Étude de la régulation du facteur de transcription NF-kB dans l'infection par le RSV

L’infection par le Virus Respiratoire Syncytial cause des affections pulmonaires aiguës en pédiatrie caractérisée par une réponse inflammatoire excessive médiée par la production de cytokines par les cellules épithéliales des voies aériennes. Les gènes codant pour ces cytokines sont régulés par le facteur de transcription NF-κB (p50/p65) dont l’activation est classiquement induite par la phosphorylation de son inhibiteur IκBα, ce qui permet l’accumulation de l’hétérodimère au noyau. Par contre, nous avons récemment identifié la phosphorylation en sérine 536 de la sous-unité p65 comme une autre étape essentielle à son activation lors de l’infection des AEC par RSV. Le travail présenté dans ce mémoire a permis de démontrer que l’inhibition de l’expression de RIG-I, de Cardif ou de TRAF6, 3 protéines impliquées dans la reconnaissance cellulaire des virus, conduit à l’inhibition de cette phosphorylation en réponse à RSV. Nous avons également établi à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques et d’ARNi que, parmi les diverses kinases connues pour phosphoryler p65 en réponse à divers stimulus, IKKα/β sont essentielles à cette phosphorylation lors d’une stimulation par RSV. Puisque TRAF6 est bien connu dans la littérature pour activer le complexe IKK, nous proposons que TRAF6, après reconnaissance de l’ARN viral de RSV par RIG-I, active le complexe IKK qui induit la phosphorylation de la sousunité p65 de NF-κB, permettant l’expression de gènes cibles. D’autre part, nous avions précédemment démontré que Nox2, un isoforme de NADPH oxydase, contrôle l’activation de NF-κB en régulant les phosphorylations de IκBα et p65. Nous montrons ici que l’inhibition de Nox2 réduit fortement l’activité du complexe kinase IKK. De plus, la présence au niveau basal de Nox2 est critique pour le niveau d’ARN messager de Cardif. Nous proposons donc que la régulation de la phosphorylation de p65 en ser536 par Nox2 soit via son effet sur Cardif en permettant la fonctionnalité de la voie RIG-I.

Étude des voies de signalisation en amont et en aval de la petite GTPase Rac1

Les évènements moléculaires en amont et en aval de la petite GTPase Rac1 menant à la migration cellulaire sont encore mal compris. La première partie du projet consiste à utiliser une approche protéomique non-biaisée pour tenter d’identifier les partenaires de Rac. Pour ce faire, nous avons développé une méthode de purification efficace et rapide de manière à maintenir les complexes protéiques transitoires intacts. Dans un deuxième temps, nous avons identifié des sites de phosphorylation sur la RacGEF atypique Dock5 en aval des intégrines. Afin de mieux comprendre le rôle de la phosphorylation de cette protéine, nous avons criblé une banque de kinases ce qui nous a permis d’identifier 14 kinases pouvant phosphoryler la région PXXP de Dock5. D’après nos résultats, ceci aurait comme effet de diminuer l’interaction entre Dock5 et ses partenaires contenant des domaines SH3. Ainsi, la phosphorylation de Dock5 régulerait la formation de complexes et le recrutement de Dock5 par des protéines adaptatrices.

Mécanismes moléculaires d’activation du récepteur A des peptides natriurétiques

Le récepteur A des peptides natriurétiques (NPRA) fait partie de la famille des guanylates cyclases membranaires. L’activation du NPRA par ses agonistes naturels, ANP et BNP, induit une production de GMPc qui est responsable de leur rôle dans l’homéostasie cardiovasculaire, l’inhibition de l’hypertrophie et de la fibrose cardiaques et la régulation de la lipolyse. Le NPRA est un homodimère non covalent composé d’un domaine extracellulaire de liaison du ligand (ECD), d’un unique domaine transmembranaire (TM), d’un domaine d’homologie aux kinases et d’un domaine guanylate cyclase. Bien que le NPRA ait un rôle physiologique important, les mécanismes moléculaires régissant son processus d’activation restent inconnus. Nous avons donc analysé les premières étapes du processus d’activation du NPRA. Nous avons d'abord étudié le rôle de la dimérisation des ECD dans l’activation du récepteur. Nous avons utilisé les techniques de liaison de radioligand, de FRET et de modélisation moléculaire, pour caractériser la liaison à l’ECD des agonistes naturels, d’un superagoniste et d’un antagoniste. L’ANP se lie à un dimère d’ECD préformé et la dimérisation spontanée est l’étape limitante du processus de liaison. De plus, comme le démontrent nos études de FRET, tous les peptides, incluant l’antagoniste, stabilisent le récepteur sous sa forme dimérique. Cependant, l’antagoniste A71915 stabilise le dimère d’ECD dans une conformation différente de celle induite par l’ANP. La dimérisation du NPRA semble donc nécessaire, mais non suffisante à l’activation du récepteur. L’état d’activation du NPRA dépend plutôt de l’orientation des sous unités dans le dimère. Nous avons ensuite étudié le mécanisme moléculaire de transduction du signal à travers la membrane. Plusieurs études ont suggéré que l’activation du NPRA implique un changement de conformation du domaine juxtamembranaire (JM). Cependant, les études de cristallographie de l’ECD soluble de NPRA n’ont pas permis de documenter la structure du JM et le changement de conformation impliqué dans la transduction du signal reste inconnu. Pour analyser ce changement de conformation, nous avons d’abord séquentiellement substitué les neuf acides aminés du JM par une cystéine. En étudiant la capacité des mutants à former des dimères covalents de façon constitutive ou induite par l’ANP, nous avons pu évaluer la proximité relative des résidus du JM, avant et après activation du NPRA. Ces résultats ont démontré la proximité élevée de certains résidus spécifiques et sont en contradiction avec les données cristallographiques. Nous avons également démontré que le domaine intracellulaire impose une contrainte conformationnelle au JM à l’état de base, qui est levée après liaison de l’ANP. En introduisant de 1 à 5 alanines dans l’hélice-α transmembranaire, nous avons montré qu’une rotation des TM de 40° induit une activation constitutive du NPRA. Le signal d’activation pourrait donc être transmis à travers la membrane par un mécanisme de rotation des TM. En utilisant nos données expérimentales, nous avons généré le premier modèle moléculaire illustrant la conformation active du NPRA, où les domaines JM et TM sont représentés. Dans son ensemble, cette étude apporte une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires régissant les premières étapes du processus complexe d’activation du NPRA.

