Homéostasie des histones en réponse au dommage à l’ADN et étude d’inhibiteurs de désacétylases d’importance clinique

La chromatine possède une plasticité complexe et essentielle pour répondre à différents mécanismes cellulaires fondamentaux tels la réplication, la transcription et la réparation de l’ADN. Les histones sont les constituants essentiels de la formation des nucléosomes qui assurent le bon fonctionnement cellulaire d’où l’intérêt de cette thèse d’y porter une attention particulière. Un dysfonctionnement de la chromatine est souvent associé à l’émergence du cancer. Le chapitre II de cette thèse focalise sur la répression transcriptionnelle des gènes d’histones par le complexe HIR (HIstone gene Repressor) en réponse au dommage à l'ADN chez Saccharomyces cerevisiae. Lors de dommage à l’ADN en début de phase S, les kinases du point de contrôle Mec1, Tel1 et Rad53 s’assurent de bloquer les origines tardives de réplication pour limiter le nombre de collisions potentiellement mutagéniques ou cytotoxiques entre les ADN polymérases et les lésions persistantes dans l'ADN. Lorsque la synthèse totale d’ADN est soudainement ralentie par le point de contrôle, l’accumulation d'un excès d'histones nouvellement synthétisées est néfaste pour les cellules car les histones libres se lient de manière non-spécifique aux acides nucléiques. L'un des mécanismes mis en place afin de minimiser la quantité d’histones libres consiste à réprimer la transcription des gènes d'histones lors d'une chute rapide de la synthèse d'ADN, mais les bases moléculaires de ce mécanisme étaient très mal connues. Notre étude sur la répression des gènes d’histones en réponse aux agents génotoxiques nous a permis d’identifier que les kinases du point de contrôle jouent un rôle dans la répression des gènes d’histones. Avant le début de mon projet, il était déjà connu que le complexe HIR est requis pour la répression des gènes d’histones en phase G1, G2/M et lors de dommage à l’ADN en phase S. Par contre, la régulation du complexe HIR en réponse au dommage à l'ADN n'était pas connue. Nous avons démontré par des essais de spectrométrie de masse (SM) que Rad53 régule le complexe HIR en phosphorylant directement une de ses sous-unités, Hpc2, à de multiples résidus in vivo et in vitro. La phosphorylation d’Hpc2 est essentielle pour le recrutement aux promoteurs de gènes d’histones du complexe RSC (Remodels the Structure of Chromatin) dont la présence sur les promoteurs des gènes d'histones corrèle avec leur répression. De plus, nous avons mis à jour un nouveau mécanisme de régulation du complexe HIR durant la progression normale à travers le cycle cellulaire ainsi qu'en réponse aux agents génotoxiques. En effet, durant le cycle cellulaire normal, la protéine Hpc2 est très instable durant la transition G1/S afin de permettre la transcription des gènes d’histones et la production d'un pool d'histones néo-synthétisées juste avant l'initiation de la réplication de l’ADN. Toutefois, Hpc2 n'est instable que pour une brève période de temps durant la phase S. Ces résultats suggèrent qu'Hpc2 est une protéine clef pour la régulation de l'activité du complexe HIR et la répression des gènes d’histones lors du cycle cellulaire normal ainsi qu'en réponse au dommage à l’ADN. Dans le but de poursuivre notre étude sur la régulation des histones, le chapitre III de ma thèse concerne l’analyse globale de l’acétylation des histones induite par les inhibiteurs d’histone désacétylases (HDACi) dans les cellules normales et cancéreuses. Les histones désacétylases (HDACs) sont les enzymes qui enlèvent l’acétylation sur les lysines des histones. Dans plusieurs types de cancers, les HDACs contribuent à l’oncogenèse par leur fusion aberrante avec des complexes protéiques oncogéniques. Les perturbations causées mènent souvent à un état silencieux anormal des suppresseurs de tumeurs. Les HDACs sont donc une cible de choix dans le traitement des cancers engendrés par ces protéines de fusion. Notre étude de l’effet sur l’acétylation des histones de deux inhibiteurs d'HDACs de relevance clinique, le vorinostat (SAHA) et l’entinostat (MS-275), a permis de démontrer une augmentation élevée de l’acétylation globale des histones H3 et H4, contrairement à H2A et H2B, et ce, autant chez les cellules normales que cancéreuses. Notre quantification en SM de l'acétylation des histones a révélé de façon inattendue que la stœchiométrie d'acétylation sur la lysine 56 de l’histone H3 (H3K56Ac) est de seulement 0,03% et, de manière surprenante, cette stœchiométrie n'augmente pas dans des cellules traitées avec différents HDACi. Plusieurs études de H3K56Ac chez l’humain présentes dans la littérature ont rapporté des résultats irréconciliables. Qui plus est, H3K56Ac était considéré comme un biomarqueur potentiel dans le diagnostic et pronostic de plusieurs types de cancers. C’est pourquoi nous avons porté notre attention sur la spécificité des anticorps utilisés et avons déterminé qu’une grande majorité d’anticorps utilisés dans la littérature reconnaissent d’autres sites d'acétylation de l’histone H3, notamment H3K9Ac dont la stœchiométrie d'acétylation in vivo est beaucoup plus élevée que celle d'H3K56Ac. De plus, le chapitre IV fait suite à notre étude sur l’acétylation des histones et consiste en un rapport spécial de recherche décrivant la fonction de H3K56Ac chez la levure et l’homme et comporte également une évaluation d’un anticorps supposément spécifique d'H3K56Ac en tant qu'outil diagnostic du cancer chez l’humain.

