790 resultados para signalisation cellulaire
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Thse ralise en cotutelle avec l'Universit Pierre et Marie Curie, Paris 6(UPMC, Paris, France).
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La stimulation du rcepteur de la rnine/prornine [(P) RR], un membre rcemment dcouvert du systme rnine-angiotensine (SRA), augmente l'activit du SRA et des voies de signalisation angiotensine II-indpendante. Pour tudier l'impact potentiel du (P)RR dans le dveloppement de l`obsit, nous avons mis l'hypothse que les souris dficientes en (P)RR uniquement dans le tissus adipeux (KO) auront une diminution du poids corporel en ciblant le mtabolisme du tissu adipeux, l'activit locomoteur et/ou la prise alimentaire. Ainsi, des souris KO ont t gnres en utilisant la technologie Cre/Lox. Le gain de poids et la prise alimentaire ont t valus hebdomadairement dans les mles et femelles KO et de type sauvage (WT) pendant 4 semaines alors quils taient maintenu sur une dite normal. De plus, un groupe de femelles a t plac pour 6 semaines sur une dite riche en gras et en glucides (HF/HC). La composition corporelle et l'activit ambulatoire ont t values par lEchoMRI et laide de cages Physioscan, respectivement. Les tissus adipeux ont t prlevs et pess. De plus, les gras pri-gonadaux ont t utiliss pour le microarray. Finalement, le niveaux d'expression d'ARNm du (P)RR ont t valus. Comme le gne du (P)RR est situ sur le chromosome X, les mles taient des KOs complets et les femelles taient des KOs partielles. Les souris KO avaient un poids corporel significativement plus petit par rapport WT, les diffrences tant plus prononces chez les mles. De plus, les femelles KOs taient rsistantes l'obsit lorsqu'elles ont t places sur la dite HF/HC et donc elles avaient significativement moins de masse grasse par rapport aux WTs. Lanalyse histologique des gras pri-gonadaux des KOs nous ont dvoils quil avait une rduction du nombre d'adipocytes mais de plus grande taille. Bien qu'il n'y ait eu aucun changement dans la consommation alimentaire, une augmentation de prs de 3 fois de l'activit ambulatoire a t dtecte chez les mles. De plus, nous avons observ que leurs tibias taient de longueur rduite ce qui suggre fortement l'affection de leur dveloppement. Les gras pri-gonadaux des souris KO avaient une expression rduite de l`ABLIM2 (Actin binding LIM protein family, member 2) qui est associ avec le diabte de type II chez l'humain. Ainsi, les donnes recueillies suggrent fortement que le (P)RR est implique dans la rgulation du poids corporelle.
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La sclrodermie (sclrose systmique, ScS) est une maladie auto-immune du tissu conjonctif caractrise par lpaississement de la peau, lapparition spontane de lsions cicatricielles, des maladies des vaisseaux sanguins, divers degrs dinflammation, en association avec un systme immunitaire hyperactif. La pathognse exacte de cette maladie est inconnue et aucun traitement appropri nest disponible. La fibrose est un lment distinctif de la maladie de ScS et est considre rsulter dune incapacit mettre fin de faon approprie la rponse normale de rparation des plaies. Lanalyse histologique du stade initial de la ScS rvle une infiltration privasculaire de cellules mononuclaires dans le derme, associe une synthse accrue de collagne dans les fibroblastes environnants. Ainsi, la comprhension des moyens de contrler le stade inflammatoire de la ScS pourrait tre bnfique pour contrler la progression de la maladie peu aprs son apparition. La mPGES-1 est une enzyme inductible qui agit en aval de la cyclo- oxygnase (COX) pour catalyser spcifiquement la conversion de la prostaglandine (PG) H2 en PGE2. La mPGES-1 joue un rle cl dans linflammation, la douleur et larthrite;; toutefois, le rle de la mPGES-1 dans les mcanismes de fibrose, spcifiquement en rapport avec la ScS humaine, est inconnu. Mon laboratoire a prcdemment montr que les souris mPGES-1 nulle sont rsistantes la fibrose cutane induite par la blomycine, linflammation, lpaississement cutan, la production de collagne et la formation de myofibroblastes. Sur la base de ces rsultats, jai formul lhypothse que linhibition pharmacologique de la mPGES-1 rgulera la baisse la production de mdiateurs pro-inflammatoires et pro-fibreux au cours de la maladie de ScS. Afin dexplorer le rle de la mPGES-1 dans linflammation et la fibrose associes la maladie de ScS, jai dabord examin lexpression de la mPGES-1 dans la peau normale comparativement des biopsies de peau extraites de patients atteints de ScS. Mes rsultats ont montr que la mPGES-1 est nettement leve dans la peau de patients atteints de ScS en comparaison avec la peau humaine normale. De plus, les