Étude sur les déterminants psychosociaux de la vaccination contre le virus A(H1N1) auprès des parents d’enfants qui fréquentent des services de garde éducatifs de Montréal

Introduction En juin 2009, l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a déclaré l’état de pandémie pour le nouveau virus influenza A(H1N1). Malgré les recommandations des autorités de santé publique, lors de la mise en place de la campagne de vaccination de masse au Québec contre ce virus pandémique, certains groupes de la population ont été plus enclins à être vaccinés que d’autres groupes. Ceci souligne l’importance des déterminants psychosociaux du comportement humain, sujet qui a donné cadre à notre étude. Objectifs Le but de cette étude a été de documenter les attitudes, les connaissances et les influences sociales des parents dont les enfants fréquentent des services de garde éducatifs (SGE) vis-à-vis la vaccination contre la pandémie ainsi que la couverture vaccinale. Méthodologie Un questionnaire auto-administré et anonyme basé sur la théorie des comportements interpersonnels de Triandis a été distribué aux parents d’enfants âgés de 0-59 mois de neuf centres de la petite enfance sur l’île de Montréal. Résultats Le taux de réponse de l’enquête a été de 32,0% (N=185). Le taux de vaccination des enfants s’est retrouvé à 83,4%; ceci représente une couverture plus élevée que la moyenne régionale et nationale. Toutefois, à une question sur l’intention des parents face à une autre pandémie, seuls 46% des parents feraient vacciner leur enfant. Les facteurs les plus significatifs associés à la vaccination de leur enfant ont été les croyances personnelles positives, de bonnes habitudes vaccinales et l’influence des média, tous mesurés par plusieurs indicateurs (RC respectifs de 7,7, 3,1 et 4,2, p<0,05). Conclusion Pour la grippe A(H1N1), plusieurs facteurs contextuels ont joué en faveur des taux de vaccination acceptables chez les enfants. Toutefois, la mise en place d’une campagne de la vaccination par les instances gouvernementales et de santé publique en utilisant divers média pourraient contribuer à un taux de vaccination encore plus élevé en cas d’épidémie ou de pandémie.

Influence de l'initiation de la traduction sur le changement programmé du cadre de lecture en -1 responsable de la synthèse des enzymes du virus de l’immunodéficience humaine de type 1

