Dissecting cell cycle protein complexes using the pptimized yeast cytosine deaminase protein-fragment complementation assay “You too can play with an edge”

Les protéines sont les produits finaux de la machinerie génétique. Elles jouent des rôles essentiels dans la définition de la structure, de l'intégrité et de la dynamique de la cellule afin de promouvoir les diverses transformations chimiques requises dans le métabolisme et dans la transmission des signaux biochimique. Nous savons que la doctrine centrale de la biologie moléculaire: un gène = un ARN messager = une protéine, est une simplification grossière du système biologique. En effet, plusieurs ARN messagers peuvent provenir d’un seul gène grâce à l’épissage alternatif. De plus, une protéine peut adopter plusieurs fonctions au courant de sa vie selon son état de modification post-traductionelle, sa conformation et son interaction avec d’autres protéines. La formation de complexes protéiques peut, en elle-même, être déterminée par l’état de modifications des protéines influencées par le contexte génétique, les compartiments subcellulaires, les conditions environmentales ou être intrinsèque à la croissance et la division cellulaire. Les complexes protéiques impliqués dans la régulation du cycle cellulaire sont particulièrement difficiles à disséquer car ils ne se forment qu’au cours de phases spécifiques du cycle cellulaire, ils sont fortement régulés par les modifications post-traductionnelles et peuvent se produire dans tous les compartiments subcellulaires. À ce jour, aucune méthode générale n’a été développée pour permettre une dissection fine de ces complexes macromoléculaires. L'objectif de cette thèse est d'établir et de démontrer une nouvelle stratégie pour disséquer les complexes protéines formés lors du cycle cellulaire de la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Dans cette thèse, je décris le développement et l'optimisation d'une stratégie simple de sélection basée sur un essai de complémentation de fragments protéiques en utilisant la cytosine déaminase de la levure comme sonde (PCA OyCD). En outre, je décris une série d'études de validation du PCA OyCD afin de l’utiliser pour disséquer les mécanismes d'activation des facteurs de transcription et des interactions protéine-protéines (IPPs) entre les régulateurs du cycle cellulaire. Une caractéristique clé du PCA OyCD est qu'il peut être utilisé pour détecter à la fois la formation et la dissociation des IPPs et émettre un signal détectable (la croissance des cellules) pour les deux types de sélections. J'ai appliqué le PCA OyCD pour disséquer les interactions entre SBF et MBF, deux facteurs de transcription clés régulant la transition de la phase G1 à la phase S. SBF et MBF sont deux facteurs de transcription hétérodimériques composés de deux sous-unités : une protéine qui peut lier directement l’ADN (Swi4 ou Mbp1, respectivement) et une protéine commune contenant un domain d’activation de la transcription appelée Swi6. J'ai appliqué le PCA OyCD afin de générer un mutant de Swi6 qui restreint ses activités transcriptionnelles à SBF, abolissant l’activité MBF. Nous avons isolé des souches portant des mutations dans le domaine C-terminal de Swi6, préalablement identifié comme responsable dans la formation de l’interaction avec Swi4 et Mbp1, et également important pour les activités de SBF et MBF. Nos résultats appuient un modèle où Swi6 subit un changement conformationnel lors de la liaison à Swi4 ou Mbp1. De plus, ce mutant de Swi6 a été utilisé pour disséquer le mécanisme de régulation de l’entrée de la cellule dans un nouveau cycle de division cellulaire appelé « START ». Nous avons constaté que le répresseur de SBF et MBF nommé Whi5 se lie directement au domaine C-terminal de Swi6. Finalement, j'ai appliqué le PCA OyCD afin de disséquer les complexes protéiques de la kinase cycline-dépendante de la levure nommé Cdk1. Cdk1 est la kinase essentielle qui régule la progression du cycle cellulaire et peut phosphoryler un grand nombre de substrats différents en s'associant à l'une des neuf protéines cycline régulatrice (Cln1-3, Clb1-6). Je décris une stratégie à haut débit, voir à une échelle génomique, visant à identifier les partenaires d'interaction de Cdk1 et d’y associer la cycline appropriée(s) requise(s) à l’observation d’une interaction en utilisant le PCA OyCD et des souches délétées pour chacune des cyclines. Mes résultats nous permettent d’identifier la phase(s) du cycle cellulaire où Cdk1 peut phosphoryler un substrat particulier et la fonction potentielle ou connue de Cdk1 pendant cette phase. Par exemple, nous avons identifié que l’interaction entre Cdk1 et la γ-tubuline (Tub4) est dépendante de Clb3. Ce résultat est conforme au rôle de Tub4 dans la nucléation et la croissance des faisceaux mitotiques émanant des centromères. Cette stratégie peut également être appliquée à l’étude d'autres IPPs qui sont contrôlées par des sous-unités régulatrices.