niveaux de PGE2 drivs de la mPGES-1 taient galement significativement plus levs dans les fibroblastes cutans isols de patients atteints de ScS comparativement aux fibroblastes isols de tmoins sains. Jai galement tudi leffet de linhibition pharmacologique de la mPGES-1 sur lexpression de marqueurs pro- fibreux. Mes tudes ont montr que lexpression de mdiateurs pro-fibreux cls (-SMA, endothline-1, collagne de type 1 et facteur de croissance du tissu conjonctif (FCTC)) est leve dans les fibroblastes cutans ScS en comparaison avec les fibroblastes cutans normaux. Un traitement avec un inhibiteur de la mPGES-1 a eu pour effet de rduire significativement lexpression de l-SMA, de lendothline-1, du collagne de type 1 mais pas du FCTC dans les fibroblastes ScS, sans effet significatif sur les fibroblastes normaux. Jai en outre examin leffet de linhibition de la mPGES-1 sur des cytokines pro-inflammatoires cls impliques dans la pathologie de la ScS, incluant IL-6, IL-8 et MCP-1. Linhibition pharmacologique de la mPGES- 1 a eu pour effet de rduire significativement les niveaux de production de cytokines pro- inflammatoires IL6, IL8 et MCP-1 dans les fibroblastes avec lsion ScS comparativement des fibroblastes non traits. De plus, les patients atteints de ScS ont prsent des niveaux plus levs de p-AKT, de p-FAK et de p-SMAD3 en comparaison avec les fibroblastes cutans normaux. Linhibiteur de la mPGES-1 a pu rguler la baisse cette expression accrue de p-AKT et de p- FAK, mais pas de p-SMAD3, dans les fibroblastes ScS. Ces rsultats ont suggr que linhibition de la mPGES-1 pourrait tre une mthode viable pour rduire le dveloppement de sclrose cutane et constituent une cible thrapeutique potentielle pour contrler les mcanismes fibreux et inflammatoires associs la pathophysiologie de la maladie de ScS. Lun des autres processus critiques relis lvolution de la rponse fibreuse associe la maladie de ScS est la diffrenciation des fibroblastes en des cellules actives spcialises iii iv appeles myofibroblastes, responsables de dclencher une signalisation adhsive excessive et le dpt excessif de matrice extracellulaire, conduisant la destruction de larchitecture de lorgane. Ainsi, lidentification des facteurs endognes qui initient/ favorisent la diffrenciation fibroblaste-myofibroblaste peut mener des stratgies thrapeutiques prometteuses pour contrler lexcs de signalisation adhsive et de fibrose associ la maladie de ScS. Des tudes antrieures dans le domaine de la biologie du cancer ont suggr que lphrine B2, une protine transmembranaire appartenant la famille des phrines, est implique dans la signalisation adhsive et le remodelage extracellulaire. Cependant, son rle dans la fibrose na jamais t explor. Dans la deuxime partie de mon tude, jai donc tudi le rle de lphrine B2 dans la fibrose. Mes tudes montrent que lexpression de lphrine B2 est significativement augmente dans la peau humaine ScS comparativement la peau normale. Plus important encore, le traitement in vitro de fibroblastes de la peau humaine normale avec de lphrine B2 recombinante est capable de transformer des fibroblastes en cellules myofibroblastiques manifestant toutes les caractristiques myofibroblastiques typiques, incluant la formation accrue de fibres de tension, des adhrences focales, lactivation accrue de la FAK, un accroissement de lexpression et de la migration de fibroblastes et de leur adhrence la fibronectine la fois chez les fibroblastes cutans normaux et ScS. En outre, jai trait des souris avec de lphrine B2 recombinante et montr que ces souris ont dvelopp une fibrose cutane significative associe une paisseur dermique et une synthse de collagne augmentes, une teneur en hydroxyproline (teneur en collagne) accrue et un nombre accru de myofibroblastes exprimant de l-SMA, une activation augmente de la FAK et de marqueurs pro-fibreux incluant le collagne de type 1 et le FCTC. Dans lensemble, mes tudes ont identifi deux mdiateurs endognes cruciaux impliqus dans la propagation de linflammation et de la fibrose associes la maladie de ScS. Linhibition de la mPGES-1 pourrait reprsenter une bonne stratgie alternative pour contrer linflammation et la fibrose au moins durant les stades prcoces de la maladie de ScS. De plus, une signalisation excessive de lphrine B2 favorise la signalisation adhsive et fibreuse en dclenchant la diffrenciation de fibroblastes en myofibroblastes par lactivation de la voie de signalisation de la FAK. Ainsi, linhibition dphrine B2 bloquera la formation de fibroblastes-myofibroblastes et rgulera la baisse la fibrose associe la maladie de ScS. En somme, la mPGES-1 et lphrine B2 semblent toutes deux des cibles attrayantes pour le traitement de la ScS et des troubles fibreux qui y sont relis.