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est responsable du syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA). Il faut identifier de nouvelles cibles pour le développement d’agents anti-VIH-1, car ce virus développe une résistance aux agents présentement utilisés. Notre but est d’approfondir la caractérisation de l’étape du changement de cadre de lecture ribosomique en -1 (déphasage -1) nécessaire à la production du précurseur des enzymes du VIH-1. Ce déphasage est programmé et effectué par une minorité de ribosomes lorsqu’ils traduisent la séquence dite glissante à un endroit spécifique de l’ARN messager (ARNm) pleine-longueur du VIH-1. L’efficacité de déphasage est contrôlée par le signal stimulateur de déphasage (SSF), une tige-boucle irrégulière située en aval de la séquence glissante. La structure du SSF est déroulée lors du passage d’un ribosome, mais elle peut se reformer ensuite. Nous avons montré que des variations de l’initiation de la traduction affectent l’efficacité de déphasage. Nous avons utilisé, dans des cellules Jurkat-T et HEK 293T, un rapporteur bicistronique où les gènes codant pour les luciférases de la Renilla (Rluc) et de la luciole (Fluc) sont séparés par la région de déphasage du VIH-1. La Rluc est produite par tous les ribosomes traduisant l’ARNm rapporteur alors que la Fluc est produite uniquement par les ribosomes effectuant un déphasage. L’initiation de ce rapporteur est coiffe-dépendante, comme pour la majorité des ARNm cellulaires. Nous avons examiné l’effet de trois inhibiteurs de l’initiation et montré que leur présence augmente l’efficacité de déphasage. Nous avons ensuite étudié l’effet de la tige-boucle TAR, qui est présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm du VIH-1. TAR empêche la liaison de la petite sous-unité du ribosome (40S) à l’ARNm et module aussi l’activité de la protéine kinase dépendante de l’ARN double-brin (PKR). L’activation de PKR inhibe l’initiation en phosphorylant le facteur d’initiation eucaryote 2 (eIF2) alors que l’inhibition de PKR a l’effet inverse. Nous avons étudié l’effet de TAR sur la traduction et le déphasage via son effet sur PKR en utilisant TAR en trans ou en cis, mais à une certaine distance de l’extrémité 5’ afin d’éviter l’interférence avec la liaison de la 40S. Nous avons observé qu’une faible concentration de TAR, qui active PKR, augmente l’efficacité de déphasage alors qu’une concentration élevée de TAR, qui inhibe PKR, diminue cette efficacité. Nous avons proposé un modèle où des variations de l’initiation affectent l’efficacité de déphasage en modifiant la distance entre les ribosomes parcourant l’ARNm et, donc, la probabilité qu’ils rencontrent un SSF structuré. Par la suite, nous avons déterminé l’effet de la région 5’ non traduite (UTR) de l’ARNm pleine-longueur du VIH-1 sur l’efficacité de déphasage. Cette 5’UTR contient plusieurs régions structurées, dont TAR à l’extrémité 5’, qui peut interférer avec l’initiation. Cet ARNm a une coiffe permettant une initiation coiffe-dépendante ainsi qu’un site d’entrée interne des ribosomes (IRES), permettant une initiation IRES-dépendante. Nous avons introduit cette 5’UTR, complète ou en partie, comme 5’UTR de notre ARNm rapporteur bicistronique. Nos résultats démontrent que cette 5’UTR complète inhibe l’initiation coiffe dépendante et augmente l’efficacité de déphasage et que ces effets sont dus à la présence de TAR suivie de la tige-boucle Poly(A). Nous avons aussi construit un rapporteur tricistronique où les ribosomes exprimant les luciférases utilisent obligatoirement l’IRES. Nous avons observé que cette initiation par l’IRES est faible et que l’efficacité de déphasage correspondante est également faible. Nous avons formulé une hypothèse pour expliquer cette situation. Nous avons également observé que lorsque les deux modes d’initiation sont disponibles, l’initiation coiffe dépendante est prédominante. Finalement, nous avons étudié l’effet de la protéine virale Tat sur l’initiation de la traduction et sur l’efficacité de déphasage. Nous avons montré qu’elle augmente l’initiation de la traduction et que son effet est plus prononcé lorsque TAR est située à l’extrémité 5’ des ARNm. Nous proposons un modèle expliquant les effets de Tat sur l’initiation de la traduction par l’inhibition de PKR ainsi que par des changements de l’expression de protéines cellulaires déroulant TAR. Ces résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes régissant le déphasage du VIH-1, ce qui est essentiel pour le développement d’agents anti-déphasage.

L’étude de l’impact des protéines non structurales NS1 et NS2 du virus respiratoire syncitial sur la réponse immunitaire innée

Le virus respiratoire syncytial (RSV) est un virus à ARN de polarité négative. Les études démontrent que toute la population sera infectée par ce virus au moins deux fois avant l’âge de 3 ans. Le RSV peut provoquer plusieurs pathologies respiratoires telles que la bronchiolite aiguë et la pneumonie. Les infections sévères corrèlent avec le développement de l’asthme. Lors d’une infection virale, les particules du RSV sont détectées par le senseur RIG-I qui induit l’activation des facteurs de transcription NF-κB et IRF-3. Respectivement, les facteurs de transcription activeront les réponses inflammatoire et antivirale. Au coeur des pathologies induites par le RSV se trouve une réponse immunitaire mal adaptée. Plus précisément, par l’entremise de NF-κB, le RSV provoque une production exagérée de cytokines et chimiokines qui induisent une réponse inflammatoire démesurée provoquant du dommage tissulaire. Paradoxalement, le RSV est capable d’échapper à la réponse antivirale. Ces deux phénomènes sont contrôlés par l’entremise des protéines non structurales NS1 et NS2. Le mécanisme délimitant le mode d’action de NS1 et NS2 sur la réponse antivirale reste à être déterminé. Avec pour objectif d’élucider comment NS1 et NS2 inhibent la réponse antivirale, nous avons investigué le mécanisme de reconnaissance de l’hôte vis-à-vis de RSV. Nous démontrerons, pour la première fois, que le senseur cytosolique MDA5 est impliqué dans la réponse antivirale contre le RSV. Nous présenterons des résultats préliminaires qui suggèrent que le rôle de MDA5 est non redondant à RIG-I. À l’aide d’ARN interférant dirigé contre RIG-I et de transfection de MDA5, nous démontrerons que MDA5 ne contribue pas à la phosphorylation d’IRF-3, mais plutôt qu’elle régit la stabilité du facteur de transcription. Nous démontrerons aussi que, contrairement à l’hypothèse actuelle sur le fonctionnement de NS1 et NS2, l’inhibition de ces derniers ne provoque pas une augmentation de la cytokine antivirale IFN−β. Cependant, l’expression ectopique de NS1 et NS2 réduit l’activité du promoteur de l’IFN-β et de la protéine cytoplasmic antivirale ISG56 lorsqu’elle est mesurée par essai luciférase.

