Vulnérabilité cardiaque au stress au cours du remodelage ventriculaire pathologique induit par surcharge volumique : rôle du pore de perméabilité transitionnelle (PTP)

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Implication de la cyclophiline-D et du pore de perméabilité transitionnelle dans la vulnérabilité mitochondriale du coeur hypertrophié

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Effets du myo-inositol sur la perméabilité à l'eau d'ovocytes de Xenopus laevis exprimant les formes native et mutée D150E de l'aquaporine-2

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Le niveau réduit d’AMPc dans la surexpression des protéines G(alpha)i et la prolifération accrue des cellules du muscle lisse vasculaire des rats spontanément hypertendus

Nous avons précédemment montré que les cellules musculaires lisses vasculaires(CMLV) des rats spontanément hypertendus (SHR) présentent une expression augmentée des protéines G inhibitrices (Gi) et une prolifération cellulaire accrue par rapport aux CMLV des rats Wystar-Kyoto (WKY). Le niveau d'AMPc s’est également avéré plus faible dans les CMLV de SHR. La présente étude a donc été entreprise afin d'examiner la contribution de la diminution du niveau intracellulaire d'AMPc à l’augmentation de l'expression des protéines Gi et à la prolifération accrue des CMLV de SHR et de continuer à explorer les mécanismes moléculaires sous-jacents responsables de cette réponse. Les CMLV de SHR ont montré par rapport aux CMLV des WKY une expression accrue de Giα-2 et Giα-3 qui a été diminué d'une manière dépendante de concentration par le dbcAMP, un analogue d'AMPc perméable à la membrane cellulaire. En outre, les fonctions augmentées des protéines Gi comme démontrées par l'amplification de l’inhibition de l'adénylate cyclase par les hormones inhibitrices et l'activité forskoline (FSK)-stimulée de l’adénylate cyclase par une faible concentration de GTPγS dans les CMLV de SHR ont également été restaurées aux niveaux de WKY par le dbcAMP. La prolifération accrue des CMLV de SHR a également été atténuée par le dbcAMP et la forskoline, un activateur de l'adénylate cyclase. De plus, dbcAMP a restauré la production augmentée d'anion superoxyde (O2-), l'activité de la NAD(P)H oxydase et l’expression accrue des protéines Nox 4 et p47phox observée dans les CMLV de SHR jusqu’au niveau contrôle. Par ailleurs, la phosphorylation accrue des PDGF-R, EGF-R, c-Src et ERK1/2 énoncée par les CMLV de SHR a également été diminuée par le dbcAMP d'une manière dépendante de concentration. Ces résultats suggèrent que le niveau réduit d'AMPc intracellulaire montré par les CMLV de SHR contribue à l'expression accrue des protéines Gi et à l’hyperprolifération cellulaire à travers l’augmentation du stress oxydatif, la transactivation des EGF-R, PDGF-R et la voie de signalisation des MAP kinases.

Le fragment LG3 du perlécan : un nouveau régulateur de remodelage vasculaire en transplantation