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La dopamine (DA) est un neurotransmetteur impliqu dans la modulation de fonctions essentielles du cerveau telles que le contrle des mouvements volontaires, le systme de rcompense et certains aspects de la cognition. Depuis sa dcouverte, la DA a attir normment d'attention scientifique en partie cause des pathologies majeures associes aux dysfonctions du systme DAergique, comme la maladie de Parkinson, la schizophrnie et la toxicomanie. On retrouve la majorit des neurones qui synthtisent la DA au niveau du msencphale ventral, dans les noyaux de la substance noire compacte (SNc) et de l'aire tegmentaire ventrale (ATV). Ces neurones projettent leurs axones dans un trs dense rseau de fibres qui s'organisent en trois voies DAergiques classiques: la voie nigrostrie, la voie msolimbique et la voie msocorticale. La transmission DAergique s'effectue par l'activation de rcepteurs de la DA qui font partie de la grande famille des rcepteurs coupls aux protines G (RCPGs). Les rcepteurs de la DA sont abondamment exprims aussi bien par les neurones DAergiques que par les neurones des rgions cibles, ce qui implique que la comprhension de la signalisation et des fonctions particulires des rcepteurs de la DA pr- et postsynaptiques reprsente un enjeu crucial dans l'tude du systme DAergique. Cette thse de doctorat se spare donc en deux volets distincts: le premier s'intresse la rgulation du rcepteur D2 prsynaptique par la neurotensine (NT), un neuropeptide intimement li la modulation du systme DAergique; le deuxime s'intresse au ct postsynaptique du systme DAergique, plus particulirement la sgrgation de l'expression des rcepteurs de la DA dans le striatum et aux fonctions de ces rcepteurs dans l'tablissement des circuits neuronaux excitateurs prenant place dans cette rgion. Dans la premire partie de cette thse, nous dmontrons que l'activation du rcepteur haute affinit de la NT, le NTR1, provoque une internalisation htrologue du rcepteur D2, avec une amplitude et une cintique diffrente selon l'isoforme D2 observ. Cette internalisation htrologue dpend de la protine kinase C (PKC), et nous montrons que la surexpression d'un rcepteur D2 mut sur des sites de phosphorylation par la PKC ii ainsi que l'inhibition de l'expression de -arrestine1 par ARNs interfrents dans des neurones DAergiques bloquent compltement l'interaction fonctionnelle entre le NTR1 et le D2. Dans la deuxime partie de cette thse, nous dmontrons d'abord que la sgrgation de l'expression des rcepteurs D1 et D2 dans le striatum est dj bien tablie ds le 18e jour embryonnaire, bien qu'elle progresse encore significativement aux jours 0 et 14 postnataux. Nos rsultats tmoignent aussi d'un maintien complet de cette sgrgation lorsque les neurones striataux sont mis en culture aussi bien en prsence ou en absence de neurones corticaux et/ou msencphaliques. Ensuite, nous montrons que la prsence de neurones msencphaliques stimule la formation dpines et de synapses excitatrices sur les neurones striataux pineux exprimant le rcepteur D2 (MSN-D2). Le co-phnotype glutamatergique des neurones dopaminergiques semble ncessaire une grande partie de cet effet. Par ailleurs, le nombre total de terminaisons excitatrices formes sur les MSN-D2 par les neurones corticaux et msencphaliques apparat tre rgit par un quilibre dynamique. Finalement, nous dmontrons que le blocage de la signalisation des rcepteurs D1 et D2 de la DA n'est pas ncessaire pour la formation des synapses excitatrices des MSN-D2, alors que l'antagonisme des rcepteurs glutamatergiques ionotropes diminue la densit d'pines dendritiques et contrle de faon oppose le nombre de terminaisons excitatrices corticales et msencphaliques. Globalement, ce travail reprsente une contribution significative pour une meilleure comprhension du fonctionnement normal du systme DAergique. Ces dcouvertes sont susceptibles dtre utiles pour mieux comprendre les dysfonctions de ce systme dans le cadre de pathologies du cerveau comme la maladie de Parkinson.
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Les microARN (miARN) sont de petits ARN non-codants qui rpriment la traduction de leurs gnes cibles par hybridation leur ARN messager (ARNm). L'identification de cibles biologiquement actives de miARN est cruciale afin de mieux comprendre leurs rles. Ce problme est cependant difficile parce que leurs sites ne sont dfinis que par sept nuclotides. Dans cette thse je montre qu'il est possible de modliser certains aspects des miARN afin d'identifier leurs cibles biologiquement actives travers deux modlisations d'un aspect des miARN. La premire modlisation s'intresse aux aspects de la rgulation des miARN par l'identification de boucles de rgulation entre des miARN et des facteurs de transcription (FT). Cette modlisation a permis, notamment, d'identifier plus de 700 boucles de rgulation miARN/FT, conserves entre l'humain et la souris. Les rsultats de cette modlisation ont permis, en particulier, d'identifier deux boucles d'auto-rgulation entre LMO2 et les miARN miR-223 et miR-363. Des expriences de transplantation de cellules souches hmatopotiques et de progniteurs hmatopotiques ont ensuite permis d'assigner ces deux miARN un rle dans la dtermination du destin cellulaire hmatopotique. La deuxime modlisation s'intresse directement aux interactions des miARN avec les ARNm afin de dterminer les cibles des miARN. Ces travaux ont permis la mise au point d'une mthode simple de prdiction de cibles de miARN dont les performances sont meilleures que les outils courant. Cette modlisation a aussi permis de mettre en lumire certaines consquences insouponnes de l'effet des miARN, telle que la spcificit des cibles de miARN au contexte cellulaire et l'effet de saturation de certains ARNm par les miARN. Cette mthode peut galement tre utilise pour identifier des ARNm dont la surexpression fait augmenter un autre ARNm par l'entremise de miARN partags et dont les effets sur les ARNm non cibls seraient minimaux.