Rôle de la structure du génome viral sur la réplication du virus de l’hépatite C.

Le virus de l'hépatite C (VHC) touche 3% de la population mondiale et environ 30% des patients chroniquement infectés développeront une fibrose hépatique. Son génome est un ARN simple brin de polarité positive qui possède un cadre ouvert de lecture flanqué de deux régions non traduites hautement conservées. Différents facteurs peuvent influencer le cycle de réplication du VHC. Deux d’entre eux ont été étudiés dans cette thèse. Tout d'abord, nous nous sommes intéressés à l'effet des structures secondaires et tertiaires du génome sur la réplication du VHC. Les extrémités 5' et 3' du génome contiennent des structures ARN qui régulent la traduction et la réplication du VHC. Le 3'UTR est un élément structural très important pour la réplication virale. Cette région est constituée d’une région variable, d’une séquence poly(U/C) et d’un domaine hautement conservé appelé région X. Des études in vitro ont montré que le 3'UTR possède plusieurs structures ARN double brin. Cependant, les structures ARN telles qu'elles existent dans le 3'UTR dans un contexte de génome entier et dans des conditions biologiques étaient inconnues. Pour élucider cette question, nous avons développé une méthode in situ pour localiser les régions ARN simple brin et double brin dans le 3'UTR du génome du VHC. Comme prédit par les études antérieures, nous avons observé qu’in situ la région X du 3’UTR du génome présente des éléments ARN double brin. Étonnamment, lorsque la séquence poly (U/UC) est dans un contexte de génome entier, cette région forme une structure ARN double brin avec une séquence située en dehors du 3'UTR, suggérant une interaction ARN-ARN distale. Certaines études ont démontré que des structures ARN présentes aux extrémités 5’ et 3' du génome du VHC régulent à la fois la traduction et la réplication du VHC. Cela suggère qu'il y aurait une interaction entre les extrémités du génome qui permettrait de moduler ces deux processus. Dans ce contexte, nous avons démontré l'existence d'une interaction distale ARN-ARN, impliquant le domaine II du 5'UTR et la séquence codante de NS5B du génome du VHC. En outre, nous avons démontré que cette interaction joue un rôle dans la réplication de l'ARN viral. Parallèlement, nous avons étudié l'impact d'une molécule immuno-modulatrice sur la réplication du VHC. La fibrose hépatique est une manifestation majeure de l’infection par le VHC. Hors, il a été montré qu'une molécule immuno-modulatrice appelée thalidomide atténuait la fibrose chez les patients infectés par le VHC. Cependant, son impact sur la réplication virale était inconnu. Ainsi, nous avons étudié l'effet de cette molécule sur la réplication du VHC in vitro et nous avons démontré que la thalidomide active la réplication du virus en inhibant la voie de signalisation de NF-kB. Ces résultats soulignent l’importance de la voie de signalisation NF-kB dans le contrôle de la réplication du VHC, et sont à prendre en considération dans l’établissement d’un traitement contre la fibrose hépatique.

Création d'un modèle cellulaire des voies respiratoires du porc pour étudier les effets d'une co-infection virale au virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin et au circovirus porcin