HCaRG "Hypertension-related Calcium Regulated Gene", un gène candidat de la réparation rénale : caractérisation de son interaction avec le cytosquelette et son expression génique

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Interaction entre la RNase HI et la RNase E dans le métabolisme des R-loops et la dégradation des ARNms chez Escherichia coli.

Chez la bactérie Escherichia coli, la topoisomérase I et la gyrase représentent deux topoisomérases majeures qui participent à la régulation du surenroulement de l’ADN. Celles-ci sont codées respectivement par les gènes topA et par gyrA et gyrB. Chez les mutants topA, l’excès de surenroulement négatif qui est généré en amont de la polymérase ARN lors de la phase d’élongation de la transcription de l’ADN, entraine la formation de R-loops. Les R-loops sont des hybrides ARN-ADN qui in vivo sont formés lorsque l’ARN nouvellement transcrit forme un hybride avec le brin d’ADN matrice, le brin d’ADN complémentaire demeurant sous forme simple brin. La RNase HI est une endoribonucléase codée par le gène rnhA. Elle dégrade l’ARN de R-loops, entre autres, pour empêcher l’initiation de la réplication à des sites autres que l’origine normale, oriC. Chez les mutants rnhA, on observe une réplication indépendante de l’origine oriC. Ce type de réplication appelé cSDR, pourrait donc expliquer, du moins en partie, l’inhibition de la croissance de doubles mutants topA rnhA. A l’aide de la mutagenèse au transposon Tn5, il a été possible d’isoler des suppresseurs extragéniques qui permettaient la croissance des doubles mutants topA rnhA. Plusieurs de ces suppresseurs ont le transposon inséré dans le gène codant pour la RNase E, l’endoribonucléase principale impliquée dans la dégradation des ARNms chez E. coli. La majorité des insertions se retrouvent dans la partie C-terminale de la protéine qui est impliquée dans l’assemblage d’un complexe multiprotéique appelé l’ARN dégradosome. Les résultats obtenus démontrent que ces suppresseurs diminuent le cSDR ainsi que la réponse SOS induite constitutivement en l’absence de la RNase HI. Sachant que la RNase HI est une endoribonucléase tout comme la RNase E, une collaboration entre les deux enzymes suggère que la RNase E pourrait également jouer un rôle potentiel dans le contrôle de la formation des R-loops et bien évidemment de leur retrait au sein de la cellule. À l’opposé, il est possible que la RNase HI puisse avoir comme autre fonction la prise en charge de la maturation et de la dégradation des molécules d’ARNs.

CEP78, a novel centrosomal protein

Contexte: Le centrosome est un petit organite bien connu pour son rôle dans l'établissement du fuseau bipolaire pendant la division cellulaire. Les déficiences de la fonction du centrosome donnent souvent lieu à des maladies humaines, y compris le cancer et la formation de kystes rénaux. Nous sommes intéressés à étudier la fonction d'une nouvelle protéine centrosomale nommée CEP78, identifiée dans un criblage protéomique pour de nouveaux composants centrosomaux. Méthodes et résultats : Le traitement des cellules avec le nocodazole, un agent qui dépolymérise spécifiquement les microtubules cytoplasmiques mais pas les microtubules stabilisés du centrosome, a montré que CEP78 est un composant centrosomal stable. La colocalisation de cette protéine avec d'autres marqueurs centrosomaux tels que CEP164, SAS6, Centrine, tubuline polyglutamylée et POC5, à différentes phases du cycle cellulaire a indiqué que CEP78 est précisément à l'extrémité distale des centrioles, mères et filles. Il existe deux pointts CEP78 au cours de l’interphase et les cellules passent par la mitose, procentrioles maturent, et le nombre de points de CEP78 augmente à 4 par cellule et, à la fin de la télophase chaque cellule fille possède 2 points CEP78. La caractérisation des domaines fonctionnels de CEP78 a montré que des répétitions riches en leucine sont nécessaires pour la localisation centrosomale de la protéine. En outre, nous avons constaté que la surexpression de CEP78 ne change pas le nombre de mères/procentrioles mais diminue le nombre et l'intensité des points de CEP170 (protéine d'appendice sous-distal) sans diminution du niveau d'expression de cette protéine. D'autres études ont montré qu'il n'y a pas d'interaction entre ces deux protéines. Enfin, la surexpression de CEP78 protège des microtubules contre la dépolymérisation en présence de nocodazole, ce qui suggère qu'il possède la capacité de lier les microtubules. Conclusion : Nos résultats suggèrent que CEP78 est destiné à l'extrémité distale des centrioles matures par ses répétitions riche en lecuine, où il pourrait être impliqué dans la maturation ou la régulation de l'assemblage ou de la rénovation de l'appendice sous-distal centriolaire, une structure connue dans la nucléation des microtubules et d'ancrage. Comprendre la fonction de Cep78 contribuera à éclaircir le rôle du centrosome dans le cycle cellulaire.