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Les centrosomes dont le rle principal est dorganiser le cytosquelette de microtubules et le fuseau mitotique servent aussi de sites dinteraction pour plusieurs protines rgulatrices du cycle cellulaire et de la rponse aux dommages lADN. Une de ces protines est la kinase CHK2 et plusieurs publications montrent une sous-population de CHK2 localise aux centrosomes dans les cellules en interphase et en mitose. Toutefois, la localisation de CHK2 aux centrosomes demeure controverse, car des doutes subsistent en ce qui concerne la spcificit des anticorps utiliss en immunocytochimie. En utilisant des lignes cellulaires du cancer du clon, les cellules HCT116 sauvages et HCT116 CHK2-/- ainsi que diffrentes lignes dostosarcome humain dans lesquelles lexpression de CHK2 a t inhibe par ARN interfrence, nous montrons que les anticorps anti-CHK2 qui donnent un signal centrosomal sont non spcifiques et reconnaissent un antigne inconnu sur les centrosomes. Cependant, par des expriences dimmunofluorescence ralises avec des cellules U2OS qui expriment les protines de fusion GFP-CHK2 ou FLAG-CHK2, nous rvlons une localisation centrosomale de CHK2 dans les cellules en mitose, mais pas en interphase. Ce rsultat a t confirm par vidomicroscopie dans les cellules vivantes exprimant GFP-CHK2. Pour dterminer le ou les rles potentiels de CHK2 en mitose nous avons ralis des expriences pour explorer le rle de CHK2 dans la progression de la mitose, la nuclation des microtubules aux centrosomes et la progression de la mitose en prsence de problmes dattachement des chromosomes o de lsions gnotoxiques. Nos donnes suggrent que CHK2 nest pas implique dans la rgulation de la mitose dans les cellules U2OS.
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Linsuffisance hpatique aigu (IHA) se caractrise par la perte soudaine de la fonction hpatique rsultant de la ncrose massive des hpatocytes en labsence de pathologie hpatique prexistante. LIHA saccompagne de perturbations mtaboliques et immunologiques qui peuvent entraner lapparition de complications priphriques et crbrales telles quun syndrome de rponse inflammatoire systmique (SIRS), une encphalopathie hpatique (EH), un dme crbral, une augmentation de la pression intracrnienne, et la mort par herniation du tronc crbral. Les infections sont une complication frquente de lIHA et elles sont associes un risque accru de dvelopper un SIRS et une aggravation subsquente de lEH avec un taux de mortalit augment. Lammoniaque joue un rle majeur dans les mcanismes physiopathologiques qui mnent au dveloppement de lEH et de ldme crbral, et des tudes rcentes suggrent que les cytokines pro-inflammatoires sont galement impliques. Le but de cette thse est dtudier le rle des cytokines pro-inflammatoires circulantes et crbrales dans le dveloppement de lEH et de ldme crbral lors dIHA. Dans larticle 1, nous dmontrons que linhibition priphrique du facteur de ncrose tumorale- (TNF-) par letanercept retarde la progression de lEH en diminuant le dommage hpatocellulaire, rduisant linflammation priphrique et centrale ainsi que le stress oxydatif/nitrosatif hpatique et crbral associ chez la souris avec une IHA induite par lazoxymthane (AOM). Ces rsultats dmontrent un rle important du TNF- dans la physiopathologie de lEH lors dIHA dorigine toxique et suggrent que letanercept pourrait constituer une approche thrapeutique dans la prise en charge des patients en attente de transplantation hpatique. Dans larticle 2, nous simulons la prsence dune infection chez la souris avec une IHA induite par lAOM pour mettre en vidence une ventuelle augmentation de la rponse inflammatoire. Nous dmontrons que lendotoxmie induite par le lipopolysaccharide (LPS) prcipite la survenue du coma et aggrave la pathologie hpatique. Les cytokines pro-inflammatoires systmiques et crbrales sont augmentes de faon synergique par le LPS lors dIHA et rsultent en une activation accrue de la mtalloprotinase matricielle-9 crbrale qui saccompagne dune extravasation dimmunoglobulines G (IgG) dans le parenchyme crbral. Ces rsultats dmontrent une augmentation majeure de la permabilit de la barrire hmato-encphalique (BHE) qui contribue la pathogense de lEH lors dIHA en condition infectieuse. Les rsultats de larticle 3 dmontrent que laugmentation de la permabilit de la BHE lors dIHA induite par lAOM en condition non infectieuse ne rsulte pas de laltration de lexpression des protines constitutives de la BHE. Dans larticle 4, nous dmontrons que lexposition dastrocytes en culture des concentrations physiopathologiques dammoniaque ou dinterleukine-1 rsulte en laltration de gnes astrocytaires impliqus dans la rgulation du volume cellulaire et dans le stress oxydatif/nitrosatif. Un effet additif est observ dans le cas dun traitement combin au niveau des gnes astrocytaires impliqus dans le stress oxydatif/nitrosatif. Lensemble des rsultats de cette thse dmontre un rle important de linflammation priphrique et crbrale dans la survenue des complications neurologiques lors dIHA et une meilleure comprhension des mcanismes physiopathologiques impliqus pourrait contribuer la mise en place de stratgies thrapeutiques chez les patients atteints dIHA en attente de transplantation.
