790 resultados para signalisation cellulaire
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Ces travaux visent tendre les applications de la rsonance de plasmons de surface (SPR) Lobjectif est doffrir des outils diagnostics plus rapides, efficaces et simple dutilisation pour diagnostiquer ou effectuer le suivi de conditions cliniques. Pour se faire, un nouveau type dinstrumentation SPR bas sur lutilisation dun prisme dinversion (dove) a permis datteindre une limite de dtection (LOD) de 10-6 unit dindice de rfraction (RIU), une valeur comparable aux instruments commerciaux complexes tout en demeurant peu dispendieux, robuste et simple dutilisation. Les travaux prsents dans cet ouvrage visent, dans un second temps, rduire les interactions nonspcifiques (NSB) entre la surface des biocapteurs SPR et les composants de la matrice biologique complexe telles que: lurine, le lysat cellulaire, le srum et le sang. Ces dernires induisent des rponses empchant lutilisation de biocapteurs SPR en milieux complexes. Les acides amins (AA) offrent une grande varit de proprits physico-chimiques permettant la mise au point de monocouches auto-assembles (SAM) aux proprits diverses. Initialement, 19 des 20 acides amins naturels ont t attachs lacide 3-mercaptopropionique (3-MPA) formant des SAMs peptidomimtiques. La quantit dinteractions nonspcifiques engendres par ces diffrentes surfaces a t mesure en exposant ces surfaces au srum sanguin bovin complet variant de 400 ng/cm jusqu 800 ng/cm. La dtection laide de ces surfaces de la -lactamase (une enzyme responsable de la rsistance aux antibiotiques au niveau M) a dmontr la possibilit demployer ces surfaces pour btir des biocapteurs SPR. Des peptides de longueur allant de 2 5 rsidus attachs 3-MPA ont t synthtiss sur support solide. Cette tude a dmontr que laugmentation de la longueur des peptides forms dAA rsistants aux NBS accroit leur rsistance jusqu 5 rsidus. Le compos le plus performant de ce type (3-MPA-(Ser)5-OH) a permis datteindre 180 ng/cm. Cette valeur est similaire celle des meilleures surfaces disponibles commercialement, notamment les surfaces de polyethylne glycol (PEG) 100 ng/cm. Des surfaces de 3-MPA-(Ser)5-OH ont permis ltalonnage de la -lactamase et sa quantification directe dans un lysat cellulaire. La LOD pour ces biocapteurs est de 10 nM. Une troisime gnration de surfaces peptidiques binaires a permis la rduction de la NSB jusqu un niveau de 2310 ng/cm une valeur comparable aux meilleures surfaces disponibles. Ces surfaces ont permis ltalonnage dun indicateur potentiel du cancer la metalloprotinase-3 de matrice (MMP-3). Les surfaces formes de peptides binaires (3-MPA-H3D2-OH) ont permis la quantification directe de la MMP-3 dans le srum sanguin complet. Une quatrime gnration de surfaces peptidiques a permis de rduire davantage le niveau de NSB jusqu une valeur de 12 11 ng/cm. Ces surfaces ont t modifies en y attachant une terminaison de type acide nitriloactique (NTA) afin dy attacher des biomolcules marques par six rsidus histidines terminaux. Ces surfaces ont permis le dveloppement dune mthode rapide de balayage des ligands ciblant le cluster of differenciation-36 (CD36). Ltude dlectroformation des monocouches de peptide a permis de dterminer les conditions de formation optimales dune couche de 3-MPA-HHHDD-OH permettant ainsi la formation de monocouches rsistantes au NSB en moins de 6 minutes en appliquant un potentiel de formation de 200mV vs Ag/AgCl.
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La raction du greffon contre lhte (GvH) est responsable dun grand taux de morbidit et de mortalit chez les patients recevant des greffes de cellules souches (GCSH) allogniques. Dans ce contexte, les cellules T rgulatrices sont largement tudies et semblent avoir un grand potentiel dutilisation dans le domaine de la thrapie cellulaire de la GvH. Parmi les populations cellulaires T rgulatrices, les lymphocytes T CD4-CD8- TCR+ Doubles-Ngatifs (DN), qui ne reprsentent que 1-3% des lymphocytes T, ont t dcrits. Ces cellules ont des proprits inhibitrices de la rponse immunitaire qui savrent spcifiques aux antignes auxquels elles ont pralablement t exposes. La rpression de la rponse immunitaire par les cellules T DN rgulatrices semble tre un mcanisme important impliqu dans linduction de la tolrance aux allo-antignes. De plus, ces cellules confrent une tolrance immunitaire dans des modles de greffes allogniques et xnogniques. En effet, ces cellules ont la capacit dinhiber la raction contre un allo-antigne auquel elles ont t exposes, sans inhiber la raction contre un allo-antigne inconnu. Les cellules T DN ont t isoles et caractrises chez lhomme o elles ont la capacit dinteragir avec des cellules prsentatrices dantignes (APCs) par un contact cellulaire, comme chez la souris. Cependant, leur capacit immunomodulatrice reste inconnue chez lhumain. Notre objectif consistait donc principalement tudier le rle et le mcanisme daction des cellules T DN rgulatrices humaines in vitro, en tudiant leur capacit inhiber une raction lymphocytaire mixte (MLR). Nous avons montr que les cellules T DN stimules par un allo-antigne donn inhibent des cellules syngniques effectrices diriges contre ce mme alloantigne mais ninhibent pas des cellules syngniques effectrices diriges contre un autre alloantigne, dmontrant ainsi la spcificit aux antignes de ces cellules. De plus, les T DN non stimules par un allo-antigne nont pas de rle inhibiteur. Cependant, durant cette inhibition, nous nobservons pas de modulation de lexpression des marqueurs dactivation et dinduction de lapoptose. Afin dtudier le mcanisme daction des cellules T DN, nous avons mesur lexpression intracellulaire de la granzyme B. Les rsultats dmontrent que les cellules T DN stimules expriment un niveau significativement plus lev de granzyme B que les cellules T DN non-stimules par lallo-antigne. Ceci suggre que limmunosuppression induite par les cellules T DN stimules pourrait passer par la voie granzyme B. Le mcanisme utilis par ces cellules reste tre confirm par nos futures expriences.