The regulatory roles of APE1 and Prdx1 interaction

L’apurinic/apyrimidic endonuclease 1 (APE1) est une protéine multifonctionnelle qui joue un rôle important dans la voie de réparation de l’ADN par excision de base. Elle sert également de coactivateur de transcription et est aussi impliquée dans le métabolisme de l’ARN et la régulation redox. APE1 peut cliver les sites AP ainsi que retirer des groupements, sur des extrémités 3’ créées suite à des bris simple brin, qui bloquent les autres enzymes de réparation, permettant de poursuivre la réparation de l’ADN, puisqu’elle possède plusieurs activités de réparation de l’ADN comme une activité phosphodiestérase 3’ et une activité exonucléase 3’→5’. Les cellules de mammifères ayant subi un knockdown d’APE1 présentent une grande sensibilité face à de nombreux agents génotoxiques. APE1 ne possède qu’une seule cystéine située au 65e acide aminé. Celle-ci est nécessaire pour maintenir l’état de réduction de nombreux activateurs de transcription tels que p53, NF-κB, AP-1, c-Jun at c-Fos. Ainsi, elle se retrouve impliquée dans la régulation de l’expression génique. APE1 passe également à travers au moins 4 types de modifications post-traductionnelles : l’acétylation, la désacétylation, la phosphorylation et l’ubiquitylation. La façon dont APE1 est recrutée pour accomplir ses différentes fonctions biologiques demeure un mystère, bien que cela puisse être relié à sa capacité d’interaction avec de multiples partenaires différents. Sous des conditions de croissance normales, il a été démontré qu’APE1 interagit avec de nombreux partenaires impliqués dans de multiples fonctions. Nous émettons l’hypothèse que l’état d’oxydation d’APE1 est ce qui contrôle les partenaires avec lesquels la protéine interagira, lui permettant d’accomplir des fonctions précises. Dans cette étude nous démontrons que le peroxyde d’hydrogène altère le réseau d’interactions d’APE1. Un nouveau partenaire d’interaction d’APE1, Prdx1, un membre de la famille des peroxirédoxines responsable de récupérer le peroxyde d’hydrogène, est caractérisé. Nous démontrons qu’un knockdown de Prdx1 n’affecte pas l’activité de réparation de l’ADN d’APE1, mais altère sa détection et sa distribution cellulaire à l’intérieur des cellules HepG2 conduisant à une induction accrue de l’interleukine 8 (IL-8). L’IL8 est une chimiokine impliquée dans le stress cellulaire en conditions physiologiques et en cas de stress oxydatif. Il a été démontré que l’induction de l’IL-8 est dépendante d’APE1 indiquant que Prdx1 pourrait réguler l’activité transcriptionnelle d’APE1. Il a été découvert que Prdx1 est impliquée dans la régulation redox suite à une réponse initiée par le peroxyde d’hydrogène. Ce dernier possède un rôle important comme molécule de signalisation dans de nombreux processus biologiques. Nous montrons que Prdx1 est nécessaire pour réduire APE1 dans le cytoplasme en réponse à la présence de H2O2. En présence de Prdx1, la fraction d’APE1 présent dans le cytoplasme est réduite suite à une exposition au peroxyde d’hydrogène, et Prdx1 est hyperoxydé suite à l’interaction entre les deux molécules. Cela suggère que le signal, que produit le peroxyde d’hydrogène, sur APE1 passe par Prdx1. Un knockdown d’APE1 diminue la conversion de la forme dimérique de Prdx1 vers la forme monomérique. Cette observation implique qu’APE1 pourrait être impliquée dans la régulation de l’activité catalytique de Prdx1 en accélérant son hyperoxydation.