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Contexte: La cardiopathie ischmique (IHD) reste une cause majeure de mortalit en Amrique du Nord. La thrapie cellulaire cardiaque (CCT) a merg comme une thrapie prometteuse pour aider gurir certaines malades cardiaques. Parmi les cellulaires avec proprits pluripotentes, les cellules stromales msenchymateuses (MSC) sont prometteuses. Cependant, plusieurs questions demeurent non rsolues et certaines dfis empchent l'application clinique de la CCT se dans l'IHD, tels que le faible taux de rtention cellulaire in situ, le suivi des cellules in vivo post-implantation et post-acheminements et l`apoptose. Ici, le traitement prliminaire des MSC avec des facteurs de croissance et leur couplage avec des nanoparticules (NP) seront tudis comme des mthodes pour optimiser MSC. Mthodes: Des MSCs provenant du rat (rMSC) et du cochon (pMSC) ont t isols partir de moelle osseuse. Les rMSC ont t prconditionnes avec SDF-1a, TSG-6 et PDGF-BB, et ensuite soumises une hypoxie, une privation de srum et a un stress oxydatif. Des tudes de cicatrisation ont galement t effectus avec rMSCs prconditionnes. En parallle, de nouvelles NP ferromagntiques lies aux silicones ont t synthtises. Les NPs ont t couples aux pMSCs suivant leur fonctionnalisation avec l`anticorps, CD44, un antigne de surface du MSC bien connu. Par la suite, les tudes de biocompatibilit ont t ralises sur pMSC-NP et en incluant des tests des processus cellulaires tels que la migration, l'adhsion, la prolifration et les proprits de la diffrenciation. Rsultats: Parmi toutes les cytokines testes, PDGF-BB a dmontr la plus grande capacit amliorer la survie de MSC dans des conditions d'hypoxie, de privation de srum et en reponse au stress oxydatif. La conjugaison de NP a attnu la migration et la prolifration des pMSCs, mais n`a pas chang leur capacit de diffrenciation. Enfin, la complexe du MSC-NP est dtectable par IRM. Conclusion: Nos donnes suggrent que de nouvelles stratgies, telles que traitement prliminaire de PDGF-BB et le couplage des nanoparticules ferromagntiques, peuvent tre considrs comme des avenues prometteuse pour optimiser les MSCs pour la CCT.
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La replication et lassemblage du virus de lhepatite C (VHC) sont regules finement dans le temps et lespace par les interactions proteiques entre le virus avec lhote. La comprehension de la biologie du virus ainsi que sa pathogenicite passe par les connaissances relatives aux interactions virus/hote. Afin didentifier ces interactions, nous avons exploite une approche dimmunoprecipitation (IP) couplee a une detection par spectrometrie de masse (MS), pour ensuite evaluer le role des proteines identifiees dans le cycle viral par une technique de silencage genique. Les proteines virales Core, NS2, NS3/4A, NS4B, NS5A et NS5B ont ete exprimees individuellement dans les cellules humaines 293T et immunoprecipitees afin disoler des complexes proteiques qui ont ete soumis a lanalyse MS. Ainsi, 98 proteines de lhote ont ete identifiees avec un enrichissement significatif et illustrant une specificite dinteraction. Lenrichissement de proteines connues dans la litterature a demontre la force de lapproche, ainsi que la validation de 6 nouvelles interactions virus/hote. Enfin, le role de ces interactants sur la replication virale a ete evalue dans un criblage genomique par ARN interferant (ARNi). Deux systemes rapporteurs de la replication virale ont ete utilises : le systeme de replicon sous-genomique (Huh7-Con1-Fluc) et le systeme infectieux (J6/JFH-1/p7Rluc2a), ainsi quun essai de toxicite cellulaire (Alamar Blue). Parmi les proteines de lhote interagissant avec le VHC, 28 proteines ont demontre un effet significatif sans effet de toxicite cellulaire, suggerant fortement un role dans la replication du VHC. Globalement, letude a mene a lidentification de nouvelles interactions virus/hote et lidentification de nouvelles cibles therapeutiques potentielles.