Rôle de la protéine phosphatase PPM1A dans l'homéostasie hépatique du glucose et des lipides

L’insuline est une hormone essentielle qui induit des réponses complexes dans l’organisme pour maintenir l’homéostasie du glucose et des lipides. La résistance à son action est un phénomène pathologique observé dans un large éventail de situations, allant de l’obésité et du syndrome métabolique à la stéatose hépatique et au diabète de type 2, qui aboutissent au développement de l’athérosclérose et de la mortalité. Des avancées remarquables ont été réalisées dans notre compréhension des mécanismes moléculaires responsables du développement de la résistance à l’action de l’insuline. En particulier, l’induction d’un stress cellulaire par des taux élevés d’acides gras libres (AGL) et des cytokines, via l’activation des protéines Ser/Thr kinases, qui augmente la phosphorylation sur des résidus sérine, des molécules critiques impliquées dans la signalisation insulinique (p. ex. IR, IRS et p85) et conduit à la diminution de la réponse cellulaire à l’insuline. Cependant, la plupart des chercheurs ont limité leur travail dans l’investigation du rôle des protéines kinases susceptibles de modifier la réponse cellulaire à l’insuline. Donc, peu de données sont disponibles sur le rôle des Protéines Ser/Thr phosphatases (PS/TPs), même si il est bien établi que la phosphorylation de ces protéines est étroitement régulée par un équilibre entre les activités antagonistes des Ser/Thr kinases et des PS/TPs. Parmi les PS/TPS, PPM1A (également connu sous le nom PP2Cα) est une phosphatase particulièrement intéressante puisqu’il a été suggéré qu’elle pourrait jouer un rôle dans la régulation du métabolisme lipidique et du stress cellulaire. Ainsi, en se basant sur des résultats préliminaires de notre laboratoire et des données de la littérature, nous avons émis l’hypothèse selon laquelle PPM1A pourrait améliorer la sensibilité à l’insuline en diminuant l’activité des protéines kinases qui seraient activées par le stress cellulaire induit par l’augmentation des AGL. Ces effets pourraient finalement améliorer le métabolisme glucidique et lipidique dans l’hépatocyte. Ainsi, pour révéler le rôle physiologique de PPM1A à l’échelle d’un animal entier, nous avons généré un modèle animal qui la surexprime spécifiquement dans le foie. Nous décrivons ici notre travail afin de générer ce modèle animal ainsi que les premières analyses pour caractériser le phénotype de celui-ci. Tout d’abord, nous avons remarqué que la surexpression de PPM1A chez les souris C57BL/6J n’a pas d’effets sur le gain de poids sur une longue période. Deuxièmement, nous avons observé que PPM1A a peu d’effets sur l’homéostasie du glucose. Par contre, nous avons montré que sa surexpression a des effets significatifs sur l’homéostasie du glycogène et des triglycérides. En effet, nous avons observé que le foie des souris transgéniques contient moins de glycogène et de triglycérides que le foie de celles de type sauvage. De plus, nos résultats suggèrent que les effets de la surexpression de PPM1A pourraient refléter son impact sur la synthèse et la sécrétion des lipides hépatiques puisque nous avons observé que sa surexpression conduit à l’augmentation la triglycéridémie chez les souris transgéniques. En conclusion, nos résultats prouvent l’importance de PPM1A comme modulateur de l’homéostasie hépatique du glucose et des lipides. Des analyses supplémentaires restent cependant nécessaires pour confirmer ceux-ci et éclaircir l’impact moléculaire de PPM1A et surtout pour identifier ses substrats.