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Lapproche Module X a t cre dans le but de concevoir de petits peptides modulateurs ayant des proprits allostriques. Module X reproduit de petites parties des portions extracellulaires flexibles des rcepteurs. Ces petits peptides vont interagir en sinterposant entre deux sous units ou entre deux rgions de la mme sous-unit qui interagissent par des liens hydrognes, des ponts salins ou des liens disulfure. Ces rgions sont spcialement choisies lextrieur du domaine de liaison du ligand orthostrique et sont situes dans les rgions inter domaines, la portion juxta membranaire ou dans les boucles. tant donn que les boucles sont exposes durant les changements de conformation, une squence peptidique reproduisant certaines rgions de ces boucles pourrait sinsrer un endroit appropri dans la structure o se lier son partenaire de signalisation dans le complexe protique, ce qui aurait comme effet de dplacer lquilibre de lensemble vers un tat particulier et modulerait ainsi la signalisation. De cette faon, certaines voies de signalisation pourraient tre partiellement inhibes tandis que dautres voies ne seraient pas touches puisque le ligand orthostrique pourrait toujours se lier au rcepteur. Dans une premire tude, nous avons conu des peptides inhibiteurs du rcepteur de linterleukine 1 (IL-1R/IL-1RAcP) plus prcisment en reproduisant des rgions flexibles de la protine accessoire, sous-unit signalisatrice du rcepteur. IL-1 est un mdiateur majeur de linflammation, mais le seul antagoniste disponible est lanalogue naturel de IL-1, IL-1Ra qui comptitionne avec IL-1 pour le site de liaison sur le rcepteur. Nous avons conu plusieurs peptides partir des boucles de la protine accessoire. Un de ces peptides, rytvela (101.10) a dmontr des proprits de non-comptitivit et de slectivit fonctionnelle caractristiques des modulateurs allostriques. 101.10 bloque la prolifration des thymocytes et la synthse de PGE2 avec un IC50 de 1 nM mais une efficacit de 100 % et 45 % respectivement et ne dplace pas IL-1 radioactif dans des essais de radioliaisons. De plus, 101.10 na quun effet minime sur laffinit de IL-1 pour son rcepteur. 101.10 dmontre, de plus, une activit inhibitrice in vivo dans des modles dinflammation de lintestin chez le rat (efficacit suprieure aux corticostrodes et IL-1Ra) et de dermatite chez la souris de mme que dans un modle dhyperthermie induite par IL-1. La deuxime tude dmontre que Module X peut tre utilis pour concevoir des inhibiteurs pour une autre grande famille de rcepteurs : les rcepteurs coupls aux protines G. La vasopressine joue un rle important dans lquilibre hydro-osmotique et un moindre rle dans la vasomotricit. Six peptides ont t conus partir de rgions juxta membranaires du rcepteur de la vasopressine V2R. Le peptide le plus actif, VRQ397 (IC50 = 0,69 nM dans un modle de vasorelaxation du crmastre), a dmontr de la slectivit fonctionnelle en inhibant la synthse de prostacycline mais sans inhiber lactivation de la protine Gs et la gnration d AMP cyclique. Le peptide VRQ397 ne pouvait dplacer le ligand naturel AVP marqu radioactivement; de mme VRQ397 radioactif ne se liait que sur V2R et non pas sur dautres rcepteurs de la mme famille tel que V1R (rcepteur de la vasopressine de type I). Ces tudes dcrivent la caractrisation de petits peptides modulateurs de la signalisation de IL-1R et V2R et prsentant des proprits de modulateurs allostriques.
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La maladie de Crohn (MC) et la colite ulcreuse (CU) sont des maladies inflammatoires chroniques du tube digestif quon regroupe sous le terme maladies inflammatoires de lintestin (MII). Les mcanismes molculaires menant au dveloppement des MII ne sont pas entirement connus, mais des tudes gntiques et fonctionnelles ont permis de mettre en vidence des interactions entre des prdispositions gntiques et des facteurs environnementaux - notamment la flore intestinale qui contribuent au dveloppement dune drgulation de la rponse immunitaire menant linflammation de la muqueuse intestinale. Des tudes dassociation pangnomiques et cibles ont permis didentifier plusieurs gnes de susceptibilit aux MII mais les estimations de la contribution de ces gnes lhritabilit suggrent que plusieurs gnes restent dcouvrir. Certains dentre eux peuvent se trouver dans les rgions identifies par des tudes de liaison gntique. Lobjectif de mon projet de doctorat tait didentifier un ou des facteurs de risque gntique dans la rgion chromosomale 19p (identifie comme rgion de liaison IBD6) et de le/les caractriser au niveau fonctionnel. Nous avons dabord entrepris une cartographie dassociation de la rgion 19p. la suite du gnotypage successif de deux cohortes indpendantes, nous avons identifi un SNP intronique et quatre SNP codants dont un non-synonyme, rs8108738, tous localiss dans le gne microtubule associated serine threonine kinase gene-3 (MAST3) et associs aux MII. Peu dinformation fonctionnelle sur MAST3 tait disponible. Par contre MAST2, une protine encode par un gne de la mme famille, rgule lactivit du facteur de transcription inflammatoire NF-kappaB. Nous avons confirm limplication de MAST3 dans lactivit de NF-kappaB via un knockdown de MAST3 et des essais gne-rapporteur. Pour poursuivre la caractrisation fonctionnelle de MAST3, nous avons choisi une approche non cible pour tudier les effets de la variation des niveaux dexpression de MAST3 sur la cellule. Cest--dire que nous avons cr un 1er modle cellulaire de surexpression du gne MAST3 dans les cellules HEK293 et analys lexpression pangnomique endogne. La validation de lexpression gnique dans un 2e modle cellulaire de knockdown et de type cellulaire diffrent (THP1), nous a permis didentifier et de contrer les effets non-spcifiques dus aux niveaux non-physiologiques. Notre tude dexpression a men lidentification dun groupe de gnes dont lexpression est rgule par MAST3. Ces gnes sont majoritairement impliqus dans des fonctions immunitaires (cytokines pro-inflammatoires, rgulateurs de NF-kappaB, migration cellulaire, etc.) et une forte proportion est rgule par NF-kappaB. Nous avons valu limportance du groupe de gnes rguls par MAST3 dans la prsentation clinique des MII travers des tudes dexpression dans des biopsies intestinales de patients atteints de CU. Nous avons constat que lexpression de ces gnes est significativement suprieure dans les rgions enflammes par rapport aux rgions saines de la muqueuse intestinale des patients atteints de CU. Globalement, les rsultats de nos tudes suggrent que le facteur de risque aux MII MAST3 agit via la voie du facteur de transcription NF-kappaB pour influencer lexpression dun groupe de gnes impliqus dans linflammation intestinale typique des MII. Chaque tude gntique sur les MII a le potentiel dorienter les recherches fonctionnelles vers de nouvelles voies biologiques causales. Le dvoilement des mcanismes molculaires sous-jacents ces voies permet daugmenter les connaissances sur le dveloppement de ces maladies vers une comprhension plus complte de la pathogense qui permettra doptimiser le diagnostic et le traitement de ces maladies.