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Introduction: Lactivation des cellules stellaires hpatiques (CSHs) est un point cl du processus de fibrose hpatique. Les lymphocytes T CD4+ intra-hpatiques sont une source majeure de cytokines anti-inflammatoires comme lIL-10 et pro-inflammatoire (IL-17A), hpatoprotectrice (IL-22) produites par les Th17. Les Th17 sont impliqus dans de nombreuses pathologies inflammatoires mais leffet de ces cellules sur les CSHs nest pas encore lucid. Objectif: Comprendre le rle des cytokines de type Th17 dans le processus dactivation des CSHs. Mthodes: La ligne de CSHs humaine LX2 a t stimule par lIL-17A ou lIL-22 puis compare des cellules traites par le TGF-b et le tampon phosphate salin (PBS). Lactivation des CSHs a t value en examinant les molcules profibrotique alpha-smooth muscle actin (a-SMA), collagne de type I (COL1A1) et inhibiteur produits par les tissus des mtalloprotases matricielles I (TIMP-I) par q-PCR. Lexpression protique a t valide par immunobuvardage ou coloration au rouge de picro Sirius. Lexpression membranaire de lIL-10Rb, du TGF-b-RII et de lIL-17RA a t mesure par cytomtrie en flux. Rsultats: LIL-17A et lIL-22 nactivent pas les cellules LX2, car aucune induction da-SMA, de COL1A1 et de TIMP-I na t observe. Cependant, lIL-17A et lIL-22 sensibilisent les CSHs laction du TGF-b, tel que dmontr par une forte expression et production da-SMA, collagne type I et TIMP-I. LIL-17A, mais pas lIL-22, induit la surexpression la surface cellulaire du TGF-b-RII et inhibe partiellement la baisse dexpression du TGF--RII aprs stimulation au TGF-b. Conclusion: Nos rsultats dmontrent une fonction pro-fibrotique de lIL-17A et de lIL-22, car les deux cytokines sensibilisent les CSHs laction du TGF-b. LIL-17A agit via la surexpression et la stabilisation du TGF-b-RII tandis que lIL-22 agit probablement par des mcanismes intracellulaires.
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Le mecanisme biologique responsable pour laugmentation de lexpression de la proteine nestin dans les cellules souches neurales (CSN) du cur apres un infarctus du myocarde (IM) demeure inconnu. Des etudes anterieures ont demontre que le traitement au dexamethasone, un glucocorticoide aux proprietes anti-inflammatoires, abolit la regulation positive de nestin apres un IM. Ceci suggere un lien avec la reponse inflammatoire. Nous avons verifie dans cette etude lhypothese que la cytokine inflammatoire interleukin-1beta (IL-1beta) peut modifier le phenotype de cellules souches neurales. Le deuxieme objectif de letude fut detablir limpact, suivant un IM, de linhibition de la signalisation de IL-1beta sur la fonction et la guerison cardiaque. Suite a une ligature complete de lartere coronaire du rat male, le dysfonctionnement contractile du ventricule gauche fut associe a une regulation positive de la proteine nestin dans le myocarde non-infarci. Le traitement avec Xoma 052 (1 mg/kg), un anticorps anti-IL-1beta, 24h, 7 et 14 jours apres un evenement ischemique, eu aucun effet sur la taille de linfarctus ou la contractilite du ventricule gauche. De plus, le traitement avec Xoma 052 apres un IM na pu supprimer laugmentation de lexpression de nestin et Bcl-2 malgre une reduction modeste du niveau de la proteine Bax. Pour determiner directement le role de la reponse inflammatoire en labsence dischemie, nous avons injecte des rats males avec du LPS (10mg/kg, 18hrs). Dans le coeur du rat-LPS, nous avons note une augmentation significative du niveau dARNm de IL-1beta et de lexpression de la proteine nestin. Le pretraitement avec 10mg/kg de Xoma 052 a aboli laugmentation de lexpression de nestin dans le coeur des rats-LPS. Ces observations indiquent que les cellules souches neurales pourraient representer une cible potentielle de lIL-1beta.