Le circovirus porcin de type 2 (PCV2) est un pathogène majeur pour l’industrie porcine et est associé à une longue liste de maladies associées au circovirus porcin (MACVP). Les premières tentatives pour reproduire ces maladies ont montré que le virus doit être combiné à d’autres agents pathogènes du porc ou à différents stimulants du système immunitaire. De ces agents, le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est celui qui est le plus souvent co-isolé avec le PCV dans les fermes. Une grande partie des efforts faits pour étudier les interactions entre ces deux virus ont été menés in vivo. Les interactions in vitro ont jusqu’à maintenant été peu étudiées du fait qu’il n’existe pas de modèle cellulaire permettant la réplication efficace des deux virus. L’objectif de ce projet était donc de développer un modèle cellulaire propice à la réplication des deux virus et d’étudier leur interaction en co-infection. Une lignée cellulaire provenant de la trachée d’un porcelet nouveau-né (NPTr), permissive au PCV, a été génétiquement modifiée pour exprimer la protéine CD163, un récepteur majeur du VSRRP. Ce projet a montré que cette nouvelle lignée cellulaire (NPTr-CD163) est permissive au VSRRP ainsi qu’à plusieurs génotypes de PCV (PCV1, PCV2a, PCV2b et PCV1/2a). De plus, les résultats obtenus lors d’infections mixtes suggèrent que la réplication du VSRRP et du PCV conditionne de façon génotype-dépendante celle du PCV puisque la réplication du PCV1 est inhibée en présence de VSRRP, alors que celle du PCV2b est significativement augmentée dans les mêmes conditions. Ni la mortalité cellulaire, ni la réponse cellulaire en cytokines n’a permis d’expliquer ces résultats. La modulation de la réplication du PCV par le VSRRP serait donc liée à un mécanisme spécifique qui demeure inconnu. De plus, cet effet varierait en fonction du génotype de PCV.

Correlates of protective immunity against hepatitis C virus

Le virus de l’hépatite C (VHC) infecte ~185 millions d’individus dans le monde. Malgré le développement des nouvelles thérapies dirigées contre le VHC, on compte deux millions de nouvelles infections chaque année, en particulier dans les pays sous-développés et les populations marginalisées. Comme pour la plupart des virus à infection chronique, le développement d’un vaccin prophylactique efficace est limité par le manque de caractérisation des déterminants de la mémoire immunitaire protectrice lors des épisodes de réinfection naturelle chez les êtres humains. Le VHC représente un modèle unique au sein des virus à infection chronique pour étudier l’immunité protectrice. En effet ~30% des patients infectés par le VHC peuvent être guéris suite à un premier épisode d’infection spontanément. Dans cette thèse, nous avons étudié l’immunité protectrice contre le VHC dans une cohorte d’utilisateurs de drogues par injection qui sont à risque d’être infectés ou réinfectés. Notre hypothèse est que la majorité des patients qui ont résolu une première infection par le VHC sont protégés contre le développement d’une infection chronique s’ils sont réexposés. Cette immunité protectrice est associée à la présence des cellules T CD4 et CD8 polyfonctionnelles qui possèdent des fréquences, magnitudes et avidités élevées. La capacité protectrice des cellules T mémoire contre les séquences variables du VHC est dépendante de la diversité et flexibilité du répertoire de leurs récepteurs de cellules T (TCR), qui reconnaissent les séquences variables des épitopes ciblés. Notre premier objectif était de définir et détailler les déterminants de l’immunité protectrice conférée par les cellules T spécifiques du VHC. Nos résultats ont montré que la protection pendant l’épisode de réinfection était associée à une augmentation de la magnitude et du spectre des réponses spécifiques par les cellules T CD4 et CD8 polyfonctionnelles, ainsi que par l’apparition d’une population de cellules T tétramère+ CD8+ effectrices qui expriment faiblement le marqueur CD127 (CD127lo) lors du pic de la réponse. Chez les patients qui ont développé une infection chronique pendant l’épisode de réinfection, nous avons observé une expansion très limitée des cellules T CD4 et CD8. Le séquençage des épitopes ciblés par les cellules T CD8 chez ces patients qui sont non-protégés a montré que les séquences de ces épitopes sont différentes des séquences de référence qui étaient utilisées pour tous les essais immunologiques de cette étude. Le deuxième objectif était d’analyser la dynamique du répertoire des TCRs des cellules T CD8 spécifiques chez les patients protégés versus les patients non-protégés. Nos résultats ont montré que le répertoire des cellules T CD8 spécifiques est plus focalisé que chez les patients protégés. En plus, nous avons observé que les clonotypes qui forment le répertoire chez les patients protégés sont distincts de ceux chez les patients non-protégés. Ces clonotypes chez les patients protégés ont montré de plus grandes avidité et polyfonctionnalité que leurs homologues chez les patients non-protégés. En conclusion, nos résultats suggèrent que la protection contre le développement d’une infection chronique pendant l’épisode de réinfection par le VHC est associée à une augmentation de la magnitude, du spectre et de la fonctionnalité des réponses des cellules T spécifiques, ainsi qu’à un répertoire des TCRs plus focalisé composé des clonotypes distincts qui possèdent de plus grandes avidité et polyfonctionnalité que chez les patients non-protégés. L’homologie des séquences des souches virales entre les différents épisodes de l’infection est un déterminant majeur de l’établissement d’une protection efficace. Ces résultats ont donc des implications très importantes pour le développement d’un vaccin prophylactique contre le VHC et d’autres virus à infection chronique.