Étude de la polyubiquitination en lysine 63 dans les effets proinflammatoires de l'angiotensine II in vitro

Les évidences scientifiques révèlent l’implication des actions proinflammatoires de l’angiotensine II (Ang II) dans le développement de l’athérosclérose. Cependant, la caractérisation des bases moléculaires de l’Ang II sur le tissu vasculaire n’est pas totalement élucidée. La majorité des actions de l’Ang II implique l’activation d’une variété de cascades de signalisation dont les voies mitogen-activated protein kinases (MAPKs) ; c-Jun N-terminal kinases (JNKs), p38 kinases et extracellular signal-regulated kinases (ERK) et l’activation du facteur de transcription NF-κB via le complexe IKK. Récemment, une nouvelle modification post-traductionnelle dans les actions de l’Ang II, soit la polyubiquitination de la sous-unité NF-κB essential modulator (NEMO) du complexe IKK, a été révélée. L’objectif de mon projet de recherche est de vérifier l’importance de la polyubiquitination en K63 tout en caractérisant les protéines impliquées dans la modification de NEMO dans des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) exposées à l’Ang II. Notre étude suggère, selon une approche siARN combinant Ubc7 et Ubc13, la diminution de la phosphorylation du complexe IKK, de Akt et des MAPKs. De plus, nos résultats illustrent l’implication de TRAF6 dans la signalisation cellulaire de l’Ang II. Finalement, notre étude révèle la présence de la polyubiquitination en K63 dans la signalisation cellulaire de l’Ang II par chromatographie d’affinité. Cette étude met en évidence l’implication de la polyubiquitination en K63 dans la signalisation de l’Ang II dans des CMLV et implique Ubc13 et Ubc7 dans le remodelage vasculaire et l’inflammation dépendante de l’Ang II dans des CMLV.

Caractérisation de la MAP kinase atypique Erk4 : activation et fonction physiologique

Les MAP kinases sont des enzymes essentielles impliquées dans 7 voies de signalisation distinctes qui permettent à la cellule de répondre de manière adéquate aux stimuli extra-cellulaires. Chez les mammifères, les MAP kinases les mieux caractérisées sont Erk1/2, Jnk, p38 et Erk5. Ces enzymes jouent un rôle important dans l’embryogenèse, la prolifération et la différenciation cellulaire ainsi que dans la réponse au stress. Erk4 est un membre atypique de la famille MAP kinase. D’une part, la boucle d’activation de Erk4 possède un motif SEG au lieu du motif TXY, très conservé chez les MAP kinases. D’autre part, Erk4 possède une extension en C-terminal du domaine kinase qui n’est pas présente chez les MAP kinases classiques. Jusqu’à présent aucune fonction n’a été attribuée à Erk4. De plus, la voie de signalisation ainsi que le mode de régulation conduisant à l’activation de Erk4 ne sont pas connus. Le seul substrat de Erk4 identifié jusqu’à maintenant est la MAPKAP kinase MK5. L’impact fonctionnel de cette interaction n’est également pas connu. Afin d’en apprendre davantage sur la MAP kinase atypique Erk4, nous avons étudié le mécanisme d’activation de cette kinase ainsi que sa fonction physiologique par une approche de délétion génique chez la souris. En ce qui concerne l’activation de Erk4, nous avons montré que la boucle d’activation de Erk4 (S186EG) est constitutivement phosphorylée in vivo et que cette phosphorylation n’est pas modulée par les stimuli classiques des MAP kinases dont le sérum et le sorbitol. Cependant, nous avons observé que la phosphorylation de la S186 augmente en présence de MK5 et que cette augmentation est indépendante de l’activité kinase de l’une ou l’autre de ces kinases. De plus, nous avons établi que la phosphorylation de la boucle d’activation de Erk4 est requise pour l’interaction stable entre Erk4 et MK5 ainsi que pour l’activation, et la relocalisation cytoplasmique de MK5. Ainsi, notre étude a permis de révéler que Erk4 est régulée de manière différente des MAP kinases classiques et que la phosphorylation de la boucle d’activation de Erk4 joue un rôle essentiel dans la régulation de l’activité de MK5. Parallèlement, nos résultats mettent en évidence l’existence d’une “Erk4 kinase”, dont le recrutement et/ou l’activation semble être facilité par MK5. Afin identifier la fonction physiologique de Erk4, nous avons généré des souris Erk4-déficientes. L’inactivation génique de Erk4 est viable et les souris ne présentent aucune anomalie apparente. Dans le but d’expliquer l’absence de phénotype, nous avons regardé si l’expression de Erk3, le paralogue de Erk4, pouvait compenser la perte de Erk4. Notre analyse a révélé que l’expression de Erk3 dans les souris Erk4-/- n’augmente pas au cours du développement embryonnaire ou dans les tissus adultes afin de compenser pour la perte de Erk4. Par la suite, nous avons adressé la question de redondance entre Erk4 et Erk3. Dans notre laboratoire, les souris Erk3-déficientes ont également été générées et le phénotype de ces souris a récemment été analysé. Cette étude a révélé que l’inactivation génique de Erk3 entraîne un retard de croissance intra-utérin, un défaut de maturation pulmonaire et la mort néo-natale des souriceaux. Nous avons donc regardé la contribution de Erk4 dans ces phénotypes. L’analyse des souris Erk4-/- a révélé que l’inactivation de Erk4 n’entraîne pas de retard de croissance ou de maturation du poumon. De plus, nous avons montré que l’inactivation additionnelle de Erk4 dans les souris Erk3-/- n’accentue pas le phénotype des souris Erk3-déficientes. Ainsi, notre étude a révélé que contrairement à Erk3, Erk4 n’est pas essentielle au développement murin dans des conditions physiologiques. Parallèlement, nous avons montré que Erk4 et Erk3 possèdent des fonctions non-redondantes in vivo.