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La rgulation transcriptionnelle des gnes est cruciale pour permettre le bon fonctionnement des cellules. Afin que les cellules puissent accomplir leurs fonctions, les gnes doivent tre exprims adquatement dans le bon type cellulaire et au stade de dveloppement et de diffrenciation appropri. Un drglement dans lexpression de un ou plusieurs gnes peut entraner de graves consquences sur le destin de la cellule. Divers lments en cis (ex : promoteurs et enhancers) et en trans (machinerie transcriptionnelle et facteurs de transcription) sont impliqus dans la rgulation de la transcription. Les gnes du locus humain beta-globine (hub) sont exprims dans les cellules rythrodes et sont finenement rguls lors du dveloppement et de la diffrenciation. Des mutations dans diffrentes rgions du locus causent entre autres les beta-thalassmies. Nous avons utilis ce modle bien caractris afin dtudier diffrents mcanismes de rgulation favoriss par les facteurs de transcription qui sont exprims dans les cellules rythrodes. Nous nous sommes intresss limportance de llment en cis HS2 du Locus control region. Cet lment possde plusieurs sites de liaison pour des facteurs de transcription impliqus dans la rgulation des gnes du locus hub. Nos rsultats montrent que HS2 possde un rle dans lorganisation de la chromatine du locus qui peut tre dissoci de son rle denhancer. De plus, HS2 nest pas essentiel pour lexpression haut niveau du gne beta alors quil est important pour lexpression des gnes gamma. Ceci suggre que le recrutement des diffrents facteurs au site HS2 lors du dveloppement influence diffrement les gnes du locus. Dans un deuxime temps, nous avons investigu limportance de HS2 lors de la diffrenciation des cellules rythrodes. Il avait t rapport que labsence de HS2 influence grandement la potentialisation de la chromatine du gne beta. La potentialisation dans les cellules prognitrices favorise lactivation transcriptionnelle du gne dans les cellules matures. Nous avons caractris le recrutement de diffrents facteurs de transcription au site HS2 et au promoteur beta dans les cellules prognitrices hmatopotiques (CPH) ainsi que dans les cellules rythrodes matures. Nos rsultats montrent que le facteur EKLF est impliqu dans la potentialisation de la chromatine et favorise le recrutement des facteurs BRG1, p45 et CBP dans les CPH. Lexpression de GATA-1 dans les cellules rythrodes matures permet le recrutement de GATA-1 au locus hub dans ces cellules. Ces donnes suggrent que la combinaison de EKLF et GATA-1 est requise pour permettre une activation maximale du gne beta dans les cellules rythrodes matures. Un autre facteur impliqu dans la rgulation du locus hub est Ikaros. Nous avons tudi son recrutement au locus hub et avons observ que Ikaros est impliqu dans la rpression des gnes gamma. Nos rsultats montrent aussi que GATA-1 est impliqu dans la rpression de ces gnes et quil interagit avec Ikaros. Ensemble, Ikaros et GATA-1 favorisent la formation dun complexe de rpression aux promoteurs gamma. Cette tude nous a aussi permis dobserver que Ikaros et GATA-1 sont impliqus dans la rpression du gne Gata2. De faon intressante, nous avons caractris le mcanisme de rpression du gne Hes1 (un gne cible de la voie Notch) lors de la diffrenciation rythrode. Similairement ce qui a t observ pour les gnes gamma, Hes1 est aussi rprim par Ikaros et GATA-1. Ces rsultats suggrent donc que la combinaison de Ikaros et GATA-1 est associe la rpression de plusieurs de gnes dans les cellules rythrodes. Globalement cette thse rapporte de nouveaux mcanismes daction de diffrents facteurs de transcription dans les cellules rythrodes. Particulirement, nos travaux ont permis de proposer un modle pour la rgulation des gnes du locus hub lors du dveloppement et de la diffrenciation. De plus, nous rapportons pour la premire fois limportance de la collaboration entre les facteurs Ikaros et GATA-1 dans la rgulation transcriptionnelle de gnes dans les cellules rythrodes. Des mutations associes certains des facteurs tudis ont t rapportes dans des cas de beta-thalassmies ainsi que de leucmies. Nos travaux serviront donc avoir une meilleure comprhension des mcanismes daction de ces facteurs afin de potentiellement pouvoir les utiliser comme cibles thrapeutiques.
