des données essentielles sur la toxicocinétique de l'octylphénol. Ces données sont nécessaires pour établir la relation entre la dose externe et la dose interne et vont contribuer à une meilleure évaluation des risques liés à l'octylphénol.

Étude de l'activité anti-cancéreuse du PCK3145, un peptide dérivé de PSP-94, sur les cancers hématologiques

Le PCK3145 est un peptide de 15 acides aminés inhibant la sécrétion de MMP-9 et démontrant une activité anti-tumorale contre le cancer de la prostate. Comme les cancers hématologiques sécrètent MMP-9, nous avons donc évalué l’effet du PCK3145 sur ces cancers. Nous avons démontré que les lignées humaines de lymphome non- Hodgkinien (LNH) SR et de myélome multiple RPMI-8226 ainsi que la lignée murine de mastocytome P815 ont une prolifération réduite suite à une exposition au PCK3145. Ce peptide diminue également la clonogénicité de ces cellules. In vivo, le PCK3145 diminue significativement la croissance des tumeurs sous-cutanées P815 comparativement au PBS (p<0.001) et aux peptides contrôles (« scrambled peptide » (p<0.05) et PCK5266 (p<0.01)). De plus, le traitement au PCK3145 diminue le nombre de métastases au niveau du foie par rapports aux contrôles (p<0.05). Les niveaux de MMP-9 dans le sang des souris traitées au PCK3145 sont similaires à ceux dans le sang des souris sans tumeur. Par contre, chez les souris recevant le PBS ou le « scrambled peptide », les niveaux de MMP-9 étaient significativement plus élevés que dans les souris sans tumeur et les souris traitées au PCK3145 (p<0.05). De surcroît, dans un modèle de xénogreffe, le PCK3145 diminue significativement la croissance des lymphomes SR par rapport au PBS (p<0.01) et au « scrambled peptide » (p<0.001). Ces résultats indiquent que le PCK3145 possède une activité anti-tumorale et pourrait représenter un agent intéressant pour le traitement de plusieurs cancers hématologiques.

Analyse fonctionnelle de la polycystine-1 et de son domaine intracellulaire dans le développement de la polykystose rénale autosomique dominante