Régulation de protéine C-réactive vasculaire dans le diabète de type 2

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de mortalité dans les pays occidentaux et représentent une complication majeure du syndrome métabolique. Il est maintenant largement admis que l’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique et que l’inflammation joue un rôle pathogénique majeur dans l’initiation et la progression de la maladie athéromateuse. Il a été démontré qu’une augmentation des niveaux sériques de la protéine c-réactive (CRP), une protéine de la phase aigüe et un important constituant de la réponse immunitaire de type inné, est associée à un risque cardiovasculaire accru. Ainsi, il a été documenté qu’une augmentation de CRP, tant chez les sujets sains que chez les sujets diabétiques, était associée à une augmentation du risque de morbidité et de mortalité cardiovasculaires. De multiples évidences suggèrent que la CRP puisse non seulement constituer un marqueur de risque des maladies cardiovasculaires mais aussi représenter un facteur pro-athérogénique direct. La dysfonction endothéliale représente un des stades les plus précoces du processus athérosclérotique et un rôle de la CRP dans la pathogenèse de la dysfonction endothéliale est postulé. Outre son origine systémique, la CRP est produite dans la lésion athérosclérotique et par diverses cellules vasculaires, dont les cellules endothéliales. Afin d’élucider le rôle de la CRP vasculaire dans l’altération de la fonction endothéliale associée au syndrome métabolique, nous avons étudié la régulation de l’expression endothéliale de la CRP par les acides gras libres (AGL) et le rôle de la CRP endothéliale dans l’inhibition de la synthèse d’oxyde nitrique (NO) par les AGL. Nos résultats démontrent que :1) l’acide palmitique (PA) induit l’expression génique de CRP au niveau de cellules endothéliales aortiques humaines (HAECs) en culture et, augmente, de manière dose-dépendante, l’expression protéique de la CRP; 2) La pré-incubation des HAECs avec des antioxydants et des inhibiteurs de la i) protéine kinase C (PKC), ii) du facteur nucléaire-kappa B, iii) des Janus kinases et des protéines de transduction et de régulation de la transcription et iv) des protéines kinases activées par les mitogènes prévient l’effet stimulant du PA sur l’expression protéique et génique de la CRP; 3) Le traitement des HAECs par le PA induit une augmentation de la production des espèces réactives oxygénées, un effet prévenu par les inhibiteurs de la PKC et par l’AICAR(5-amino-4-imidazole carboxamide 1-β-D-ribofuranoside), un activateur de la protéine kinase activée par l’AMP; 4) L’incubation des HAECs en présence de PA résulte enfin en une diminution de la production basale endothéliale de NO, un effet abrogé par la préincubation de ces cellules avec un anticorps anti-CRP. Dans l’ensemble, ces données démontrent un effet stimulant du PA sur l’expression de la CRP endothéliale via l’activation de kinases et de facteurs de transcription sensibles au stress oxydatif. Ils suggèrent en outre un rôle de la CRP dans la dysfonction endothéliale induite par les AGL.

Élaboration d’un bioessai à haut débit pour la découverte de nouveaux ligands péptidiques chez les végétaux

Suite au projet de séquençage du génome d’Arabidopsis thaliana, plus de 400 récepteurs de types serine/thréonine kinases (Protein Receptor Kinase ou PRK) ont été prédits. Par contre, seulement sept paires de récepteurs/ligands ont été caractérisées jusqu’à présent par des techniques de biochimie et d’analyse, de mutants. Parmi ceux-ci figurent les PRK : BRI1, CLV1, SRK, SR160, Haesa-IDA et PEPR1 qui jouent un rôle important dans le développement, l’auto-incompatibilité sporophytique et les mécanismes de défense. Le but de mon projet de maîtrise était de développer un bioessai à haut débit qui permettra la découverte de ligands peptidiques. Le bioessai utilisera des PRK chimériques composés du domaine extracellulaire (l’ectodomaine) de la PRK à l’étude fusionnée au domaine intracellulaire d’une PRK qui agira comme rapporteur. Deux stratégies sont présentement développées dans notre laboratoire : la première consiste à fusionner la PRK à l’étude avec le domaine intracellulaire (l’endodomaine) du récepteur tyrosine kinase animal EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). Suite à l’interaction avec une fraction protéique contenant un ligand correspondant à la PRK étudiée, une transphosphorylation de l’endodomaine (le domaine kinase) serait détectable. La seconde stratégie utilise l’endodomaine du récepteur BRI1, un récepteur répondant aux brassinostéroïdes. Suite à l’interaction avec une fraction protéique contenant un ligand correspondant à la PRK étudiée, cette fois-ci nous devrions être en mesure de mesurer l’activation d’un gène rapporteur répondant normalement à une activation par les brassinostéroïdes.

Growth factor activation of ErbB2/ErbB3 signaling pathways regulate the activity of Estrogen Receptors (ER)