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Le stress oxydant joue un rle majeur dans le dveloppement et lvolution des maladies inflammatoires de lintestin. Le corps humain est dot dune panoplie denzymes antioxydantes ayant pour fonction de protger lintgrit cellulaire. De nouvelles enzymes au fort potentiel antioxydant, les paraoxonases (PON) 1, 2 et 3, ont rcemment t identifies tout au long du tube digestif, mais leurs rles y restent inconnus. Les cellules intestinales Caco-2/15, qui ont la capacit de se diffrencier et dacqurir les caractristiques physiologiques de l'intestin grle, ont t utilises dans le prsent travail pour tudier la rgulation des PON. Les cellules ont t traites avec diffrents effecteurs physiologiques (cytokines, LPS, stress oxydant) et pharmacologiques (fibrates, thiazolidindiones) et lexpression des leurs gnes et protines a t value. Les rsultats ont mis en lumire la modulation distincte de lexpression des PON par le stress oxydant et linflammation. Ceci suggre que chaque PON peut jouer un rle diffrent au niveau intestinal et tre implique dans le maintien de lhomostasie. La rgulation de lexpression des PON a galement t largement explore dans un article de revue. Pour dfinir le rle de PON2, celle-ci tant potentiellement la plus importante pour lhomostasie intestinale, les cellules Caco-2/15 ont t infectes laide de lentivirus contenant des ARN dinterfrence, ce qui a fortement rduit lexpression de PON2. En labsence de PON2, les cellules Caco-2/15 taient plus susceptibles face un stress oxydant, la rponse inflammatoire tait exacerbe et la permabilit cellulaire paraissait altre. Toutes ces composantes sont majeures dans le dveloppement des maladies inflammatoires de lintestin chez lhumain. De plus, des cellules Caco-2/15 de la PON2, ce qui a renforc la force de la dfense antioxydante cellulaire. Les rsultats suggrent que les PON jouent un rle dans le maintien de lhomostasie intestinale et pourraient tre impliques dans ltiologie et la pathogense des maladies inflammatoires de lintestin.
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La transplantation allognique de cellules souches hmatopotiques est une technique trs efficace pour traiter diffrents cancers du sang. Malheureusement la raction du greffon contre lhte (GVHD) demeure la cause principale de morbidit et de mortalit post-greffe. La GVHD entrane une diminution de la reconstitution immunitaire ce qui accentue considrablement limmunosuppression associe ce traitement et de ce fait augmente les risques dinfection et de rechute. Notre laboratoire a dmontr prcdemment que les niveaux levs dIL-7 dans des htes lymphopniques interfraient avec la capacit des cellules dendritiques (DC) soutenir la prolifration homostatique (PH) des lymphocytes T CD4+. Puisque les niveaux dIL-7 sont aussi levs dans un contexte de GVHD, nous avons mis lhypothse que la signalisation de lIL-7 sur les DC pouvait contribuer diminuer la reconstitution immunitaire des lymphocytes T CD4+. Pour rpondre cette question, nous avons utilis le modle murin de GVHD C57BL/6 (B6) dans B6D2F1. Afin de rgnrer une niche hmatopotique permissive la PH des lymphocytes T CD4+, nous avons transplant des souris B6D2F1 avec de la moelle osseuse de souris B6 IL-7R-/-. La GVHD a t induite en transfrant des lymphocytes T B6 ractifs aux cellules B6D2F1. Dans les souris contrles, la PH des lymphocytes T CD4+ est maintenue. Par contre, la PH est absente dans les souris en GVHD malgr la prsence dune niche priphrique qui ne rpond pas lIL-7. Labsence de PH des lymphocytes T CD4+ durant la GVHD est associe une diminution du nombre de DC. En utilisant un test de cytotoxicit in vivo nous dmontrons que les DC B6 gnres dans une hte B6D2F1 sont limines par les lymphocytes T B6 alloractifs. En conclusion, nos rsultats dmontrent que limmunosuppression associe la GVHD est en partie cause par une limination des DC par les lymphocytes T allogniques. Nous postulons donc que la perte des DC, et non la signalisation de lIL-7 sur les DC, est le facteur limitant la PH des lymphocytes T CD4+ durant la GVHD.
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Introduction : Les enfants prmaturs ont la particularit de natre alors que leur dveloppement est souvent incomplet et ncessite la mise en uvre de soins intensifs visant poursuivre leur croissance en dehors de lenvironnement utrin. Souvent cependant, le stade dveloppemental de lenfant ne lui permet pas dassimiler une alimentation entrale du fait de limmaturit de son systme digestif. Le recours une voie centrale dlivrant les nutriments assurant le dveloppement devient alors une ncessit. Ce type de nutrition, appele nutrition parentrale (NP, ou total parenteral nutrition TPN), permet ladministration de molcules simples, directement dans le sang du prmatur. Il nest toutefois pas exempt de risques puisquexpose la lumire, la NP peut soxyder et gnrer des molcules oxydantes telles que des hydroperoxydes lipidiques susceptibles de se fragmenter par la suite en hydroxy-alknals. Ceci devient problmatique au vu de limmaturit des systmes de dfenses antioxydants du nouveau-n prmatur. Lutilisation prolonge de la NP est dailleurs lorigine de maladie hpatiques dans lesquelles le stress oxydant et la ncro-inflammation sont des composantes majeures. Nous avons mis lhypothse que linfusion chez les enfants prmaturs, daldhydes dorigine lipidique est en relation avec le dveloppement du stress oxydant et de linflammation hpatique. Objectif : Notre tude a consist valuer