Rôle du TLR2 dans l’hépatite fulminante induite par le virus de l’hépatite murine

Ce travail examine les mécanismes de l’immunité innée impliqués dans l’hépatite aiguë virale du modèle murin d’infection par le virus de l’hépatite virale murine de type 3 (MHV-3). Afin de déterminer le rôle du TLR2 dans l’aggravation de l’hépatite, des infections avec le virus MHV-3 ont été réalisées in vivo chez des souris C57BL/6 et des souris déficientes pour le gène tlr2 et in vitro dans des macrophages et des hépatocytes infectés avec le virus MHV-3 et le virus moins virulent MHV-A59. Les niveaux de transcription et de traduction des senseurs microbiens, des interférons (IFN) de type I, des cytokines et/ou des chimiokines ont été évalués par qRT-PCR et ELISA. Les cellules ont été traitées avec des petits ARNs interférants (siRNAs) pour le TLR2 et le CEACAM1a ou mises en présence d’inhibiteurs des voies d’endocytose. Les résultats révèlent le rôle stimulateur du TLR2 pour la réplication virale, la production de cytokines pro-inflammatoires IL-6 et TNF-α et des chimiokines CXCL1, CXCL10 et CCL2. Un nouveau mécanisme d’échappement aux senseurs viraux dépendant du TLR2 a également été mis en évidence dans les macrophages et les hépatocytes lors de l’infection de ces cellules avec le virus MHV-3, et non pas avec le virus moins virulent MHV-A59. Ces différents travaux révèlent un nouveau rôle du TLR2 lors d’infections virales dans l'aggravation de la réponse inflammatoire tout en protégeant le virus des autres senseurs de la réponse immune innée.

Interaction entre le virus SRRP et Actinobacillus pleuropneumoniae dans un modèle d'infection en culture cellulaire

Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est un pathogène d’importance dans l’industrie porcine et est responsable d’importantes pertes économiques. Il n’existe pas d’antiviral efficace contre celui-ci. Il a récemment été mis en évidence que le surnageant de culture d’Actinobacillus pleuropneumoniae, l’agent étiologique de la pleuropneumonie porcine, possédait une activité antivirale in vitro contre le VSRRP dans la lignée cellulaire SJPL. Les objectifs de mon projet sont (i) d’étudier les mécanismes cellulaires menant à l’activité antivirale causée par le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae, et (ii) de caractériser les molécules actives présentes dans le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae. Dans un premier temps, des analyses de protéome ont été effectuées et ont permis d’observer que le surnageant de culture modulait la régulation du cycle cellulaire. Dans le but d’analyser le cycle cellulaire des cellules SJPL, la cytométrie en flux a été utilisée et a permis de démontrer que le surnageant de culture induisait un arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M. Deux inhibiteurs de la phase G2/M ont alors été utilisé. Il s'est avéré que ces inhibiteurs avaient la capacité d’inhiber le VSRRP dans les cellules SJPL. Enfin, la spectrométrie de masse a été utilisée dans le but de caractériser les molécules actives présentes dans le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae et d’identifier deux molécules. Ce projet a permis de démontrer pour la première fois qu’A. pleuropneumoniae est capable de perturber le cycle cellulaire et que ce dernier était un élément important dans l’effet antiviral contre le VSRRP.

