Étude de la sécrétion de la leptine gastrique chez le rat

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Effets d'agents biologiques, administrés localement, sur la formation des tissus calcifiés

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Induction des gènes pro-inflammatoires suite à l'activation de PAR-2 à la membrane nucléaire

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Déterminants du mécanisme de ciblage de la proprotéine convertase PC5-A vers la voie de sécrétion régulée

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude des mécanismes des voies mitochondriale et lysosomiale dans l'apoptose p53-indépendante induite par les agents chimiothérapeutiques

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

HTDE1 : caractérisation, localisation et potentiel transformant d'un membre d'une nouvelle famille de protéines

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Analyse des mécanismes cellulaires et moléculaires du guidage axonal sérotoninergique in vitro

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Bcl-xL (S49) and (S62) sequential phosphorylation/dephosphorylation during mitosis prevents chromosome instability and aneuploidy

Une caractéristique intéressante de la protéine Bcl-xL est la présence d'un domaine en boucle non-structurée entre les hélices α1 and α2 de la protéine. Ce domaine protéique n'est pas essentiel pour sa fonction anti-apoptotique et absent chez CED-9, la protéine orthologue chez Caenorhabditis elegans. A l'intérieur de ce domaine, Bcl-xL subit une phosphorylation et déphosphorylation dynamique sur les résidus Ser49 et Ser62 en phase G2 du cycle cellulaire et lors de la mitose. Lorsque ces résidus sont mutés et les protéines exprimées dans des cellules cancéreuses, les cellules démontrent plusieurs défauts mitotiques liés à l'instabilité chromosomique. Pour analyser les effets de Bcl-xL Ser49 et Ser62 dans les cellules normales, les présentes études ont été réalisées dans des cellules diploïdes humaines normales, et in vivo chez Caenorhabditis elegans. Dans une première étude, nous avons utilisé la lignée cellulaire de cellules fibroblastiques diploïdes humaines normales BJ, exprimant Bcl-xL (type sauvage), (S49A), (S49D), (S62A), (S62D) et les double (S49/62A) et (S49/62D) mutants. Les cellules exprimant les mutants de phosphorylation ont montré des cinétiques de doublement de la population cellulaire réduites. Ces effets sur la cinétique de doublement de la population cellulaire corrèle avec l'apparition de la sénescence cellulaire, sans impact sur les taux de mort cellulaire. Ces cellules sénescentes affichent des phénotypes typiques de sénescence associés notamment à haut niveau de l'activité β-galactosidase associée à la sénescence, la sécrétion d' interleukine-6, l'activation de p53 et de p21WAF1/ Cip1, un inhibiteur des complexes kinase cycline-dépendant, ainsi que la formation de foyers de chromatine nucléaire associés à γH2A.X. Les analyses de fluorescence par hybridation in situ et des caryotypes par coloration au Giemsa ont révélé que l'expression des mutants de phosphorylation de Bcl-xL provoquent de l'instabilité chromosomique et l'aneuploïdie. Ces résultats suggèrent que les cycles de phosphorylation et déphosphorylation dynamiques de Bcl-xL Ser49 et Ser62 sont importants dans le maintien de l'intégrité des chromosomes lors de la mitose dans les cellules normales. Dans une deuxième étude, nous avons entrepris des expériences chez Caenorhabditis elegans pour comprendre l'importance des résidus Ser49 et Ser62 de Bcl-xL in vivo. Les vers transgéniques portant les mutations de Bcl-xL (S49A, S62A, S49D, S62D et S49/62A) ont été générés et leurs effets ont été analysés sur les cellules germinales des jeunes vers adultes. Les vers portant les mutations de Bcl-xL ont montré une diminution de ponte et d'éclosion des oeufs, des variations de la longueur de leurs régions mitotiques et des zones de transition, des anomalies chromosomiques à leur stade de diplotène, et une augmentation de l'apoptose des cellules germinales. Certaines de ces souches transgéniques, en particulier les variants Ser/Ala, ont également montré des variations de durée de vie par rapport aux vers témoins. Ces observations in vivo ont confirmé l'importance de Ser49 et Ser62 à l'intérieur du domaine à boucle de Bcl-xL pour le maintien de la stabilité chromosomique. Ces études auront une incidence sur les futures stratégies visant à développer et à identifier des composés qui pourraient cibler non seulement le domaine anti-apoptotique de la protéine Bcl-xL, mais aussi son domaine mitotique pour la thérapie du cancer.