la relation entre les quantits dhydroxy-alknals dans la NP et les effets hpatiques engendrs sur les marqueurs de stress oxydant et les voies de signalisation responsables dune induction de processus inflammatoire. Dans ce but, nous avons cherch mesurer la peroxydation lipidique dans lmulsion lipidique de la NP et la consquence de linfusion en continue dhydroxy-alknals sur les marqueurs de stress oxydant, sur la voie de signalisation mdie par le Nuclear Factor B et sur le dclenchement du processus inflammatoire hpatique. A la suite de ce travail, nous avons galement travaill sur des alternatives la photoprotection, qui est la seule mthode rellement optimale pour rduire la peroxydation des lipides de la NP, mais cliniquement difficilement praticable. Rsultats : Nos rsultats ont mis en vidence la gnration de 4-hydroxynonenal in vitro dans la NP, ce phnomne est augment par une exposition lumineuse. Dans ce cadre, nous avons montr linefficacit de lajout de multivitamines dans lmulsion lipidique comme alternative la photoprotection. Dans la validation biologique qui a suivi sur un modle animal, nos rsultats ont permis de dmontrer que laugmentation des adduits glutathion-hydroxynonenal tait imputable laugmentation de 4-hydroxynonenal (4-HNE) dans la NP, et non une peroxydation endogne. Nos donnes indiquent que la probable augmentation hpatique des niveaux de 4-HNE a conduit une activation du NFB responsable de lactivation de la transcription des gnes pro-inflammatoires du Tumour Necrosis Factor- (TNF-) et de linterleukine-1 (IL-1). Nous avons alors valu la capacit dune mulsion lipidique enrichie en acides gras polyinsaturs (AGPI) n-3 baisser les concentrations de 4-HNE dans la NP, mais galement moduler le stress oxydant et les marqueurs pro-inflammatoires. Enfin, nous avons dmontr, en collaboration avec lquipe du Dr Friel, que certains peptides isols du lait humain (par un processus mimant la digestion) permettent galement une modulation du stress oxydant et du processus inflammatoire. Conclusion : Le stress oxydant exogne issu de la NP a conduit par activation de facteurs de transcription intra-hpatiques au dclenchement dun processus inflammatoire potentiellement responsable du dveloppement de maladies hpatiques relies la NP telle que la cholestase. Dans ce sens, les AGPI n-3 et les peptides antioxydants peuvent se poser en tant qualternatives crdibles la photoprotection.
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Dans les cellules somatotropes, la liaison du facteur de libration de lhormone de croissance (GHRH) son rcepteur (GHRH-R) stimule la synthse et la scrtion de lhormone de croissance (GH) ainsi que la prolifration cellulaire. Chez les mammifres, le vieillissement est caractris par une diminution de la scrtion de GH, lie une perte de sensibilit des somatotropes au GHRH. Chez le rat g, des modifications de niveaux d'ARNm du GHRH-R et une diminution d'affinit et de capacit de liaison du GHRH sont rapports. Au cours du vieillissement, une augmentation des niveaux de glucose et dacides gras libres srique suggre quune gluco- ou lipotoxicit puisse contribuer au dysfonctionnement de la fonction somatotrope. ce jour, la restriction calorique modre de longue dure (RCMLD) constitue lintervention la plus efficace pour prvenir ou retarder les dtriorations lies lge. Des tudes ont montr des effets bnfiques de la RCMLD sur laxe somatotrope au cours du vieillissement via un maintien des paramtres de liaison du GHRH-R. Compte tenu de limportance de cet axe, la comprhension des mcanismes menant la somatopause ainsi que ceux associs aux effets bnfiques de la RCMLD savre importante. Les objectifs principaux de la prsente thse taient : 1) de dterminer les effets de la RCMLD chez le rat, sur le GHRH-R hypophysaire et la sensibilit des somatotropes au GHRH, 2) didentifier les mcanismes associs la somatopause et aux effets bnfiques de la RCMLD, et 3) de prciser les effets dune gluco-ou lipotoxicit sur laxe somatotrope de rats et leur implication dans la somatopause. Des rats de 8 mois ont t soumis une restriction calorique de 40% jusqu lge de 18-20 mois et ont t compars des rats jeunes et gs nourris ad libitum. Cette tude a permis de mettre en vidence des effets bnfiques de la RCMLD sur la rgulation et la fonctionnalit du GHRH-R et de proposer que le glucose et les acides gras libres (AGL) circulants soient impliqus dans le vieillissement de la somatotrope. Une tude de micro-puce ADN permis didentifier des gnes associs des mcanismes de protection et de rparation des dommages cellulaires mis en place dans lhypophyse antrieure au cours du vieillissement et par la RCMLD. Finalement, les effets dun stress gluco- ou lipotoxique sur la fonction somatotrope ont t tudis chez des rats de 2 et 6 mois, infuss 72 h avec une solution de glucose ou dIntralipides, mimant les niveaux circulants de glucose et dAGL retrouvs chez le rat g. Les rsultats obtenus montrent que la glucotoxicit affecte la rgulation de certains gnes de la somatotrope, dont le GHRH-R, et suggrent que la capacit de rponse ce type de stress est altre. Les mcanismes par lesquels la glucotoxicit exerce ces effets pourraient inclure la gnration de stress oxydant. Lensemble de ces rsultats proposent de nouvelles pistes mcanistiques qui pourraient contribuer au retardement de la somatopause et, ultimement, llaboration de nouvelles stratgies dintervention nutritionnelles ou pharmacologiques ciblant les mmes voies que la RCMLD, avec une efficacit similaire ou suprieure.