La signalisation par l’estrogène a longtemps été considérée comme jouant un rôle critique dans le développement et la progression des cancers hormono-dépendants tel que le cancer du sein. Deux tiers des cancers du sein expriment le récepteur des estrogènes (ER) qui constitue un élément indiscutable dans cette pathologie. L’acquisition d’une résistance endocrinienne est cependant un obstacle majeur au traitement de cette forme de cancer. L’émergence de cancers hormono-indépendants peut est produite par l’activation de ER en absence d’estrogène, l’hypersensibilité du récepteur aux faibles concentrations plasmique d’estrogène ainsi que l’activation de ER par des modulateurs sélectifs. L’activité du ER est fortement influencée par l’environnement cellulaire tel que l’activation de voie de signalisation des facteurs de croissances, la disponibilité de protéines co-régulatrices et des séquences promotrices ciblées. Présentement, les études ont principalement considérées le rôle de ERα, cependant avec la découverte de ERβ, notre compréhension de la diversité des mécanismes potentiels impliquant des réponses ER-dépendantes s’est améliorée. L’activation des voies des kinases par les facteurs de croissance entraîne le développement d’un phénotype tumoral résistant aux traitements actuels. Nos connaissances des voies impliquées dans l’activation de ER sont restreintes. ERα est considéré comme le sous-type dominant et corrèle avec la plupart des facteurs de pronostic dans le cancer du sein. Le rôle de ERβ reste imprécis. Les résultats présentés dans cette thèse ont pour objectif de mieux comprendre l’implication de ERβ dans la prolifération cellulaire par l’étude du comportement de ERβ et ERα suite à l’activation des voies de signalisation par les facteurs de croissance. Nous démontrons que l’activation des récepteurs de surfaces de la famille ErbB, spécifiquement ErbB2/ErbB3, inhibe l’activité transcriptionnelle de ERβ, malgré la présence du coactivateur CBP, tout en activant ERα. De plus, l’inhibition de ERβ est attribuée à un résidu sérine (Ser-255) situé dans la région charnière, absente dans ERα. Des études supplémentaires de ErbB2/ErbB3 ont révélé qu’ils activent la voie PI3K/Akt ciblant à son tour la Ser-255. En effet, cette phosphorylation de ERβ par PI3K/Akt induit une augmentation de l’ubiquitination du récepteur qui promeut sa dégradation par le système ubiquitine-protéasome. Cette dégradation est spécifique pour ERβ. De façon intéressante, la dégradation par le protéasome requiert la présence du coactivateur CBP normalement requis pour l’activité transcriptionnelle des récepteurs nucléaires. Malgré le fait que l’activation de la voie PI3K/Akt corrèle avec une diminution de l’expression des gènes sous le contrôle de ERβ, on observe une augmentation de la prolifération des cellules cancéreuses. L’inhibition de la dégradation de ERβ réduit cette prolifération excessive causée par le traitement avec Hrgβ1, un ligand de ErbB3. Un nombre croissant d’évidences indique que les voies de signalisations des facteurs de croissance peuvent sélectivement réguler l’activité transcriptionnelle de sous-types de ER. De plus, le ratio ERα/ERβ dans les cancers du sein devient un outil de diagnostique populaire afin de déterminer la sévérité d’une tumeur. En conclusion, la caractérisation moléculaire du couplage entre la signalisation des facteurs de croissance et la fonction des ERs permettra le développement de nouveaux traitements afin de limiter l’apparition de cellules tumorales résistantes aux thérapies endocriniennes actuelles.

Régulation de l'activité transcriptionnelle du récepteur nucléaire FXR par la ghréline et les modifications post-traductionnelles

Le récepteur X des farnésoïdes (FXR) fait partie de la superfamille des récepteurs nucléaires et agit comme un facteur de transcription suite à la liaison d’un ligand spécifique. Le récepteur FXR, activé par les acides biliaires, joue un rôle essentiel dans le métabolisme des lipides et du glucose en plus de réguler l’homéostasie des acides biliaires. Notre laboratoire a récemment mis en évidence une nouvelle voie de régulation du récepteur PPARγ en réponse au récepteur de la ghréline. En effet, la ghréline induit l’activation transcriptionnelle de PPARγ via une cascade de signalisation impliquant les kinases Erk1/2 et Akt, supportant un rôle périphérique de la ghréline dans les pathologies associées au syndrome métabolique. Il est de plus en plus reconnu que la cascade métabolique impliquant PPARγ fait également intervenir un autre récepteur nucléaire, FXR. Dans ce travail, nous montrons que la ghréline induit l’activation transcriptionnelle de FXR de manière dose-dépendante et induit également la phosphorylation du récepteur sur ses résidus sérine. En utilisant des constructions tronquées ABC et CDEF de FXR, nous avons démontré que la ghréline régule l’activité de FXR via les domaines d’activation AF-1 et AF-2. L’effet de la ghréline et du ligand sélectif GW4064 sur l’induction de FXR est additif. De plus, nous avons démontré que FXR est la cible d’une autre modification post-traductionnelle, soit la sumoylation. En effet, FXR est un substrat cellulaire des protéines SUMO-1 et SUMO-3 et la sumoylation du récepteur est ligand-indépendante. SUMO-1 et SUMO-3 induisent l’activation transcriptionnelle de FXR de façon dose-dépendante. Nos résultats indiquent que la lysine 122 est le site prédominant de sumoylation par SUMO-1, quoiqu’un mécanisme de coopération semble exister entre les différents sites de sumoylation de FXR. Avec son rôle émergeant dans plusieurs voies du métabolisme lipidique, l’identification de modulateurs de FXR s’avère être une approche fort prometteuse pour faire face à plusieurs pathologies associées au syndrome métabolique et au diabète de type 2.