Searching for novel gene functions in yeast : identification of thousands of novel molecular interactions by protein-fragment complementation assay followed by automated gene function prediction and high-throughput lipidomics

La compréhension de processus biologiques complexes requiert des approches expérimentales et informatiques sophistiquées. Les récents progrès dans le domaine des stratégies génomiques fonctionnelles mettent dorénavant à notre disposition de puissants outils de collecte de données sur l’interconnectivité des gènes, des protéines et des petites molécules, dans le but d’étudier les principes organisationnels de leurs réseaux cellulaires. L’intégration de ces connaissances au sein d’un cadre de référence en biologie systémique permettrait la prédiction de nouvelles fonctions de gènes qui demeurent non caractérisées à ce jour. Afin de réaliser de telles prédictions à l’échelle génomique chez la levure Saccharomyces cerevisiae, nous avons développé une stratégie innovatrice qui combine le criblage interactomique à haut débit des interactions protéines-protéines, la prédiction de la fonction des gènes in silico ainsi que la validation de ces prédictions avec la lipidomique à haut débit. D’abord, nous avons exécuté un dépistage à grande échelle des interactions protéines-protéines à l’aide de la complémentation de fragments protéiques. Cette méthode a permis de déceler des interactions in vivo entre les protéines exprimées par leurs promoteurs naturels. De plus, aucun biais lié aux interactions des membranes n’a pu être mis en évidence avec cette méthode, comparativement aux autres techniques existantes qui décèlent les interactions protéines-protéines. Conséquemment, nous avons découvert plusieurs nouvelles interactions et nous avons augmenté la couverture d’un interactome d’homéostasie lipidique dont la compréhension demeure encore incomplète à ce jour. Par la suite, nous avons appliqué un algorithme d’apprentissage afin d’identifier huit gènes non caractérisés ayant un rôle potentiel dans le métabolisme des lipides. Finalement, nous avons étudié si ces gènes et un groupe de régulateurs transcriptionnels distincts, non préalablement impliqués avec les lipides, avaient un rôle dans l’homéostasie des lipides. Dans ce but, nous avons analysé les lipidomes des délétions mutantes de gènes sélectionnés. Afin d’examiner une grande quantité de souches, nous avons développé une plateforme à haut débit pour le criblage lipidomique à contenu élevé des bibliothèques de levures mutantes. Cette plateforme consiste en la spectrométrie de masse à haute resolution Orbitrap et en un cadre de traitement des données dédié et supportant le phénotypage des lipides de centaines de mutations de Saccharomyces cerevisiae. Les méthodes expérimentales en lipidomiques ont confirmé les prédictions fonctionnelles en démontrant certaines différences au sein des phénotypes métaboliques lipidiques des délétions mutantes ayant une absence des gènes YBR141C et YJR015W, connus pour leur implication dans le métabolisme des lipides. Une altération du phénotype lipidique a également été observé pour une délétion mutante du facteur de transcription KAR4 qui n’avait pas été auparavant lié au métabolisme lipidique. Tous ces résultats démontrent qu’un processus qui intègre l’acquisition de nouvelles interactions moléculaires, la prédiction informatique des fonctions des gènes et une plateforme lipidomique innovatrice à haut débit , constitue un ajout important aux méthodologies existantes en biologie systémique. Les développements en méthodologies génomiques fonctionnelles et en technologies lipidomiques fournissent donc de nouveaux moyens pour étudier les réseaux biologiques des eucaryotes supérieurs, incluant les mammifères. Par conséquent, le stratégie présenté ici détient un potentiel d’application au sein d’organismes plus complexes.