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La ralisation des objectifs dducation pour tous en Hati requiert imprativement, entre autres, une campagne massive et acclre de formation denseignants - formation la fois initiale et en cours demploi. Malheureusement, les structures actuelles sont loin dtre en mesure de rpondre cette demande. Il faudra donc recourir dautres modalits de formation, particulirement celles utilisant les TIC (technologies de linformation et de la communication). Cependant, dans ce domaine, il est fort tentant de continuer copier ce qui se fait en France, au Canada ou aux tats-Unis, et dallonger ainsi la liste dchecs dus une adaptation dficiente ou inexistante. Dans un souci de maximiser les chances de succs, il est important dexaminer ladquation des stratgies adoptes au contexte et lapprenant hatiens. Cette recherche tudie les caractristiques des enseignants hatiens des deux premiers cycles de lenseignement fondamental (primaire) en tant quapprenants, caractristiques susceptibles de constituer des barrires ou des facteurs facilitants internes une intgration efficace des TIC dans leur formation. Dans une premire phase quantitative, une enqute a t administre en 2009-2010 176 enseignants. Lanalyse des donnes recueillies a permis de faire ressortir trois tendances fortes : une attitude positive par rapport aux innovations et aux TIC, des sources intrinsques de motivation et une forte distance hirarchique ; il faut aussi signaler deux autres rsultats importants : le peu de familiarit avec lordinateur et ladoption massive du cellulaire ; les rponses taient plus partages au niveau de la conception de lenseignement et de lapprentissage et de la dimension individualisme-collectivisme. Une analyse factorielle a fait merger quatre facteurs : la capacit dutiliser les TIC, le dsir de changement, la conception du rle du formateur et la distance hirarchique. Suite cette enqute, une phase qualitative comportant sept entrevues individuelles avec des spcialistes de la formation des enseignants en Hati et trois groupes de discussion avec des enseignants du fondamental a t effectue la fin de 2010. Cette phase avait pour but denrichir, de complter, dexpliquer, de confirmer et dillustrer les rsultats quantitatifs. Malgr leur regard plus svre, les spcialistes en formation des enseignants ont largement contribu linterprtation des rsultats, particulirement ceux concernant lattitude par rapport aux innovations et aux TIC, la dimension individualisme-collectivisme et la conception de lenseignement et de lapprentissage. Quant aux participants aux groupes de discussion, ils ont globalement appuy les rsultats de la phase quantitative, mais en expliquant et en nuanant certains aspects. Ils ont particulirement renforc limportance de deux facteurs qui ne figuraient pas dans la liste initiale et qui ont merg de lanalyse factorielle : le dsir de changement et la conception du rle du formateur. Ils ont galement apport des claircissements fort pertinents sur la distance hirarchique. .
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Le rcepteur de la vasopressine de type 2 (V2R) joue un rle crucial dans lhomostasie hydrique. Exprim principalement au niveau du rein, son activation par lhormone antidiurtique arginine-vasopressine (AVP) favorise la rabsorption deau, participant ainsi diminuer la diurse. Plus de 200 mutations dans le gne du V2R ont t associes au diabte nphrognique insipide congnital (DINc), une maladie cause par une perte de fonction du rcepteur. loppos, trois mutations dcouvertes rcemment induisent un gain de fonction du V2R, et sont la cause du syndrome nphrognique de lanti-diurse inapproprie (NSIAD). Les travaux de cette thse visent mieux comprendre les bases molculaires responsables de la perte ou du gain de fonction des rcepteurs mutants associs ces deux maladies. Dans plus de 50% des cas, les mutations faux-sens affectent ngativement ladoption dune conformation native par le V2R, provoquant la reconnaissance et la rtention intracellulaire des mutants par le systme de contrle de qualit du rticulum endoplasmique. Nos rsultats ont dmontr que linteraction entre les rcepteurs mutants et le chaperon molculaire calnexine est dpendante de N-glycosylation et que sa dure varie en fonction de la mutation. De plus, limportance de cette modification co-traductionnelle et des interactions lectines-sucres dans le processus de maturation dun mutant donn sest avre une caractristique intrinsque, puisque labsence de N-glycosylation na pas affect le mutant Y128S (phnotype lger) tandis que la maturation du mutant W164S (phnotype svre) a t totalement abolie. Nos rsultats suggrent aussi que laction des chaperons pharmacologiques (CP), molcules favorisant la maturation des mutants du V2R, peut survenir diffrentes tapes au cours du processus de maturation, selon le mutant rchapp. Ces diffrences entre muta nts suggrent des processus biosynthtiques personnaliss dicts par la nature de la mutation implique et pourraient expliquer la diffrence de svrit des manifestations cliniques chez les patients porteurs de ces mutations. Bien quune rcupration de fonction ait t obtenue pour les mutants Y128S et W164S par un traitement au CP, il nen est pas de mme pour toutes les mutations occasionnant un dfaut conformationnel. Cest ce que nous avons dmontr pour le mutant V88M, afflig de deux dfauts, soit une faible efficacit de maturation combine une basse affinit pour lAVP. Dans ce cas, et malgr une augmentation du nombre de rcepteurs mutants la surface cellulaire, la diminution de laffinit apparente du rcepteur mutant pour lAVP a t exacerbe par la prsence rsiduelle de CP son site de liaison, rendant impossible lactivation du rcepteur aux concentrations physiologiques dAVP. Les mutants R137C et R137L ont une activit constitutive leve et mnent au NSIAD tandis que la substitution de cette mme arginine par une histidine (R137H) mne au DINc. Ces trois mutants se sont avr partager plusieurs caractristiques, dont une efficacit de maturation rduite et une dsensibilisation spontane leve. La seule diffrence iden tifie entre ces mutants est leur niveau dactivit constitutive. Le CP utilis dans nos tudes possde aussi la proprit dagoniste inverse, mais na pourtant pas diminu lactivit constitutive des mutants R137C/L, suggrant une conformation active fige. Seul leffet chaperon a t observ, entranant la hausse de rcepteurs la surface cellulaire, qui se traduit par une augmentation de la production de second messager. Nous avons par contre suggr lutilisation dAVP puisquil favorise lendocytose des rcepteurs R137/L sans promouvoir leur activation, diminuant ainsi le nombre de rcepteurs actifs la surface cellulaire. Nous avons identifi la premire mutation occasionnant un gain de fonction du V2R qui nimplique pas larginine 137. Le mutant F229V a une activit constitutive leve et, contrairement aux R137C et R137L, il nest pas sujet une dsensibilisation spontane accrue. Lobservation que des agonistes inverses sont aptes inhiber lactivit constitutive de ce nouveau mutant est une dcouverte importante puisque linsuccs obtenu avec les mutations prcdentes suggrait que ces molcules ntaient pas utiles pour le traitement du NSIAD. Considrs globalement, ces travaux illustrent le caractre particulier des formes mutantes du V2R et limportance de bien cerner les consquences fonctionnelles des mutations afin dapporter aux patients atteints de DINc ou NSIAD une thrapie personnalise, et de dvelopper de nouveaux agents thrapeutiques adapts aux besoins.