L’apoptose endothéliale initie le processus menant au remodelage vasculaire et au développement de la néointima dans la vasculopathie du greffon. La formation de néointima résulte de l’accumulation de leucocytes, de matrice extracellulaire et de cellules positives pour l’actine musculaire lisse alpha (αSMA+) dans l’intima des artères, artérioles et capillaires du greffon. Les cellules αSMA+ dans la néointima sont des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) dérivées du donneur ainsi que des cellules souches dérivées du receveur, dont des cellules souches mésenchymateuses (CSM). L’acquisition d’un phénotype anti-apoptotique chez ces cellules est déterminante pour le développement de la néointima. Le laboratoire de Dre Hébert a démontré que les cellules endothéliales (CE) apoptotiques libèrent des médiateurs induisant une résistance à l’apoptose chez les CMLV et les fibroblastes. Notamment, les CE apoptotiques relâchent la cathepsine L qui clive le perlécan et ainsi libère un fragment C-terminal correspondant au troisième motif laminine G du domaine V du perlécan (LG3). Le LG3 est anti-apoptotique pour les fibroblastes. Nous avons donc émis l’hypothèse que le LG3 est un des médiateurs clés libéré par les CE apoptotiques favorisant le développement de la néointima via l’induction d’un phénotype anti-apoptotique chez les cellules néointimales αSMA+. Nous avons démontré que les médiateurs libérés par les CE apoptotiques induisent un phénotype anti-apoptotique chez les CSM dépendant de l’activation de la voie ERK1/2. De plus, le LG3 active la voie ERK1/2 via son interaction avec les intégrines beta 1 et induit une réponse anti-apoptotique chez ces cellules. Cependant l’activation de ERK1/2 par le LG3 est plus faible en comparaison de son activation par le milieu conditionné par des CE apoptotiques. Nos résultats suggèrent que les CE apoptotiques libèrent aussi de l’EGF qui agit de façon paracrine sur les CSM en coopération avec le LG3 pour induire un phénotype anti-apoptotique chez les CSM. Nous avons poursuivi l’étude de l’effet du LG3 in vivo sur le remodelage vasculaire en transplantation. Nous avons pour cela développé un modèle murin de rejet vasculaire qui consiste en une transplantation aortique entre des souris alloincompatibles. Nous avons ensuite injecté du LG3 chez les souris receveuses en post-transplantation. Nous avons observé dans ce modèle que des niveaux augmentés de LG3 sérique augmentent la formation de néointima, favorisent l’accumulation de cellules néointimales αSMA+ et diminuent le nombre de cellules CD31+ au niveau du greffon aortique. Parallèlement nous avons vérifié que le LG3 induit aussi un phénotype anti-apoptotique chez les CMLV et nous avons démontré un nouvel effet du LG3, soit une activité pro-migratoire, qui dépend de l’activation de la voie ERK1/2 chez les CMLV. Nous avons complété cette étude par l’analyse des niveaux de LG3 sérique dans une cohorte de patients receveurs d’allogreffe rénale. Nous avons observé chez ces patients, une association entre des niveaux élevés de LG3 sérique et un rejet vasculaire. Le LG3 contribue à la formation de néointima par son activité pro-migratoire et pro-survie chez les cellules néointimales et aussi de par son activité angiostatique. Nos résultats suggèrent que le LG3 est un nouveau médiateur important dans le remodelage vasculaire en transplantation

Valoriser l’érudition chez les professionnels de la réadaptation de l’accident vasculaire cérébral : tout un défi!

Introduction: Les professionnels de la réadaptation de l’accident vasculaire cérébral (AVC) ont la responsabilité d’offrir des services de qualité ancrés dans les données probantes. Cette responsabilité relève du rôle d’érudit selon le cadre de compétences CanMEDS. Quelle place occupe par ce rôle en clinique? Objectifs : 1) Documenter les perceptions, expériences et vécus en lien avec le rôle d’érudit chez les professionnels de la réadaptation de l’AVC. 2) Identifier les facteurs perçus comme facilitant ou entravant ce rôle clinique. Méthodologie : Étude qualitative exploratoire d’orientation phénoménologique par entrevue individuelle de professionnels travaillant en réadaptation de l’AVC depuis au moins deux ans. Codification des verbatim avec le logiciel QDA-Miner. Résultats : Les participants (âge moyen 40,7 ans ± 11,2) sont majoritairement des femmes (9/11) et leur expérience de travail en AVC varie de 3 à 23 ans. Les principaux thèmes identifiés sont: 1) Les savoirs tacites sont perçus comme synonyme du rôle d’érudit; 2) L’expérience de travail et l’intuition clinique amènent confiance et confort dans les pratiques; 3) L’insatisfaction quant au manque de partage des connaissances; 4) L’importance de la diversification dans les tâches cliniques et 5) La pratique réflexive est peu développée. Les quatre facteurs influençant le rôle d’érudit sont: la motivation; l’incident critique, les stagiaires et le manque de temps. Conclusion : Le rôle d’érudit apparaît peu valorisé par les participants. Il existe un écart entre le rôle d’érudit tel que décrit dans les cadres de compétences et la façon dont il est actualisé en pratique clinique.