La polykystose rénale autosomique dominante (PKRAD) est la maladie génétique rénale la plus commune touchant 1/500 personnes. Elle se caractérise principalement par la formation de kystes rénaux dans tous les segments du néphron, entraînant l’insuffisance rénale, et par des manifestations extrarénales kystiques (foie, pancréas, rate) et non-kystiques (anomalies cardiaques, vasculaires et cérébrales). Deux gènes, PKD1 et PKD2, sont responsables de 85 et 15% des cas respectivement. Ces gènes encodent les polycystine-1 (PC-1) et -2 (PC-2) qui forment un complexe à la membrane plasmique et ciliaire des cellules épithéliales rénales. PC-1 est une protéine transmembranaire de 4302 acides aminés possédant un court domaine intracellulaire incluant un motif coiled-coil impliqué dans l’interaction entre PC-1 et PC-2 in-vitro. L’importance du coiled-coil est démontrée par des mutations affectant spécifiquement ce motif chez des patients PKRAD. Le mécanisme pathogénétique responsable de la PKRAD est indéterminé. Chez la souris, la PKRAD se développe suite à l’ablation (Pkd1-/-) ou lors de la surexpression (SBPkd1TAG) de Pkd1, ce qui suggère un effet de dosage. Des anomalies ciliaires sont aussi souvent associées à PKRAD. Mon objectif était de déterminer in-vivo le mécanisme pathogénétique de la polycystine-1 dans le développement des symptômes PKRAD rénaux et extrarénaux et plus spécifiquement, le rôle du motif coiled-coil dans le mécanisme de kystogenèse. Pour ce faire, nous avons généré deux constructions, Pkd1 sauvage (Pkd1TAG) et Pkd1 tronquée de son motif coiled-coil (Pkd1ΔCoiled-coil), par recombinaison homologue à partir du BAC-Pkd1 sauvage comprenant la séquence murine entière de Pkd1. Trois lignées de souris Pkd1TAG générées par microinjection démontrent un niveau d’expression de Pkd1 qui corrèle avec le nombre de copie du transgène (2, 5 et 15 copies). Les souris Pkd1TAG reproduisent la PKRAD en développant des kystes rénaux dans toutes les parties du néphron et des cils primaires plus longs que les contrôles non transgéniques. Les analyses physiologiques supportent que les souris Pkd1TAG développent une insuffisance rénale et démontrent une augmentation du volume urinaire de même qu’une diminution de l’osmolalité, de la créatinine et des protéines urinaires. De plus, les souris Pkd1TAG développent des kystes hépatiques, des anomalies cardiaques associées à des dépôts de calcium et des anévrismes cérébraux. La sévérité du phénotype augmente avec l’expression de Pkd1 appuyant l’hypothèse d’un mécanisme de dosage. Nous avons aussi déterminé que l’expression du transgène Pkd1TAG complémente le phénotype létal-embryonnaire des souris Pkd1-/-. D’autre part, nous avons générés 4 lignées de souris Pkd1ΔCoiled-coil (2 et 15 copies du transgène) dont le nombre de copies corrèle avec le niveau d’expression du transgène. Ces souris Pkd1ΔCoiled-coil, contrairement aux Pkd1TAG de même âge, ne développent pas de kystes et possèdent des cils primaires de longueur normale. Afin d’évaluer le rôle du motif coiled-coil en absence de polycystine-1 endogène, nous avons croisé les souris Pkd1ΔCoiled-coil avec les souris Pkd1-/-. Contrairement aux souris Pkd1-/- qui meurent in-utéro, les souris Pkd1ΔCoiled-coil; Pkd1-/- survivent ~10 à 14 jours après la naissance. Elles démontrent des kystes rénaux et pancréatiques sévères, un retard de croissance et des anomalies pulmonaires. Tous les segments du néphron sont affectés. Mon projet démontre que la surexpression de Pkd1 est un mécanisme pathogénique de la PKRAD tant au niveau rénal qu’extrarénal. De plus, il démontre que le motif coiled-coil est un élément déterminant dans la kystogenèse/PKRAD in-vivo.