Étude protéomique des partenaires d`interaction de XPA en présence et en absence de dommage à l`ADN

La réparation par excision de nucléotides (NER) permet l'élimination des lésions provoquant une distorsion de la double hélice de l’ADN. Ces lésions sont induites par plusieurs agents environnementaux comme les rayons UV, ainsi que par certaines drogues chimio- thérapeutiques tel que le cisplatine. Des défauts dans la NER conduisent à de rares maladies autosomiques héréditaires : La xérodermie pigmentaire (XP), le syndrome de Cockayne (CS), le syndrome de sensibilité aux UVSS et la trichothiodystrophie (TTD). Ces maladies sont associées soit à une prédisposition élevée au cancer de la peau et / ou à de graves anomalies du développement neurologique. Le groupe de patients XP-A représente le deuxième groupe (XP) le plus fréquent, et possède la forme la plus sévère combinant cancer de la peau avec un haut risque de dégénérescence neurologique. À date, aucune explication n`a été proposée pour les symptômes neurologiques observés chez ces patients. Nous avions suggéré ainsi que la protéine XPA possède d`autres fonctions dans d`autres processus cellulaires, ceci en interagissant avec des partenaires protéiques différents de ceux déjà connus. Afin de confirmer cette hypothèse nous avions réalisé une étude protéomique à grande échelle en combinant la spectrométrie de masse à une immunoprécipitation en Tandem d`affinité (TAP), afin d`identifier de nouvelles protéines interagissant directement avec XPA. Nous avions montré que XPA peut interagir avec MRE11, la protéine clé de la réparation par recombinaison homologue. Des études additionnelles sont requises pour confirmer cette interaction et comprendre sa fonction

New insights into small molecules inhibitors and protein-protein interactions of VirB8 : a critical conserved component of the type IV secretion system.

Les systèmes bactériens de sécrétion de type IV (T4SS) sont constitués d’un ensemble de 8 à 12 protéines conservées. Ces dernières sont utilisées lors de la translocation de protéines, la translocation de complexes ADN-protéines mais aussi pour le transport de ces derniers au travers de la membrane cellulaire. Les T4SS, en tant que facteurs de virulence pour beaucoup de pathogènes comme Brucella suis, sont donc d’excellents modèles cibles pour le développement de médicaments d’antivirulence. Ces médicaments, en privant le pathogène de son facteur essentiel de virulence : le T4SS, constituent une alternative ou encore une amélioration des traitements antibiotiques utilisés actuellement. VirB8, un facteur d’assemblage conservé dans le T4SS, forme des dimères qui sont importants pour la fonction des T4SS dans ces pathogènes. De par ses interactions multiples, VirB8 est un excellent modèle pour l’analyse des facteurs d’assemblage mais aussi en tant que cible de médicaments qui empêcheraient son interaction avec d’autres protéines et qui, in fine, désarmeraient les bactéries en les privant de leur fonctions essentielles de virulence. À ce jour, nous savons qu’il existe un équilibre monomère-dimère et un processus d’homodimerization de VirB8 dont l’importance est vitale pour la fonctionnement biologique des T4SSs. En se basant sur des essais quantitatifs d’interaction, nous avons identifié (i) des sites potentiels d’interaction avec d’autres protéines VirB du T4SS mais aussi (ii) isolé des petites molécules inhibitrices afin de tester la fonction protéique de VirB8. Afin de déterminer les acides aminés importants pour l’hétérodimérization de VirB8 avec VirB10, nous avons effectué des expériences de mutagenèse aléatoire, de phage display et d’arrimage moléculaire in silico. Ces expériences ont démontré l’importance de trois acides aminés localisés sur le feuillet β : R160, S162, T164 et I165. Ces derniers seraient importants pour l’association de VirB8 avec VirB10 étant donné que leur mutagenèse entraine une diminution de la formation du complexe VirB8-VirB10. L’objectif actuel de notre projet de recherche est de pouvoir mieux comprendre mais aussi d’évaluer le rôle de VirB8 dans l’assemblage du T4SS. Grace à un méthode de criblage adaptée à partir de la structure de VirB8, nous avons pu identifié une petite molécule inhibitrice BAR-068, qui aurait un rôle prometteur dans l’inhibition du T4SS. Nous avons utilisé la spectroscopie par fluorescence, l’essai à deux hybrides, le cross-linking et la cristallographie afin de déterminer le mécanisme d'interaction existant entre VirB8 et BAR-068. Ces travaux pourraient permettre de nombreuses avancées, notamment en termes de compréhension des mécanismes d’inhibition du T4SS. Notre objectif ultime est de pouvoir caractériser la séquence d’évènements essentiels à l’assemblage et au fonctionnement du T4SS. De manière globale, notre projet de recherche permettrait de révéler les grands principes d’assemblage des protéines membranaires, les processus de sécrétion de protéines chez les bactéries mais aussi de proposer une nouvelle stratégie lors du développement de drogues antimicrobiennes.