Resumo:
La Fibrose Kystique, cause par des mutations du canal CFTR, mne la dysfonction du transport des fluides et des ions causant la dshydratation du liquide de surface des voies ariennes et ainsi une dfaillance de la clairance mucocilliaire. Ce dfaut entraine laccumulation et lpaississement du mucus au niveau des bronches qui devient alors un environnement idal pour le dveloppement dinfections chroniques et dinflammation qui sont associes la destruction progressive de lpithlium chez les patients Fibrose Kystique. Mme si leur rle dans les processus lsionnels est trs bien connu, limpact de mdiateurs inflammatoires sur la capacit de rparation ne lest cependant pas. Lobjectif de ma maitrise tait donc dtudier la rgulation des mcanismes de rparation de lpithlium bronchique sain et Fibrose Kystique par le facteur de ncrose tumoral (TNF)-alpha, une cytokine pro-inflammatoire cruciale dans linitiation et la propagation de la rponse inflammatoire chez les patients FK. laide dun modle de plaies mcaniques, nous avons montr que le TNF-alpha stimule la rparation de lpithlium bronchique sain (NuLi-1) et Fibrose Kystique (CuFi-1). De faon surprenante, lexposition chronique au TNF-alpha augmente cette stimulation tout comme le taux de migration cellulaire pendant la rparation. Cette augmentation de rparation semble tre mdie par lactivation de la mtalloprotinase MMP-9, la relche dEGF par les cellules pithliales et ainsi lactivation de la voie dEGFR. De plus, lactivation de la rparation par le TNF-alpha semble aussi impliquer lactivation des canaux K+, dont nous avons dmontr le rle important dans la rparation. Contrairement son effet sur la migration cellulaire et sur la rparation, le TNF-alpha diminue la prolifration cellulaire. En somme, en plus de son rle dans les processus lsionnels, le TNF-alpha semble avoir un rle complexe dans les processus de rparation puisquil stimule la migration et ralentit la prolifration cellulaire.
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La protine Nef du VIH-1 joue un rle important dans la pathogense du VIH-1 en modulant les voies de signalisation de la cellule hte. La signalisation par le TcR est essentielle la slection positive pour gnrer les cellules simples positives (SP) CD4+ et simples positives (SP) CD8+, processus largement dpendant de lactivit de la Src kinase Lck et de son habilet lier la queue cytoplasmique des corcepteurs CD4 et CD8. Nous avons prcdemment trouv que lexpression de Nef dans le VIH ou VIS peut induire une svre dpltion des thymocytes et une baisse dexpression du corcepteur CD4 la membrane. Nous avons galement montr que Nef bloque la gnration des thymocytes doubles positifs (DP) CD4+ CD8+ en plus daltrer la transition des cellules DP vers CD4+ SP. Par contre, ce phnotype est rcuprable par plusieurs approches dont le croisement dune souris transgniques exprimant Nef avec une souris exprimant la forme constitutivement active de Lck Y505F. Les rsultats indiquent que la maturation des cellules CD4+ est altre par le dysfonctionnement de la signalisation CD4-Lck. Toutefois, les mcanismes molculaires par lesquels Nef contribue au bloc de la gnration des cellules CD4+ dans le thymus demeurent trs imprcis. Dans cette tude, en utilisant des approches biochimiques et de microscopie confocale, nous avons trouv que les thymocytes transgniques Nef+ expriment plus de Lck que les thymocytes Nef-. Malgr cette augmentation, une partie significative de Lck est incapable datteindre la membrane plasmique. Cette fraction tait significativement accumule dans un compartiment intracellulaire des thymocytes transgniques exprimant Nef. galement, en utilisant la technique dessai kinase in vitro, nous avons trouv que lactivit kinase de Lck est significativement augmente dans les thymocytes transgniques mais demeure stable suite une stimulation par un -CD3 + -CD4. galement, comparativement aux thymocytes Nef-, la kinase Lck dans les thymocytes transgniques tait rsistante la dgradation suite une stimulation. En examinant le statut de c-Cbl, le principal rgulateur ngatif de Lck, nous avons montr que c-Cbl colocalise faiblement avec Lck, malgr son hyperphosphorylation constitutive. Ceci pourrait expliquer lchec de la dgradation de Lck. En plus, nous avons trouv que suite une stimulation par un -CD3 + -CD4, la phosphorylation de Zap-70 en tyrosine 493 par Lck est diminue, rsultant dune importante baisse de lactivit kinase de Zap-70 et dun bloc des premiers vnements de la voie de signalisation par le TcR. Ces donnes indiquent que la signalisation CD4-Lck est interrompue par la prsence de Nef.