Hydrogen peroxide enhances the expression and function of Giα proteins in aortic vascular smooth muscle cells from Sprague-Dawley rats : role of growth factor receptors transactivation

Nous avons récemment démontré que les espèces réactives oxygénées induisent une augmentation de l’expression des protéines Giα dans les cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) provenant d’aortes de rats spontanément hypertendus (SHR, de l’anglais spontaneously hypertensive rats). La présente étude a pour but d’étudier les effets du peroxyde d’hydrogène (H2O2), un oxydant qui induit le stress oxydatif, sur l’expression de Giα et sur l’activité de l’adénylate cyclase, et d’explorer les voies de signalisation sous-jacentes responsables de cette réponse. Nos résultats montrent que H2O2 induit une augmentation de l’expression des protéines Giα-2 et Giα-3 de manière dose- et temps-dépendante avec une augmentation maximale de 40-50% à 100 µM après 1 heure, sans affecter l’expression de Gsα. L’expression des protéines Giα a été maintenue au niveau normal en presence de AG 1478, AG1295, PD98059 et la wortmannine, des inhibiteurs d’EGF-R (de l’anglais epidermal growth factor receptor), PDGFR-β (de l’anglais platelet-derived growth factor receptor β), de la voie de signalisation ras-ERK1/2 (de l’anglais extracellular regulated kinase1/2), et de la voie de la PI3Kinase-AKT (de l’anglais phosphatidyl inositol-3 kinase), respectivement. En outre, le traitement des CMLV avec H2O2 a induit une augmentation du degré de phosphorylation d’EGF-R, PDGF-R, ERK1/2 et AKT; et cette expression a été maintenue au niveau témoin par leurs inhibiteurs respectifs. Les inhibiteurs d’EGF-R et PDGF-R ont aussi induit une diminution du degré de phosphorylation de ERK1/2, et AKT/PKB. En outre, la transfection des cellules avec le siRNA (de l’anglais, small interfering ribonucleic acid) de EGF-R et PDGFR-β a atténué la surexpression des protéines Giα-2 et Giα-3 induite par le traitement au H2O2. La surexpression des protéines Giα induite par H2O2 a été corrélée avec une augmentation de la fonction de la protéine Giα. L’inhibition de l’activité de l’adénylate cyclase par de faibles concentrations de GTPγS après stimulation par la forskoline a augmenté de 20% dans les cellules traitées au H2O2. En outre, le traitement des CMLV au H2O2 a aussi accru l’inhibition de l’activité de l’adénylate cyclase par les hormones inhibitrices telles que l’angiotensine II, oxotrémorine et C-ANP4-23. D’autre part, la stimulation de l’adénylate cyclase induite par GTPγS, glucagon, isoprotérénol, forskoline, et le fluorure de sodium (NaF) a été atténuée de façon significative dans les cellules traitées au H2O2. Ces résultats suggèrent que H2O2 induit la surexpression des protéines Giα-2 and Giα-3 via la transactivation des récepteurs des facteurs de croissance EGF-R, PDGFR-β et l’activation des voies de signalisation ras-ERK1/2 et PI3K-AKT Mot-cles: Protéines Giα, peroxyde d’hydrogène, stress oxydant, récepteurs des facteurs de croissance, MAP kinases, adénylate cyclase, hypertension

L’œstrogène : un rôle potentiel dans la modulation de l’activation pro-inflammatoire des cellules endothéliales vasculaires par la voie du Toll-Like Receptor 2

Grâce aux nombreuses études sur le sujet, nous savons qu’une stimulation inflammatoire vasculaire excessive entraîne un débalancement des fonctions homéostatiques de l’endothélium. Ce débalancement est à l’origine d’une dysfonction endothéliale définie comme étant l’étape clé contribuant au développement de l’athérosclérose. Le Toll-like receptor-2 (TLR2) est impliqué dans l’activation cellulaire via la transcription des gènes liés à l’inflammation. Il reconnaît des molécules microbiennes mais également des facteurs endogènes non-infectieux tels que sécrétés par les tissus endommagés provenant de la dysfonction endothéliale. Ainsi, l’activation et la signalisation du TLR2 sont en étroite relation avec le développement de l’athérosclérose. Les études épidémiologiques ont confirmé le rôle athéroprotecteur de l’œstrogène via de nombreux mécanismes d’action. Ainsi, nous avons cherché à identifier de nouvelles cibles moléculaires permettant de mieux interpréter les bénéfices potentiels de l’œstrogène sur le système cardiaque. Pour la première fois chez les cellules endothéliales (CE) vasculaires de souris, nos travaux ont confirmé l’effet anti-inflammatoire de l’œstrogène via la diminution de l’expression et de l’activité du TLR2. Nous avons également déterminé l’influence de l’œstrogène sur le profil de la réponse inflammatoire de ce récepteur en mesurant les potentiels endothéliaux de migration et d’adhésion. De plus, nous avons caractérisé les voies de signalisation impliquées en démontrant l’influence négative de l’œstrogène sur la phosphorylation des kinases activées par le TLR2; illustrant l’interaction entre l’œstrogène et la signalisation de ce récepteur. Nos travaux amènent ainsi de nouvelles connaissances sur la régulation endothéliale du TLR2 et mettent en lumière les effets anti-inflammatoires et vasculaires rapides de l’œstrogène.