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Les estrognes sont impliqus dans plusieurs aspects de la physiologie humaine en particulier, le dveloppement, la croissance, la diffrenciation des tissus reproducteurs, la reproduction, et la grossesse. Les effets cellulaires des estrognes sont transmis via l'interaction avec les rcepteurs des estrognes ER et ER. Lactivation de ER et ER contrle directement la transcription des gnes cibles ncessaires pour mdier les effets physiologiques des estrognes. Leffet des estrognes peut aussi tre mitognique et devient la cause de plusieurs pathologies surtout dans les tissus qui prsentent une sensibilit accrue lhormone tel que les tissus mammaires, les ovaires et lutrus. De ce fait, une surexposition de ces tissus lestrogne augmente le risque de dvelopper le cancer. Dans une ligne cellulaire qui coexprime les deux rcepteurs, nous avons identifi la chimiokine SDF-1 qui interagit avec le rcepteur CXCR4 et qui dcrit une boucle de rgulation autocrine/paracrine entre la voie des chimiokines et celle des estrognes. Cette rgulation induit une augmentation de lexpression des gnes cibles prolifratifs du cancer du sein. Cependant, les mcanismes exacts de cette rgulation restent inconnus. Afin d'identifier les cibles exactes de cette rgulation au niveau gnomique, nous avons dvelopp un modle cellulaire pour discriminer le rle respectif de ER et ER au niveau du contrle transcriptionnel de cette boucle de rgulation des chimiokines. En partant dune ligne cellulaire ER-, nous avons gnr un systme cellulaire qui exprime lun ou lautre des isoformes en plus du mutant ER-S87A. Nous avons construit le promoteur CXCR4bLuc quon a test dans les lignes cellulaires gnres. En utilisant la construction du promoteur CXCR4bLuc, nous avons dmontr une voie de rgulation des rcepteurs des chimiokines par les rcepteurs des estrognes. Lactivation membranaire de CXCR4 par SDF-1 implique lactivation directe du rcepteur de lestrogne ER par phosphorylation de la srine 87. Cette phosphorylation active ER et favorise lexpression du gne de CXCR4. La transcription de CXCR4 passe par la liaison de ER au niveau dun lment de liaison ERE que nous avons identifi dans ce travail par la technique de ChIP. Ainsi, nous avons identifi une cible exacte de la rgulation des rcepteurs des chimiokines CXCR4 par le rcepteur des estrognes ER qui peut constituer une approche prometteuse pour contrer les pathologies associes au cancer du sein et ses mtastases.
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Les voies respiratoires sont exposes une panoplie de pathognes. Lors dune infection virale respiratoire les cellules qui recouvrent ces voies participent activement la dfense immunitaire contre ces derniers en limitant la propagation du virus et en engendrant une rponse proinflammatoire. Un vnement clef dans ces processus est lactivation des facteurs de transcription, notamment le Nuclear Factor (NF)-B et l Interferon Regulatory Factor -3 (IRF-3), qui rgulent lexpression des cytokines antivirales et proinflammatoires. Des donnes rcentes dmontrent que les drivs actifs de loxygne (ROS), produits suite une infection virale, ont la capacit de rguler les voies de signalisation enclenches par NF-B et IRF-3. Une source importante de ROS est la famille de NADPH oxydases (NOX), qui contient les membres NOX1-5 et DUOX1 et 2. Lobjectif de notre tude tait didentifier la NOX qui rgule les mcanismes antiviraux et proinflammatoires suite linfection avec le virus respiratoire syncytial (RSV), qui cause des complications respiratoires majeures, et le virus Sendai (SeV), un modle viral non-pathogne. Nos travaux ont permis didentifier que NOX2 est une molcule clef dans la rponse proinflammatoire suite linfection virale. Plus spcifiquement, NOX2 est important pour lactivation de NF-B et la scrtion des cytokines rgules par ce dernier. De plus, nous avons observ une forte augmentation de la prsence de DUOX2 dans les cellules de voies respiratoires humaines infectes par SeV. Une tude plus approfondie nous a permis de caractriser quune synergie entre deux cytokines secrtes lors de linfection, soit linterfron (IFN) et le TNF est responsable de linduction de DUOX2. Nous avons aussi dcouvert que DUOX2 confre une activit antivirale et est ncessaire pour maintenir les taux des cytokines antivirales tardives IFN et IFN. Lors dune infection avec RSV, linduction de DUOX2 nest pas dtectable. Nous avons mis en vidence que RSV interfre avec lexpression de DUOX2 ce qui pourrait suggrer sa pathognicit. En conclusion, nos travaux dmontrent pour la premire fois une implication spcifique des NADPH oxydase NOX2 et DUOX suite aux infections virales respiratoires.