Développement de matériaux à base de protéines extraites du byssus de la moule bleue Mytilus edulis

Le byssus est un amas de fibres que les moules produisent afin de s’ancrer aux surfaces immergées sous l’eau. Ces fibres sont pourvues de propriétés mécaniques impressionnantes combinant rigidité, élasticité et ténacité élevées. De plus, elles possèdent un comportement d’auto-guérison de leurs propriétés mécaniques en fonction du temps lorsque la contrainte initialement appliquée est retirée. Les propriétés mécaniques de ces fibres sont le résultat de l’agencement hiérarchique de protéines de type copolymère blocs riches en collagène et de la présence de métaux formant des liens sacrificiels réversibles avec certains acides aminés comme les DOPA et les histidines. Bien que cette fibre soit très intéressante pour la production de matériaux grâce à son contenu élevé en collagène potentiellement biocompatible, cette ressource naturelle est traitée comme un déchet par les mytiliculteurs. L’objectif de cette thèse était de valoriser cette fibre en extrayant les protéines pour générer une nouvelle classe de matériaux biomimétiques. Un hydrolysat de protéines de byssus (BPH) riche en acides aminés chargés, i.e. ~30 % mol, et permettant de former des films a pu être généré. Lorsque solubilisé à pH 10.5, le BPH forme un hydrogel contenant des structures en triple hélice de collagène et des feuillets β anti-parallèles intra- et inter-moléculaires. Suite à l’évaporation de l’eau, le film de BPH résultant est insoluble en milieu aqueux à cause des structures secondaires très stables agissant comme points de réticulation effectifs. Les propriétés mécaniques des films de BPH sont modulables en fonction du pH. Au point isoélectrique (pI = 4.5), les interactions électrostatiques entre les charges opposées agissent comme points de réticulation et augmentent la rigidité des films et leur contrainte à la rupture sans affecter la déformation à la rupture. À pH plus élevé ou plus bas que le pI, les performances mécaniques des films sont plus faibles à cause de la répulsion entre les groupements fonctionnels de même charge qui interagissent plutôt avec les molécules d’eau et causent le gonflement de la matrice protéique des films. Le BPH contenant un nombre élevé d’acides aminés chargés et réactifs, nous avons pu réticuler les films de manière covalente à l’aide d’EDC ou de glutaraldéhyde. Les propriétés mécaniques des films sont modulables en fonction de la concentration d’EDC utilisée lors de la réticulation ou en employant du glutaraldéhyde comme agent réticulant. Les films sont à la fois plus rigides et plus forts avec un degré de réticulation élevé, mais perdent leur extensibilité à mesure que les segments libres de s’étirer lors d’une traction deviennent entravés par les points de réticulation. La réticulation augmente également la résistance à la dégradation enzymatique par la collagénase, les films les plus fortement réticulés lui étant pratiquement insensibles. La spectroscopie infrarouge montre enfin que la réticulation entraîne une transition de feuillets β anti-parallèles inter-moléculaires vers des structures de type hélices de collagène/PPII hydratées. Des liens sacrificiels ont été formés dans les films de BPH par traitement au pI et/ou avec différents métaux, i.e. Na+, Ca2+, Fe3+, afin de moduler les propriétés mécaniques statiques et d’évaluer le rôle de ces traitements sur le comportement d’auto-guérison lors de tests mécaniques cycliques avec différents temps de repos. Plus la valence des ions métalliques ajoutés augmente, plus les propriétés mécaniques statiques affichent un module, une contrainte à la rupture et une ténacité élevés sans toutefois affecter la déformation à la rupture, confirmant la formation de liens sacrificiels. Les tests mécaniques cycliques montrent que les traitements au pI ou avec Ca2+ créent des liens sacrificiels ioniques réversibles qui mènent à un processus d’auto-guérison des performances mécaniques dépendant du pH. L’ajout de Fe3+ à différentes concentrations module les performances mécaniques sur un plus large intervalle et la nature plus covalente de son interaction avec les acides aminés permet d’atteindre des valeurs nettement plus élevées que les autres traitements étudiés. Le Fe3+ permet aussi la formation de liens sacrificiels réversibles menant à l’auto-guérison des propriétés mécaniques. Les spectroscopies Raman et infrarouge confirment que le fer crée des liaisons avec plusieurs acides aminés, dont les histidines et les DOPA. Les résultats dans leur ensemble démontrent que les films de BPH sont des hydrogels biomimétiques du byssus qui peuvent être traités ou réticulés de différentes façons afin de moduler leurs performances mécaniques. Ils pourraient ainsi servir de matrices pour des applications potentielles dans le domaine pharmaceutique ou en ingénierie tissulaire.