Implication de la voie ERK3/4-MK5 dans la phase G2/M du cycle cellulaire

La division cellulaire est influencée par les différents stimuli provenant de l’extérieur ou de l’intérieur de la cellule. Plusieurs réseaux enzymatiques élaborés au cours de l’évolution relayent l’information générée par ces signaux. Les modules MAP kinases sont extrêmement importants au sein de la cellule. Chez l’humain, 14 MAP kinases sont regroupées en sept voies distinctes intervenant dans le contrôle d’une myriade de processus cellulaires. ERK3/4 sont des homologues de ERK1/2 pour lesquelles on ne connaît que très peu de choses concernant leurs fonctions et régulation. Ces MAP kinases sont dites atypiques puisqu’elles ont des particularités structurales et des modes de régulation qui diffèrent des autres MAP kinases classiques. Ainsi, notre laboratoire a démontré que l’activité de ERK3 est régulée par le système ubiquitine-protéasome et qu’elle pourrait avoir un rôle à jouer dans le contrôle de la différenciation et la prolifération cellulaire. La première étude présentée décrit la régulation de ERK3 au cours du cycle cellulaire. Nous avons observé que ERK3 est hyperphosphorylée et s’accumule spécifiquement au cours de la mitose. Des analyses de spectrométrie de masse ont mené à l’identification de quatre sites de phosphorylation situés à l’extrémité du domaine C-terminal. Nous avons pu démontrer que la kinase mitotique CDK1/cycline B phosphoryle ces sites et que les phosphatases CDC14A et CDC14B les déphosphorylent. Finalement, nous démontrons que la phosphorylation mitotique de ERK3 a pour effet de la stabiliser. Au début de mes études doctorales, la kinase MK5 fut identifiée comme premier partenaire et substrat de ERK3. MK5 a très peu de fonctions connues. Des données dans la littérature suggèrent qu’elle peut moduler le cycle cellulaire dans certaines conditions. Par exemple, MK5 a récemment été identifié comme inducteur de la sénescence induite par l’oncogène Ras. Dans la deuxième étude, nous décrivons une nouvelle fonction de MK5 dans le contrôle du cycle cellulaire. Nous démontrons par des expériences de gain et perte de fonction que MK5 ralentit l’entrée en mitose suite à un arrêt de la réplication. Cette fonction est dépendante de l’activité enzymatique de MK5 qui régule indirectement l’activité de CDK1/cycline B. Finalement, nous avons identifié Cdc25A comme un nouveau substrat in vitro de MK5 dont la surexpression supprime l’effet de MK5 sur l’entrée en mitose. En conclusion, nos résultats décrivent un nouveau mécanisme de régulation de ERK3 au cours de la mitose, ainsi qu’une nouvelle fonction pour MK5 dans le contrôle de l’entrée en mitose en réponse à des stress de la réplication. Ces résultats démontrent pour la première fois l’implication de ces protéines au cours de la transition G2/M. Nos travaux établissent de nouvelles pistes d’études pour mieux comprendre les rôles encore peu définis des kinases ERK3/4-MK5.

Exploring Rac GTPase regulation : the molecular mechanisms governing the DOCK180 and ELMO interaction and the role of this complex in Rac-mediated cell migration

Les protéines DOCK180 et ELMO coopèrent ensemble biochimiquement et génétiquement afin d’activer la GTPase Rac1 lors de plusieurs évènements biologiques. Toutefois, le rôle que jouent ces protéines dans la signalisation par Rac est encore mal compris. Nous émettons l’hypothèse que Dock180 agit comme activateur de Rac, alors que ELMO est requis pour l’intégration de la signalisation de Rac plutôt que son activation per se. Nous postulons que ELMO agit comme signal de localisation intracellulaire afin de restreindre de façon spatio-temporelle la signalisation de Rac en aval de Dock180, et/ou que ELMO agit comme protéine d’échafaudage entre Rac et ses effecteurs pour amplifier la migration cellulaire. Dans l’objectif nº 1, nous démontrons que le domaine PH atypique de ELMO1 est le site d’interaction principal entre cette protéine et DOCK180. De plus, nous démontrons que la liaison entre ELMO et DOCK180 n’est pas nécessaire pour l’activation de Rac, mais est plutôt essentielle pour faciliter la réorganisation du cytosquelette induite par l’activation de Rac en aval de Dock180. Ces résultats impliquent que ELMO pourrait jouer des rôles additionnels dans la signalisation par Rac. Dans l’objectif nº 2, nous avons découvert l’existence d’une homologie structurelle entre ELMO et un module d’autorégulation de la formine Dia1, et avons identifié trois nouveaux domaines dans la protéine ELMO : les domaines RBD, EID et EAD. De façon analogue à Dia1, nous avons découvert que ELMO à l’état basal est autoinhibé grâce à des intéractions intramoléculaires. Nous proposons que l’état d’activation des protéines ELMO est régulé de façon similaire aux formines de la famille Dia, c’est-à-dire grâce à des interactions avec d’autres protéines. Dans l’objectif nº 3, nous identifions un domaine RBD polyvalent chez ELMO. Ce domaine possède une double spécificité pour les GTPases de la famille Rho et Arf. Nous avons découvert que Arl4A agit comme signal de recrutement membranaire pour le module ELMO/DOCK180/Rac. Nos résultats nous permettent de supposer que d’autres GTPases pourraient être impliquées dans l’activation et la localisation de cette voie de signalisation. Nous concluons qu’à l’état basal, ELMO et DOCK180 forment un complexe dans lequel ELMO est dans sa conformation autoinhibée. Bien que le mécanisme d’activation de ELMO ne soit pas encore bien compris, nous avons découvert que, lorsqu’il y a stimulation cellulaire, certaines GTPases liées au GTP peuvent intéragir avec le domaine RBD de ELMO pour relâcher les contacts intramoléculaires et/ou localiser le complexe à la membrane. Ainsi, les GTPases peuvent servir d’ancrage au complexe ELMO/DOCK180 pour assurer une regulation spatiotemporelle adequate de l’activation et de la signalisation de Rac.