Quantitative proteomics methods for the analysis of histone post-translational modifications

Les histones sont des protéines nucléaires hautement conservées chez les cellules des eucaryotes. Elles permettent d’organiser et de compacter l’ADN sous la forme de nucléosomes, ceux-ci representant les sous unités de base de la chromatine. Les histones peuvent être modifiées par de nombreuses modifications post-traductionnelles (PTMs) telles que l’acétylation, la méthylation et la phosphorylation. Ces modifications jouent un rôle essentiel dans la réplication de l’ADN, la transcription et l’assemblage de la chromatine. L’abondance de ces modifications peut varier de facon significative lors du developpement des maladies incluant plusieurs types de cancer. Par exemple, la perte totale de la triméthylation sur H4K20 ainsi que l’acétylation sur H4K16 sont des marqueurs tumoraux spécifiques a certains types de cancer chez l’humain. Par conséquent, l’étude de ces modifications et des événements determinant la dynamique des leurs changements d’abondance sont des atouts importants pour mieux comprendre les fonctions cellulaires et moléculaires lors du développement de la maladie. De manière générale, les modifications des histones sont étudiées par des approches biochimiques telles que les immuno-buvardage de type Western ou les méthodes d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Cependant, ces approches présentent plusieurs inconvénients telles que le manque de spécificité ou la disponibilité des anticorps, leur coût ou encore la difficulté de les produire et de les valider. Au cours des dernières décennies, la spectrométrie de masse (MS) s’est avérée être une méthode performante pour la caractérisation et la quantification des modifications d’histones. La MS offre de nombreux avantages par rapport aux techniques traditionnelles. Entre autre, elle permet d’effectuer des analyses reproductibles, spécifiques et facilite l’etude d’un large spectre de PTMs en une seule analyse. Dans cette thèse, nous présenterons le développement et l’application de nouveaux outils analytiques pour l’identification et à la quantification des PTMs modifiant les histones. Dans un premier temps, une méthode a été développée pour mesurer les changements d’acétylation spécifiques à certains sites des histones. Cette méthode combine l’analyse des histones intactes et les méthodes de séquençage peptidique afin de déterminer les changements d’acétylation suite à la réaction in vitro par l’histone acétyltransférase (HAT) de levure Rtt109 en présence de ses chaperonnes (Asf1 ou Vps75). Dans un second temps, nous avons développé une méthode d’analyse des peptides isomériques des histones. Cette méthode combine la LC-MS/MS à haute résolution et un nouvel outil informatique appelé Iso-PeptidAce qui permet de déconvoluer les spectres mixtes de peptides isomériques. Nous avons évalué Iso-PeptidAce avec un mélange de peptides synthétiques isomériques. Nous avons également validé les performances de cette approche avec des histones isolées de cellules humaines érythroleucémiques (K562) traitées avec des inhibiteurs d’histones désacétylases (HDACi) utilisés en clinique, et des histones de Saccharomyces cerevisiae liées au facteur d’assemblage de la chromatine (CAF-1) purifiées par chromatographie d’affinité. Enfin, en utilisant la méthode présentée précédemment, nous avons fait une analyse approfondie de la spécificité de plusieurs HATs et HDACs chez Schizosaccharomyces pombe. Nous avons donc déterminé les niveaux d’acétylation d’histones purifiées à partir de cellules contrôles ou de souches mutantes auxquelles il manque une HAT ou HDAC. Notre analyse nous a permis de valider plusieurs cibles connues des HATs et HDACs et d’en identifier de nouvelles. Nos données ont également permis de définir le rôle des différentes HATs et HDACs dans le maintien de l’équilibre d’acétylation des histones. Dans l’ensemble, nous anticipons que les méthodes décrites dans cette thèse permettront de résoudre certains défis rencontrés dans l’étude de la chromatine. De plus, ces données apportent de nouvelles connaissances pour l’élaboration d’études génétiques et biochimiques utilisant S. pombe.