Polymeric micelles as versatile carriers for drugs and nucleic acids

Le cancer est la principale cause de mortalité au Canada. Les taxanes (e.g. le paclitaxel et le docétaxel (DCTX)) constituent des remèdes efficaces contre une série de tumeurs solides telles que les cancers du sein, du poumon et de l’ovaire. Par ailleurs, des acides nucléiques (e.g. les oligonucléotides antisens (AON) ou les petits ARN interférents (siRNAs)), capables de supprimer sélectivement certains oncogènes impliqués dans la carcinogénèse, sont actuellement étudiés pour traiter une large gamme de cancers. Bien que l’activité des taxanes et des acides nucléiques soit bien établie sur des modèles humains et/ou animaux, plusieurs aspects physico-chimiques et cliniques restent encore à améliorer. Leur solubilité limitée (pour les taxanes), leur dégradation rapide dans le sang (pour les acides nucléiques), leur élimination précoce, leur absence de sélectivité et leur toxicité envers les tissus sains sont les principaux facteurs limitant leur efficacité. C’est pourquoi de nombreux efforts ont porté sur l’élaboration de systèmes de vectorisation ciblés à base de polymères, dans le but de surmonter les problèmes associés aux thérapies actuelles. Dans cette thèse, deux types de micelles polymères ont été développés pour la vectorisation de DCTX et d’acides nucléiques. D’une part, des micelles de poly(oxyde d’éthylène)-bloc-poly(oxyde de butylène/styrène) ont été étudiées pour la première fois pour solubiliser le DCTX et le protéger de l’hydrolyse. Ces polymères se sont révélés moins toxiques que le surfactant utilisé commercialement pour solubiliser le DCTX (i.e. polysorbate 80) et ont permis une libération prolongée du principe actif. D’autre part, deux systèmes différents de micelles polyioniques (PICM) ont été mis au point pour la vectorisation d’acides nucléiques. De nouveaux conjugués de poly(éthylène glycol) (PEG)-oligonucléotide ont été proposés pour la protection et la libération contrôlée d’AON. Lorsque ces conjugués ont été formulés avec des dendrimères de poly(amidoamine) (PAMAM), des complexes de taille homogène ont été obtenus. Ces PICM ont permis de prolonger la libération de l’AON et de le protéger efficacement contre la dégradation enzymatique. De plus, des polymères de poly(oxyde d’éthylène)-bloc-poly(méthacrylate de propyle-co-acide méthacrylique) ont été incorporés afin de conférer des propriétés acido-sensibles aux PICM. Dans ces micelles, formées de ce dernier polymère formulé avec le dendrimère PAMAM, des oligonucléotides (AON et siRNA) ciblant l’oncogène Bcl-2 ont été encapsulés. L’internalisation cellulaire fut assurée par un fragment d’anticorps monoclonal (Fab’) situé à l’extrémité de la couronne de PEG. Après l’internalisation cellulaire et la protonation des unités d’acide méthacrylique sous l’effet de l’acidification des endosomes, les micelles se sont affranchies de leur couronne. Elles ont ainsi exposé leur cœur composé d’acide nucléique et de dendrimère PAMAM, qui possède une charge positive et des propriétés endosomolytiques. En effet, ces PICM acido-sensibles ciblées ont permis d’augmenter la biodisponibilité des acides nucléiques vectorisés et se sont avérées plus efficaces pour silencer l’oncoprotéine Bcl-2 que les micelles non ciblées ou que le dendrimère de PAMAM commercial seul. Finalement, les nanovecteurs polymères présentés dans cette thèse se révèlent être des systèmes prometteurs pour la vectorisation des anticancéreux et des acides nucléiques.