Bcl-xL regulation and function in cell cycle checkpoints and progression

Quelques évidences suggèrent que Bcl-xL, un membre anti-apoptotique de la famille Bcl-2, possède également des fonctions au niveau du cycle cellulaire et de ses points-contrôle. Pour étudier la régulation et fonction de Bcl-xL au cours du cycle cellulaire, nous avons généré et exprimé dans des cellules humaines une série de mutants de phosphorylation incluant Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser49Ala, Ser56Ala, Ser62Ala et Thr115Ala. L'analyse de cette série de mutants révèle que les cellules exprimant Bcl-xL(Ser62Ala) sont moins stables au point-contrôle G2 du cycle cellulaire comparées aux cellules exprimant le type sauvage ou les autres mutants de phosphorylation incluant Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser56Ala et Thr115Ala. Les études de cinétiques de phosphorylation et de localisation de phospho-Bcl-xL(Ser62) dans des cellules synchronisées et suite à l'activation du point-contrôle en G2 médié par l'étoposide (VP16), nous indiquent que phospho-Bcl-xL(Ser62) migre dans les corps nucléolaires durant l'arrêt en G2 dans les cellules exposées au VP16. Une série d'expériences incluant des essais kinase in vitro, l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques et d'ARN interférant, nous révèlent que Polo kinase 1 (PLK1) et MAPK9/JNK2 sont les protéines kinase impliquées dans la phosphorylation de Bcl-xL(Ser62), et pour son accumulation dans les corps nucléolaires pendant le point-contrôle en G2. Nos résultats indiquent que durant le point-contrôle en G2, phospho-Bcl-xL(Ser62) se lie et se co-localise avec CDK1(CDC2), le complexe cycline-kinase qui contrôle l'entrée en mitose. Nos résultats suggèrent que dans les corps nucléolaires, phospho-Bcl-xL(Ser62) stabilise l'arrêt en G2 en séquestrant CDK1(CDC2) pour retarder l'entrée en mitose. Ces résultats soulignent également que les dommages à l'ADN influencent la composition des corps nucléolaires, structure nucléaire qui émerge maintenant comme une composante importante de la réponse aux dommages à l'ADN. Dans une deuxième étude, nous décrivons que les cellules exprimant le mutant de phosphorylation Bcl-xL(Ser62Ala) sont également plus stables au point-contrôle de l'assemblage du fuseau de la chromatine (SAC) suite à une exposition au taxol, comparées aux cellules exprimant le type sauvage ou d'autres mutants de phosphorylation de Bcl-xL, incluant Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser56Ala. Cet effet est indépendent de la fonction anti-apoptotique de Bcl-xL. Bcl-xL(Ser62) est fortement phosphorylé par PLK1 et MAPK14/SAPKp38α à la prométaphase, la métaphase et à la frontière de l'anaphase, et déphosphorylé à la télophase et la cytokinèse. Phospho-Bcl-xL(Ser62) se trouve dans les centrosomes avec γ-tubuline, le long du fuseau mitotique avec la protéine moteure dynéine et dans le cytosol mitotique avec des composantes du SAC. Dans des cellules exposées au taxol, phospho-Bcl-xL(Ser62) se lie au complexe inhibiteur CDC20/MAD2/BUBR1/BUB3, alors que le mutant Bcl-xL(Ser62Ala) ne se lie pas à ce complexe. Ces résultats indiquent que durant le SAC, la phosphorylation de Bcl-xL(Ser62) accélère la résolution du SAC et l'entrée des cellules en anaphase. Des expériences bloquant l'expression de Bcl-xL révèlent ègalement un taux très élevé de cellules tétraploïdes et binuclées après un traitement au nocodazole, consistant avec une fonction de Bcl-xL durant la mitose et dans la stabilité génomique. Dans la troisième étude, l'analyse fonctionnelle de cette série de mutants de phosphorylation indique également que les cellules exprimant Bcl-xL(Ser49Ala) sont moins stables durant le point-contrôle G2 et entre en cytokinèse plus lentement dans des cellules exposées aux inhibiteurs de la polymérisation/dépolymérisation des tubulines, composantes des microtubules. Ces effets de Bcl-xL(Ser49Ala) sont indépendents de sa fonction anti-apoptotique. La phosphorylation de Bcl-xL(Ser49) est dynamique au cours du cycle cellulaire. Dans des cellules synchronisées, Bcl-xL(Ser49) est phosphorylé en phase S et G2, déphosphorylé à la prométaphase, la métaphase et à la frontière de l'anaphase, et re-phosphorylé durant la télophase et la cytokinèse. Au cours du point-contrôle G2 induit par les dommages à l'ADN, un pool important de phospho-Bcl-xL(Ser49) se trouve aux centrosomes, un site important pour la régulation de l'entrée en mitose. Durant la télophase et la cytokinèse, phospho-Bcl-xL(Ser49) se trouve le long des microtubules avec la protéine moteure dynéine et dans le cytosol mitotique. Finalement, nos résultats suggèrent que PLK3 est responsable de la phosphorylation de Bcl-xL(Ser49), une protéine kinase impliquée pour l'entrée des cellules en mitose et pour la progression de la mitose jusqu'à la division cellulaire.