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Le cartilage est un tissu conjonctif compos dune seule sorte de cellule nomme chondrocytes. Ce tissu offre une fondation pour la formation des os. Les os longs se dveloppent par l'ossification endochondral. Ce processus implique la coordination entre la prolifration, la diffrenciation et l'apoptose des chondrocytes, et rsulte au remplacement du cartilage par l'os. Des anomalies au niveau du squelette et des dfauts lis lge tels que larthrose (OA) apparaissent lorsquil y a une perturbation dans lquilibre du processus de dveloppement. ce jour, les mcanismes exacts contrlant la fonction et le comportement des chondrocytes pendant la croissance et le dveloppement du cartilage sont inconnus. Le rcepteur activateur de la prolifration des peroxysomes (PPAR) gamma est un facteur de transcription impliqu dans l'homostasie des lipides. Plus rcemment, son implication a aussi t suggre dans l'homostasie osseuse. Cependant, le rle de PPAR in vivo dans la croissance et le dveloppement du cartilage est inconnu. Donc, pour la premire fois, cette tude examine le rle spcifique de PPAR in vivo dans la croissance et le dveloppement du cartilage. Les souris utilises pour ltude avaient une dltion conditionnelle au cartilage du gne PPAR. Ces dernires ont t gnres en employant le systme LoxP/Cre. Les analyses des souris ayant une dltion au PPAR aux stades embryonnaire et adulte dmontrent une rduction de la croissance des os longs, une diminution des dpts de calcium dans los, de la densit osseuse et de la vascularisation, un dlai dans lossification primaire et secondaire, une diminution cellulaire, une perte dorganisation colonnaire et une diminution des zones hypertrophiques, une dsorganisation des plaques de croissance et des chondrocytes dforms. De plus, la prolifration et la diffrenciation des chondrocytes sont anormales. Les chondrocytes et les explants isols du cartilage mutant dmontrent une expression rduite du facteur de croissance endothlial vasculaire (VEGF)-A et des lments de production de la matrice extracellulaire. Une augmentation de lexpression de la mtalloprotinase matricielle (MMP)-13 est aussi observe. Dans les souris ges ayant une dltion au PPAR, y est aussi not des phnotypes qui ressemblent ceux de lOA tel que la dgradation du cartilage et l'inflammation de la membrane synoviale, ainsi quune augmentation de lexpression de MMP-13 et des nopitopes gnrs par les MMPs. Nos rsultats dmontrent que le PPAR est ncessaire pour le dveloppement et lhomostasie du squelette. PPAR est un rgulateur essentiel pour la physiologie du cartilage durant les stades de croissance, de dveloppement et de vieillissement.
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Les protines sont les produits finaux de la machinerie gntique. Elles jouent des rles essentiels dans la dfinition de la structure, de l'intgrit et de la dynamique de la cellule afin de promouvoir les diverses transformations chimiques requises dans le mtabolisme et dans la transmission des signaux biochimique. Nous savons que la doctrine centrale de la biologie molculaire: un gne = un ARN messager = une protine, est une simplification grossire du systme biologique. En effet, plusieurs ARN messagers peuvent provenir dun seul gne grce lpissage alternatif. De plus, une protine peut adopter plusieurs fonctions au courant de sa vie selon son tat de modification post-traductionelle, sa conformation et son interaction avec dautres protines. La formation de complexes protiques peut, en elle-mme, tre dtermine par ltat de modifications des protines influences par le contexte gntique, les compartiments subcellulaires, les conditions environmentales ou tre intrinsque la croissance et la division cellulaire. Les complexes protiques impliqus dans la rgulation du cycle cellulaire sont particulirement difficiles dissquer car ils ne se forment quau cours de phases spcifiques du cycle cellulaire, ils sont fortement rguls par les modifications post-traductionnelles et peuvent se produire dans tous les compartiments subcellulaires. ce jour, aucune mthode gnrale na t dveloppe pour permettre une dissection fine de ces complexes macromolculaires. L'objectif de cette thse est d'tablir et de dmontrer une nouvelle stratgie pour dissquer les complexes protines forms lors du cycle cellulaire de la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Dans cette thse, je dcris le dveloppement et l'optimisation d'une stratgie simple de slection base sur un essai de complmentation de fragments protiques en utilisant la cytosine daminase de la levure comme sonde (PCA OyCD). En outre, je dcris une srie d'tudes de validation du PCA OyCD afin de lutiliser pour dissquer les mcanismes d'activation des facteurs de transcription et des interactions protine-protines (IPPs) entre les rgulateurs du cycle cellulaire. Une caractristique cl du PCA OyCD est qu'il peut tre utilis pour dtecter la fois la formation et la dissociation des IPPs et mettre un signal dtectable (la croissance des cellules) pour les deux types de slections. J'ai appliqu le PCA OyCD pour dissquer les interactions entre SBF et MBF, deux facteurs de transcription cls rgulant la transition de la phase G1 la phase S. SBF et MBF sont deux facteurs de transcription htrodimriques composs de deux sous-units : une protine qui peut lier directement lADN (Swi4 ou Mbp1, respectivement) et une protine commune contenant un domain dactivation de la transcription appele Swi6. J'ai appliqu le PCA OyCD afin de gnrer un mutant de Swi6 qui restreint ses activits transcriptionnelles SBF, abolissant lactivit MBF. Nous avons isol des souches portant des mutations dans le domaine C-terminal de Swi6, pralablement identifi comme responsable dans la formation de linteraction avec Swi4 et Mbp1, et galement important pour les activits de SBF et MBF. Nos rsultats appuient un modle o Swi6 subit un changement conformationnel lors de la liaison Swi4 ou Mbp1. De plus, ce mutant de Swi6 a t utilis pour dissquer le mcanisme de rgulation de lentre de la cellule dans un nouveau cycle de division cellulaire appel START . Nous avons constat que le rpresseur de SBF et MBF nomm Whi5 se lie directement au domaine C-terminal de Swi6. Finalement, j'ai appliqu le PCA OyCD afin de dissquer les complexes protiques de la kinase cycline-dpendante de la levure nomm Cdk1. Cdk1 est la kinase essentielle qui rgule la progression du cycle cellulaire et peut phosphoryler un grand nombre de substrats diffrents en s'associant l'une des neuf protines cycline rgulatrice (Cln1-3, Clb1-6). Je dcris une stratgie haut dbit, voir une chelle gnomique, visant identifier les partenaires d'interaction de Cdk1 et dy associer la cycline approprie(s) requise(s) lobservation dune interaction en utilisant le PCA OyCD et des souches dltes pour chacune des cyclines. Mes rsultats nous permettent didentifier la phase(s) du cycle cellulaire o Cdk1 peut phosphoryler un substrat particulier et la fonction potentielle ou connue de Cdk1 pendant cette phase. Par exemple, nous avons identifi que linteraction entre Cdk1 et la -tubuline (Tub4) est dpendante de Clb3. Ce rsultat est conforme au rle de Tub4 dans la nuclation et la croissance des faisceaux mitotiques manant des centromres. Cette stratgie peut galement tre applique ltude d'autres IPPs qui sont contrles par des sous-units rgulatrices.