Studies on IL-18 in HIV infection : effects of the cytokine on intestinal integrity, and platelets as a new source of the cytokine

L'interleukine IL-18 (IL-18), un membre de la famille de l’IL-1, est une cytokine pro-inflammatoire multifonctionnelle. Elle est produite par les monocytes, les macrophages, les cellules dendritiques, les cellules épithéliales, les kératinocytes et le cortex surrénal dans le corps humain. Cette cytokine est d'abord produite comme une protéine précurseure inactive, qui est par la suite clivée en une forme mature par la caspase-1 activée. La caspase, en elle-même, existe comme précurseur inactif dans les cellules humaines et requiert l'assemblage d'inflammasomes pour son activation. L'IL-18 pour joue un rôle clé dans la médiation des conditions inflammatoires. Notre laboratoire et d'autres ont montré que l'infection par le VIH est accompagnée d'une augmentation des taux circulants d'IL-18 avec une diminution des niveaux de son antagoniste, l'interleukine-18 binding protein (IL-18BP). Dans cette thèse, nous démontrons pour que l'IL-18 est également produite et sécrétée par les plaquettes humaines lors de leur activation. Les plaquettes contiennent des composants de l'inflammasome. Ils assemblent et activent la caspase-1, qui ensuite traite le précurseur de l'IL-18 dans sa forme mature au cours du processus d'activation des plaquettes. La cytokine est synthétisée de novo lors de l'activation des plaquettes. Contrairement à l'IL-18, les plaquettes expriment constitutivement l’IL-18BP, et la libèrent de manière constitutive, ainsi que lors de l'activation. L'IL-18 et l'IL-18BP sont colocalisés avec CD63, un marqueur pour les granules α des plaquettes. L'IL-18 libéré des plaquettes constitue la source principale de cette cytokine dans la circulation humaine chez les individus sains. Nous avons identifié des concentrations faibles de cette cytokine dans les lysats de plaquettes chez les individus infectés par le VIH par rapport à ceux en santé. D'autre part, les concentrations ont été augmentées dans le sérum et le plasma pauvre en plaquettes chez les individus infectés. Des résultats similaires ont été obtenus avec l'IL-18BP dans les lysats de plaquettes d'individus sains et infectés par le VIH. Cependant, des quantités plus faibles de cet antagoniste ont été trouvées dans le sérum et le plasma pauvre en plaquettes d'individus infectés par le VIH par rapport à ceux en santé. Nos résultats ont des implications importantes pour les maladies inflammatoires chroniques dans laquelle une activité accrue de l'IL-18 joue un rôle pathogène. Le VIH est également accompagné par une inflammation intestinale et une diminution de l'intégrité intestinale, mesurée par la réparation de la muqueuse, la régénération et la perméabilité. Cependant, on en sait peu sur la relation entre le niveau élevé de l'IL-18 associé à l'infection au VIH et la perméabilité intestinale: ceci n'a jamais été étudié. Dans cette thèse, nous démontrons le rôle du virus et sa protéine Tat à augmenter la production d'IL-18 chez deux lignées de cellules épithéliales intestinales (HT29 et Caco2) ainsi qu'une diminution de l'IL-18BP. L'IL-18 induit une hyperperméabilité de la barrière épithéliale en perturbant à la fois les jonctions serrées et adhérentes, et ce, en modulant l'expression et la distribution de l'occludine, de claudine-2 et de la bêta-caténine. Une désorganisation de l'actine F a également été observée dans les cellules lors de l'incubation avec l'IL-18. Les mêmes observations ont été faites avec la protéine Tat du VIH-1. Après une incubation prolongée, l'IL-18 a causé la mort des cellules intestinales et induit l'apoptose par l'activation de la caspase-1 et la caspase-3. Fait intéressant, les taux plasmatiques de lipopolysaccharides chez trois catégories différentes de patients au VIH (ART-naïf, ART-traitée et contrôleurs élite) sont en corrélation avec les niveaux plasmatiques de l'IL-18. Enfin, nous avons étudié la voie de signalisation à travers laquelle l'IL-18 induit une perméabilité intestinale accrue. En bref, nos études identifient les plaquettes comme une source importante d'IL-18, et leur activation lors d'une infection à VIH contribue à des concentrations accrues de cette cytokine. Le virus entraine également l'augmentation de la production de cytokines par les cellules épithéliales intestinales. L'activité biologique accrue de ces cytokines contribue à la pathogenèse du sida en augmentant la perméabilité intestinale et en causant la mort des cellules intestinales. L'IL-18 pourrait servir de cible moléculaire pour retarder la progression du sida et réduire l'inflammation chronique dans un stade précoce d'une infection à VIH.