Étude des voies de signalisation activées par la prostaglandine F2α dans les cellules de cancer colorectal

Le cancer colorectal représente la troisième forme de cancer la plus fréquente au Canada. Malgré les récents développements, aucun traitement curatif n’est disponible pour les patients diagnostiqués à un stade avancé de la maladie. Plusieurs évidences supportent un rôle important des prostaglandines dans cette maladie. En effet, une surexpression des récepteurs de type EP et FP est remarquée. Ces derniers ainsi que les molécules de signalisations intracellulaires qu’ils activent représentent donc de nouvelles cibles pour traiter ce cancer. Nous et d’autres groupes avons démontré que les protéines G monomériques sont des petits interrupteurs moléculaires importants dans la signalisation intracellulaire engagée par les récepteurs dans des cellules saines mais qu’un dérèglement de celles-ci est associé au cancer. L’objectif principal de ce projet de recherche vise donc à identifier les voies de signalisations par lesquelles le récepteur FP contribue aux capacités invasives des cellules tumorales d’origine colorectale. Notre hypothèse est que la protéine ARF6, une des 6 isoformes des ARFs, et la protéine RhoA, agissent pour coordonner l’activation des voies de signalisations associées à la migration et l’invasion cellulaire. Nos résultats ont indiqué que la stimulation des cellules HEK293 exprimant de façon stable le récepteur FP (HA-FP) ainsi que les cellules SW480, une lignée invasive de cancer colorectal, par le PGF2α augmentait les niveaux d’activation d’ARF6 mais également de la protéine RhoA. De plus, d’autres médiateurs et intermédiaires associés à la réorganisation du cytosquelette comme la cofiline et la chaine légère de la myosine (MLC) ont été hautement phosphorylés suite à la stimulation par la prostaglandine. Ces observations sont associées avec une augmentation des fibres de stress dans les cellules. Nous avons tenté de déterminer si l’inhibition de ces protéines G affectait la capacité du PGF2α à activer ces intermédiaires de signalisation ainsi que certains effets biologiques. Ainsi, nos expériences contribueront à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement du cancer colorectal.

Caractérisation des structures de septines hautement organisées chez la drosophile et leur interaction avec le cytosquelette d’actine

Les septines sont des GTPases conservées dérégulées dans le cancer et les maladies neurodégénératives. Elles servent de protéines d’échafaudage et forment une barrière de diffusion à la membrane plasmique et au corps central lors de la cytokinèse. Elles interagissent avec l’actine et s’organisent en complexes qui polymérisent et forment des structures hautement organisées (anneaux et filaments). Leur dynamique d’assemblage et leur rôle dans la cellule restent à être élucidés. La Drosophile est un modèle simple pour l’étude des septines puisqu’on n’y retrouve que 5 gènes (sep1, sep2, sep4, sep5, peanut) comparativement aux 13 gènes chez l’humain. À l’aide d’un anticorps contre Pnut, nous avons identifié des structures tubulaires dans 30% des cellules S2 de Drosophile. Mon projet a comme but de caractériser ces tubes en élucidant leurs constituants, leur comportement et leurs propriétés pour mieux clarifier le mécanisme par lequel les septines forment des structures hautement organisées et interagissent avec le cytosquelette d’actine. Par immunofluorescence, j’ai pu démontrer que ces tubes sont cytoplasmiques, en mitose ou interphase, ce qui suggère qu’ils ne sont pas régulés par le cycle cellulaire. Pour investiguer la composition et les propriétés dynamiques de ces tubes, j’ai généré une lignée cellulaire exprimant Sep2-GFP qui se localise aux tubes et des ARNi contre les cinq septines. Trois septines sont importantes pour la formation de ces tubes et anneaux notamment Sep1, Sep2 et Pnut. La déplétion de Sep1 cause la dispersion du signal GFP en flocons, tandis que la déplétion de Sep2 ou de Pnut mène à la dispersion du signal GFP uniformément dans la cellule. Des expériences de FRAP sur la lignée Sep2-GFP révèlent un signal de retour très lent, ce qui indique que ces structures sont très stables. J’ai aussi démontré une relation entre l’actine et les septines. Le traitement avec la Latrunculin A (un inhibiteur de la polymérisation de l’actine) ou la Jasplakinolide (un stabilisateur des filaments d’actine) mène à la dépolymérisation rapide (< 30 min) des tubes en anneaux flottants dans le cytoplasme, même si ces tubes ne sont pas reconnus suite à un marquage de la F-actine. L’Actin05C-mCherry se localise aux tubes, tandis que le mutant déficient de la polymérisation, Actin05C-R62D-mCherry perd cette localisation. On observe aussi que la déplétion de la Cofiline et de l’AIP1 (ce qui déstabilise l’actine) mène au même phénotype que le traitement avec la Latrunculine A ou la Jasplakinolide. Alors on peut conclure qu’un cytosquelette d’actine dynamique est nécessaire pour la formation et le maintien des tubes de septines. Les futures études auront comme but de mieux comprendre l’organisation des septines en structures hautement organisées et leur relation avec l’actine. Ceci sera utile pour l’élaboration du réseau d’interactions des septines qui pourra servir à expliquer leur dérégulation dans le cancer et les maladies neurodégénératives.