Étude des voies d’apprêtement des antigènes viraux menant à la présentation antigénique par les CMH de classe I

Le contrôle immunitaire des infections virales est effectué, en grande partie, par les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Pour y parvenir, les lymphocytes T CD8+ doivent être en mesure de reconnaître les cellules infectées et de les éliminer. Cette reconnaissance des cellules infectées s’effectue par l’interaction du récepteur T (TCR) des lymphocytes T CD8+ et des peptides viraux associés au complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I à la surface des cellules hôtes. Cette interaction constitue l’élément déclencheur permettant l’élimination de la cellule infectée. On comprend donc toute l’importance des mécanismes cellulaires menant à la génération des peptides antigéniques à partir des protéines virales produites au cours d’une infection. La vision traditionnelle de cet apprêtement protéique menant à la présentation d’antigènes par les molécules du CMH propose deux voies cataboliques distinctes. En effet, il est largement admis que les antigènes endogènes sont apprêtés par la voie dite ‘‘classique’’ de présentation antigénique par les CMH de classe I. Cette voie implique la dégradation des antigènes intracellulaires par le protéasome dans le cytoplasme, le transport des peptides résultant de cette dégradation à l’intérieur du réticulum endoplasmique, leur chargement sur les molécules du CMH de classe I et finalement le transport des complexes peptide-CMH à la surface de la cellule où ils pourront activer les lymphocytes T CD8+. Dans la seconde voie impliquant des antigènes exogènes, le dogme veut que ceux-ci soient apprêtés par les protéases du compartiment endovacuolaire. Les peptides ainsi générés sont directement chargés sur les molécules de CMH de classe II à l’intérieur de ce compartiment. Par la suite, des mécanismes de recyclage vésiculaire assurent le transport des complexes peptide-CMH de classe II à la surface de la cellule afin de stimuler les lymphocytes T CD4+. Cependant, cette stricte ségrégation des voies d’apprêtement antigénique a été durement éprouvée par la capacité des cellules présentatrices d’antigènes à effectuer l’apprêtement d’antigènes exogènes et permettre leur présentation sur des molécules de CMH de classe I. De plus, l’identification récente de peptides d’origine intracellulaire associés à des molécules de CMH de classe II a clairement indiqué la présence d’interactions entre les deux voies d’apprêtement antigénique permettant de transgresser le dogme préalablement établi. L’objectif du travail présenté ici était de caractériser les voies d’apprêtement antigénique menant à la présentation d’antigènes viraux par les molécules du CMH de classe I lors d’une infection par le virus de l’Herpès simplex de type I (HSV-1). Dans les résultats rapportés ici, nous décrivons une nouvelle voie d’apprêtement antigénique résultant de la formation d’autophagosomes dans les cellules infectées. Cette nouvelle voie permet le transfert d’antigènes viraux vers un compartiment vacuolaire dégradatif dans la phase tardive de l’infection par le virus HSV-1. Cette mise en branle d’une seconde voie d’apprêtement antigénique permet d’augmenter le niveau de présentation de la glycoprotéine B (gB) virale utilisée comme modèle dans cette étude. De plus, nos résultats décrivent la formation d’une nouvelle forme d’autophagosomes dérivés de l’enveloppe nucléaire en réponse à l’infection par le virus HSV-1. Ces nouveaux autophagosomes permettent le transfert d’antigènes viraux vers un compartiment vacuolaire lytique, action également assurée par les autophagosomes dits classiques. Dans la deuxième partie du travail présenté ici, nous utilisons l’infection par le virus HSV-1 et la production de la gB qui en résulte pour étudier le trafic membranaire permettant le transfert de la gB vers un compartiment vacuolaire dégradatif. Nos résultats mettent en valeur l’importance du réticulum endoplasmique, et des compartiments autophagiques qui en dérivent, dans ces mécanismes de transfert antigénique permettant d’amplifier la présentation antigénique de la protéine virale gB sur des CMH de classe I via une voie vacuolaire. L’ensemble de nos résultats démontrent également une étroite collaboration entre la voie classique de présentation antigénique par les CMH de classe I et la voie vacuolaire soulignant, encore une fois, la présence d’interaction entre les deux voies.