Transcriptional approach to study porcine tracheal epithelial cells individually or dually infected with swine influenza virus and Streptococcus suis

Background: Swine influenza is a highly contagious viral infection in pigs affecting the respiratory tract that can have significant economic impacts. Streptococcus suis serotype 2 is one of the most important post-weaning bacterial pathogens in swine causing different infections, including pneumonia. Both pathogens are important contributors to the porcine respiratory disease complex. Outbreaks of swine influenza virus with a significant level of co-infections due to S. suis have lately been reported. In order to analyze, for the first time, the transcriptional host response of swine tracheal epithelial (NPTr) cells to H1N1 swine influenza virus (swH1N1) infection, S. suis serotype 2 infection and a dual infection, we carried out a comprehensive gene expression profiling using a microarray approach. Results: Gene clustering showed that the swH1N1 and swH1N1/S. suis infections modified the expression of genes in a similar manner. Additionally, infection of NPTr cells by S. suis alone resulted in fewer differentially expressed genes compared to mock-infected cells. However, some important genes coding for inflammatory mediators such as chemokines, interleukins, cell adhesion molecules, and eicosanoids were significantly upregulated in the presence of both pathogens compared to infection with each pathogen individually. This synergy may be the consequence, at least in part, of an increased bacterial adhesion/invasion of epithelial cells previously infected by swH1N1, as recently reported. Conclusion: Influenza virus would replicate in the respiratory epithelium and induce an inflammatory infiltrate comprised of mononuclear cells and neutrophils. In a co-infection situation, although these cells would be unable to phagocyte and kill S. suis, they are highly activated by this pathogen. S. suis is not considered a primary pulmonary pathogen, but an exacerbated production of proinflammatory mediators during a co-infection with influenza virus may be important in the pathogenesis and clinical outcome of S. suis-induced respiratory diseases.

The emergence of porcine circovirus 2b genotype (PCV-2b) in swine in Canada.

Since late 2004, the swine industry in the province of Quebec has experienced a significant increase in death rate related to postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). To explain this phenomenon, 2 hypotheses were formulated: 1) the presence of a 2nd pathogen could be exacerbating the porcine circovirus 2 (PCV-2) infection, or 2) a new and more virulent PCV-2 strain could be infecting swine. In 2005, 13 PMWS cases were submitted to the Quebec provincial diagnostic laboratory and PCV-2 was the only virus that could be found consistently by PCR in all 13 samples. The PCR detection results obtained for other viruses revealed the following: 61.5% were positive for porcine reproductive and respiratory syndrome virus, 30.8% for swine influenza virus, 15.4% for porcine parvovirus, 69.2% for swine torque teno virus (swTTV), 38.5% for swine hepatitis E virus (swHEV) and 84.6% for Mycoplasma hyorhinis; transmissible gastroenteritis virus and porcine respiratory coronavirus (TGEV/PRCV) was not detected. Sequences of the entire genome revealed that these PCV-2 strains belonged to a genotype (named PCV-2b) that has never been reported in Canada. Further sequence analyses on 83 other Canadian PCV-2 positive cases submitted to the provincial diagnostic laboratory during years 2005 and 2006 showed that 79.5% of the viral sequences obtained clustered in the PCV-2b genotype. The appearance of the PCV-2b genotype in Canada may explain the death rate increase related to PMWS, but this relationship has to be confirmed.

Development and use of a multiplex real-time quantitative polymerase chain reaction assay for detection and differentiation of Porcine circovirus-2 genotypes 2a and 2b in an epidemiological survey.

By the end of 2004, the Canadian swine population had experienced a severe 2 increase in the incidence of Porcine circovirus-associated disease (PCVAD), a problem that was 3 associated with the emergence of a new Porcine circovirus-2 genotype (PCV-2b), previously 4 unrecovered in North America. Thus it became important to develop a diagnostic tool that could 5 differentiate between the old and new circulating genotypes (PCV-2a and -2b, respectively). 6 Consequently, a multiplex real-time quantitative polymerase chain reaction (mrtqPCR) assay that 7 could sensitively and specifically identify and differentiate PCV-2 genotypes was developed. A 8 retrospective epidemiological survey that used the mrtqPCR assay was performed to determine if 9 cofactors could affect the risk of PCVAD. From 121 PCV-2–positive cases gathered for this 10 study, 4.13%, 92.56% and 3.31% were positive for PCV-2a, PCV-2b, and both genotypes, 11 respectively. In a data analysis using univariate logistic regressions, PCVAD compatible 12 (PCVAD/c) score was significantly associated with the presence of Porcine reproductive and 13 respiratory syndrome virus (PRRSV), PRRSV viral load, PCV-2 viral load, and PCV-2 14 immunohistochemistry (IHC) results. Polytomous logistic regression analysis revealed that 15 PCVAD/c score was affected by PCV-2 viral load (P = 0.0161) and IHC (P = 0.0128), but not by 16 the PRRSV variables (P > 0.9); suggesting that mrtqPCR in tissue is a reliable alternative to IHC. 17 Logistic regression analyses revealed that PCV-2 increased the odds ratio of isolating 2 major 18 swine pathogens of the respiratory tract, Actinobacillus pleuropneumoniae and Streptococcus 19 suis serotypes 1/2, 1, 2, 3, 4, and 7, which are serotypes commonly associated with clinical 20 diseases.