Resumo:
Le rcepteur neurokinine 1 (NK1R) est impliqu dans la rgulation des rponses immunitaires innes et adaptatives. Cependant, les mcanismes par lesquels le NK1R modulerait ces rponses ne sont pas connus. Chez les cellules T, les voies de la calcineurine et de la mTOR constituent les cibles dimmunosuppresseurs, comme la cyclosporine A (CsA), le tacrolimus et la rapamycine. Ainsi, nous avons voulu dterminer si le NK1R pourrait agir sur ces voies et si le blocage pharmacologique du NK1R avec des antagonistes slectifs, pourrait augmenter laction de ces immunosuppresseurs sur lactivation des cellules T. Tout dabord, nos rsultats ont montr que les cellules Jurkat (celules T humaines) exprimaient la fois le gne du NK1R et de son ligand (les endokinines). Ceci suggre l'existence d'une rgulation autocrine tachykinergique de la fonction des cellules T. Cette hypothse est appuye par nos donnes, o nous avons observ que le blocage du NK1R avec des antagonistes spcifiques (L-733,060 et L-703,606) chez les cellules Jurkat, inhibe la production d'IL-2 et diminue l'activation du NFAT (substrat de la calcineurine). De faon intressante, nous avons montr un effet de combinaison entre les antagonistes du NK1R et les inhibiteurs de la calcineurine (CsA et tacrolimus) sur la production dIL-2 et lactivation du NFAT. En revanche, le blocage du NK1R n'a pas d'effet inhibiteur sur lactivation de la mTOR et la p70S6K, mais rduit la phosphorylation de S6R (Ser235/236) et Akt (Ser473). Enfin, nous navons observ aucun effet de combinaison avec la rapamycine et lantagoniste NK1R sur lactivation de mTOR et de sa voie de signalisation. Lensemble de nos rsultats, dmontrent la prsence d'un nouveau mcanisme de rgulation de NFAT impliquant le systme tachykinergique NK1R/endokinines chez les cellules T. Par consquent, nous suggrons que la combinaison des antagonistes NK1R avec les inhibiteurs de la calcineurine pourrait tre une alternative thrapeutique intressante afin de rduire les doses de CsA et le FK506 dans les protocoles de prvention de rejet de greffes.
Resumo:
Rcemment plusieurs rcepteurs coupls aux protines G (RCPGs) ont t caractriss au niveau des membranes intracellulaires, dont la membrane nuclaire. Notre objectif tait de dterminer si les sous-types de rcepteurs -adrnergiques (AR) et leurs machineries de signalisation taient fonctionnels et localiss la membrane nuclaire des cardiomyocytes. Nous avons dmontr la prsence des 1AR et 3AR, mais pas du 2AR la membrane nuclaire de myocytes ventriculaires adultes par immunobuvardage, par microscopie confocale, et par des essais fonctionnels. De plus, certains partenaires de signalisation comme les protines GS, Gi, ladnylate cyclase II, et V/VI y taient galement localiss. Les sous-types de AR nuclaires taient fonctionnels puisqu'ils pouvaient lier leurs ligands et activer leurs effecteurs. En utilisant des noyaux isols, nous avons observ que l'agoniste non-slectif isoprotrnol (ISO), et que le BRL37344, un ligand slectif du 3AR, stimulaient l'initiation de la synthse de lARN, contrairement l'agoniste slectif du 1AR, le xamotrol. Cette synthse tait abolie par la toxine pertussique (PTX). Cependant, la stimulation des rcepteurs nuclaires de type B de lendothline (ETB) causaient une rduction de l'initiation de la synthse dARN. Les voies de signalisations impliques dans la rgulation de la synthse dARN par les RCPGs ont ensuite t tudies en utilisant des noyaux isols stimuls par des agonistes en prsence ou absence de diffrents inhibiteurs des voies MAP Kinases (proteines kinases actives par mitognes) et de la voie PI3K/PKB. Les protines impliques dans les voies de signalisation de p38, JNK, ERK MAP Kinase et PKB taient prsents dans les noyaux isols. L'inhibition de PKB par la triciribine, inhibait la synthse dARN. Nous avons ensuite pu mettre en vidence par qPCR que la stimulation par lISO entrainait une augmentation du niveau d'ARNr 18S ainsi quune diminution de l'expression dARNm de NFB. En contraste, lET-1 navait aucun effet sur le niveau dexpression de lARNr 18S. Nous avons ensuite montr que la stimulation par lISO rduisait lexpression de plusieurs gnes impliqus dans l'activation de NFB, tandis que linhibition de ERK1/2 et PKB renversait cet effet. Un microarray global nous a ensuite permis de dmontrer que les ARs et les ETRs nuclaires rgulaient un grand nombre de gnes distincts. Finalement, les ARs et ETRs nuclaires augmentaient aussi une production de NO de noyaux isols, ce qui pouvait tre inhibe par le LNAME. Ces rsultats ont t confirms dans des cardiomyocytes intacts en utilisant des analogues cags et permables dISO et de l'ET-1: l'augmentation de NO nuclaire dtecte par DAF2-DA, cause par l'ET-1 et l'ISO, pouvait tre prvenue par le LNAME. Finalement, laugmentation de linitiation de la transcription induite par l'ISO tait aussi bloque par le L-NAME ou par un inbitheur de PKG, le KT5823, suggrant que la voie NO-GC-PKG est implique dans la rgulation de la transcription par les AR. En conclusion, les ARs et les ETRs nuclaires utilisent des voies de signalisation diffrentes et exercent ainsi des effets distincts sur lexpression des gnes cardiaques. Ils reprsentent donc une avenue intressante pour le dveloppement de drogues pharmacologiques.