Étude de l'implication des navettes du pyruvate découlant du métabolisme mitochondrial du glucose dans la régulation de la sécrétion d'insuline par les cellules bêta pancréatiques

Le diabète est une maladie métabolique qui se caractérise par une résistance à l’insuline des tissus périphériques et par une incapacité des cellules β pancréatiques à sécréter les niveaux d’insuline appropriés afin de compenser pour cette résistance. Pour mieux comprendre les mécanismes déficients dans les cellules β des patients diabétiques, il est nécessaire de comprendre et de définir les mécanismes impliqués dans le contrôle de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Dans les cellules β pancréatiques, le métabolisme du glucose conduit à la production de facteurs de couplage métabolique, comme l’ATP, nécessaires à la régulation de l’exocytose des vésicules d’insuline. Le mécanisme par lequel la production de l’ATP par le métabolisme oxydatif du glucose déclenche l’exocytose des vésicules d’insuline est bien décrit dans la littérature. Cependant, il ne peut à lui seul réguler adéquatement la sécrétion d’insuline. Le malonyl-CoA et le NADPH sont deux autres facteurs de couplage métaboliques qui ont été suggérés afin de relier le métabolisme du glucose à la régulation de la sécrétion d’insuline. Les mécanismes impliqués demeurent cependant à être caractérisés. Le but de la présente thèse était de déterminer l’implication des navettes du pyruvate, découlant du métabolisme mitochondrial du glucose, dans la régulation de la sécrétion d’insuline. Dans les cellules β, les navettes du pyruvate découlent de la combinaison des processus d’anaplérose et de cataplérose et permettent la transduction des signaux métaboliques provenant du métabolisme du glucose. Dans une première étude, nous nous sommes intéressés au rôle de la navette pyruvate/citrate dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose, puisque cette navette conduit à la production dans le cytoplasme de deux facteurs de couplage métabolique, soit le malonyl-CoA et le NADPH. De plus, la navette pyruvate/citrate favorise le flux métabolique à travers la glycolyse en réoxydation le NADH. Une étude effectuée précédemment dans notre laboratoire avait suggéré la présence de cette navette dans les cellules β pancréatique. Afin de tester notre hypothèse, nous avons ciblé trois étapes de cette navette dans la lignée cellulaire β pancréatique INS 832/13, soit la sortie du citrate de la mitochondrie et l’activité de l’ATP-citrate lyase (ACL) et l’enzyme malique (MEc), deux enzymes clés de la navette pyruvate/citrate. L’inhibition de chacune de ces étapes par l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique ou de la technologie des ARN interférant a corrélé avec une réduction significative de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Les résultats obtenus suggèrent que la navette pyruvate/citrate joue un rôle critique dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Parallèlement à notre étude, deux autres groupes de recherche ont suggéré que les navettes pyruvate/malate et pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate étaient aussi importantes pour la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Ainsi, trois navettes découlant du métabolisme mitochondrial du glucose pourraient être impliquées dans le contrôle de la sécrétion d’insuline. Le point commun de ces trois navettes est la production dans le cytoplasme du NADPH, un facteur de couplage métabolique possiblement très important pour la sécrétion d’insuline. Dans les navettes pyruvate/malate et pyruvate/citrate, le NADPH est formé par MEc, alors que l’isocitrate déshydrogénase (IDHc) est responsable de la production du NADPH dans la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate. Dans notre première étude, nous avions démontré l’importance de l’expression de ME pour la sécrétion adéquate d’insuline en réponse au glucose. Dans notre deuxième étude, nous avons testé l’implication de IDHc dans les mécanismes de régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. La diminution de l’expression de IDHc dans les INS 832/13 a stimulé la sécrétion d’insuline en réponse au glucose par un mécanisme indépendant de la production de l’ATP par le métabolisme oxydatif du glucose. Ce résultat a ensuite été confirmé dans les cellules dispersées des îlots pancréatiques de rat. Nous avons aussi observé dans notre modèle que l’incorporation du glucose en acides gras était augmentée, suggérant que la diminution de l’activité de IDHc favorise la redirection du métabolisme de l’isocitrate à travers la navette pyruvate/citrate. Un mécanisme de compensation à travers la navette pyruvate/citrate pourrait ainsi expliquer la stimulation de la sécrétion d’insuline observée en réponse à la diminution de l’expression de IDHc. Les travaux effectués dans cette deuxième étude remettent en question l’implication de l’activité de IDHc, et de la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate, dans la transduction des signaux métaboliques reliant le métabolisme du glucose à la sécrétion d’insuline. La navette pyruvate/citrate est la seule des navettes du pyruvate à conduire à la production du malonyl-CoA dans le cytoplasme des cellules β. Le malonyl-CoA régule le métabolisme des acides gras en inhibant la carnitine palmitoyl transférase 1, l’enzyme limitante dans l’oxydation des acides gras. Ainsi, l’élévation des niveaux de malonyl-CoA en réponse au glucose entraîne une redirection du métabolisme des acides gras vers les processus d’estérification puis de lipolyse. Plus précisément, les acides gras sont métabolisés à travers le cycle des triglycérides/acides gras libres (qui combinent les voies métaboliques d’estérification et de lipolyse), afin de produire des molécules lipidiques signalétiques nécessaires à la modulation de la sécrétion d’insuline. Des études effectuées précédemment dans notre laboratoire ont démontré que l’activité lipolytique de HSL (de l’anglais hormone-sensitive lipase) était importante, mais non suffisante, pour la régulation de la sécrétion d’insuline. Dans une étude complémentaire, nous nous sommes intéressés au rôle d’une autre lipase, soit ATGL (de l’anglais adipose triglyceride lipase), dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose et aux acides gras. Nous avons démontré que ATGL est exprimé dans les cellules β pancréatiques et que son activité contribue significativement à la lipolyse. Une réduction de son expression dans les cellules INS 832/13 par RNA interférant ou son absence dans les îlots pancréatiques de souris déficientes en ATGL a conduit à une réduction de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose en présence ou en absence d’acides gras. Ces résultats appuient l’hypothèse que la lipolyse est une composante importante de la régulation de la sécrétion d’insuline dans les cellules β pancréatiques. En conclusion, les résultats obtenus dans cette thèse suggèrent que la navette pyruvate/citrate est importante pour la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Ce mécanisme impliquerait la production du NADPH et du malonyl-CoA dans le cytoplasme en fonction du métabolisme du glucose. Cependant, nos travaux remettent en question l’implication de la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate dans la régulation de la sécrétion d’insuline. Le rôle exact de IDHc dans ce processus demeure cependant à être déterminé. Finalement, nos travaux ont aussi démontré un rôle pour ATGL et la lipolyse dans les mécanismes de couplage métabolique régulant la sécrétion d’insuline.