Caractérisation de l’activité transcriptionnelle antivirale et immunorégulatrice dépendante de STAT2 et IRF9, mais indépendante de STAT1, induite par la costimulation par TNF

Les cellules épithéliales pulmonaires constituent la première ligne de défense face aux virus respiratoires via la sécrétion de mucus, de peptides, de cytokines et chimiokines qui déterminent l'élimination ou la progression de l’infection. Les principales cytokines antivirales produites par les cellules épithéliales alvéolaires (AEC) sont les interférons (IFN) type I (α/β) et III (λ). La liaison d’IFNβ à son récepteur induit une voie antivirale bien caractérisée qui aboutit à l’activation du complexe ISGF3 (STAT1, STAT2 et IRF9) qui permet la transcription de multiples gènes codant pour des protéines à activité antivirale et immunorégulatrice. Il a récemment été démontré que la costimulation des cellules épithéliales pulmonaires par l’IFNβ et le Tumor Necrosis Factor α (TNFα), également produit lors d’une infection, synergisent pour induire un état antiviral tardif distinct. D’autre part, il a été montré que la synergie entre le TNFα et l'IFNβ induit une voie de signalisation impliquant STAT2 et IRF9, mais indépendante de STAT1 permettant l’expression du gène DUOX2. Notre but est de déterminer l’importance de cette nouvelle voie de signalisation induite par la costimulation du TNFα+IFNβ, impliquant STAT2 et IRF9 indépendamment de STAT1 dans la régulation d’un programme transcriptionnel antiviral et immunorégulateur tardif. Notre premier objectif est de déterminer si des gènes antiviraux et immunorégulateurs qui sont induits par la costimulation par TNFα+IFNβ sont dépendants de la voie STAT2/IRF9, indépendamment de STAT1. En utilisant la technique de qRT-PCR, nous avons identifié 3 gènes immunorégulateurs, CXCL10, IDO et APOBEC3G, induits de manière synergique en réponse à TNFα+IFNβ dans les cellules A549, un modèle de cellules épithéliales pulmonaires. Afin de confirmer que ces gènes sont induits indépendamment de STAT1, nous avons validé leur expression dans la lignée cellulaire U3A déficiente en STAT1. Par l'utilisation d'ARN interférants (ARNi) dirigés contre STAT2 et IRF9, nous avons confirmé que l’induction de ces gènes est dépendante de STAT2 et IRF9. Finalement, l’analyse de l’activité du promoteur de CXCL10 en réponse à TNFα+IFNβ par des essais rapporteurs luciférases a permis de montrer que la régulation se fait au niveau transcriptionnel. Notre deuxième objectif, est de déterminer si STAT6 pourrait remplacer STAT1 dans la voie de signalisation induite par TNFα+IFNβ. En effet, STAT6 est un inducteur connu de l’expression de DUOX2 en réponse à IL4+IL13. Contrairement à notre hypothèse, l’inhibition de STAT6 par ARNi augmente l’expression de DUOX2 en réponse à TNFα+IFNβ suggérant que STAT6 est un régulateur négatif. Nos résultats ont permis de comprendre de manière plus détaillée les mécanismes mis en place dans le développement d’une réponse antivirale. D’autre part, l’étude de l’effet de l’IFNβ et du TNFα est également pertinente pour les maladies chroniques inflammatoires et autoimmunes. De plus, nos résultats illustrent un nouveau paradigme concernant les mécanismes de signalisation cellulaire impliqués dans la synergie entre deux cytokines qui pourrait être applicable à des combinaisons de cytokines autres que TNFα+IFNβ.