Impact du stress hyperoxique en période néonatale sur la structure vasculaire : implication des phénomènes de sénescence et rôle possible dans la programmation développementale de l'hypertension artérielle

Réalisé en cotutelle avec l'Université de Lorraine (France)

Régulation moléculaire de la barrière hémo-encéphalique

La Sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune inflammatoire démyélinisante du système nerveux central (SNC), lors de laquelle des cellules inflammatoires du sang périphérique infiltrent le SNC pour y causer des dommages cellulaires. Dans ces réactions neuroinflammatoires, les cellules immunitaires traversent le système vasculaire du SNC, la barrière hémo-encéphalique (BHE), pour avoir accès au SNC et s’y accumuler. La BHE est donc la première entité que rencontrent les cellules inflammatoires du sang lors de leur migration au cerveau. Ceci lui confère un potentiel thérapeutique important pour influencer l’infiltration de cellules du sang vers le cerveau, et ainsi limiter les réactions neuroinflammatoires. En effet, les interactions entre les cellules immunitaires et les parois vasculaires sont encore mal comprises, car elles sont nombreuses et complexes. Différents mécanismes pouvant influencer la perméabilité de la BHE aux cellules immunitaires ont été décrits, et représentent aujourd’hui des cibles potentielles pour le contrôle des réactions neuro-immunes. Cette thèse a pour objectif de décrire de nouveaux mécanismes moléculaires opérant au niveau de la BHE qui interviennent dans les réactions neuroinflammatoires et qui ont un potentiel thérapeutique pour influencer les interactions neuro-immunologiques. Ce travail de doctorat est séparé en trois sections. La première section décrit la caractérisation du rôle de l’angiotensine II dans la régulation de la perméabilité de la BHE. La seconde section identifie et caractérise la fonction d’une nouvelle molécule d’adhérence de la BHE, ALCAM, dans la transmigration de cellules inflammatoires du sang vers le SNC. La troisième section traite des propriétés sécrétoires de la BHE et du rôle de la chimiokine MCP-1 dans les interactions entre la BHE et les cellules souches. Dans un premier temps, nous démontrons l’importance de l’angiotensinogène (AGT) dans la régulation de la perméabilité de la BHE. L’AGT est sécrété par les astrocytes et métabolisé en angiotensine II pour pouvoir agir au niveau des CE de la BHE à travers le récepteur à l’angiotensine II, AT1 et AT2. Au niveau de la BHE, l’angiotensine II entraîne la phosphorylation et l’enrichissement de l’occludine au sein de radeaux lipidiques, un phénomène associé à l’augmentation de l’étanchéité de la BHE. De plus, dans les lésions de SEP, on retrouve une diminution de l’expression de l’AGT et de l’occludine. Ceci est relié à nos observations in vitro, qui démontrent que des cytokines pro-inflammatoires limitent la sécrétion de l’AGT. Cette étude élucide un nouveau mécanisme par lequel les astrocytes influencent et augmentent l’étanchéité de la BHE, et implique une dysfonction de ce mécanisme dans les lésions de la SEP où s’accumulent les cellules inflammatoires. Dans un deuxième temps, les techniques établies dans la première section ont été utilisées afin d’identifier les protéines de la BHE qui s’accumulent dans les radeaux lipidiques. En utilisant une technique de protéomique nous avons identifié ALCAM (Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule) comme une protéine membranaire exprimée par les CE de la BHE. ALCAM se comporte comme une molécule d’adhérence typique. En effet, ALCAM permet la liaison entre les cellules du sang et la paroi vasculaire, via des interactions homotypiques (ALCAM-ALCAM pour les monocytes) ou hétérotypiques (ALCAM-CD6 pour les lymphocytes). Les cytokines inflammatoires augmentent le niveau d’expression d’ALCAM par la BHE, ce qui permet un recrutement local de cellules inflammatoires. Enfin, l’inhibition des interactions ALCAM-ALCAM et ALCAM-CD6 limite la transmigration des cellules inflammatoires (monocytes et cellules T CD4+) à travers la BHE in vitro et in vivo dans un modèle murin de la SEP. Cette deuxième partie identifie ALCAM comme une cible potentielle pour influencer la transmigration de cellules inflammatoires vers le cerveau. Dans un troisième temps, nous avons pu démontrer l’importance des propriétés sécrétoires spécifiques à la BHE dans les interactions avec les cellules souches neurales (CSN). Les CSN représentent un potentiel thérapeutique unique pour les maladies du SNC dans lesquelles la régénération cellulaire est limitée, comme dans la SEP. Des facteurs qui limitent l’utilisation thérapeutique des CSN sont le mode d’administration et leur maturation en cellules neurales ou gliales. Bien que la route d’administration préférée pour les CSN soit la voie intrathécale, l’injection intraveineuse représente la voie d’administration la plus facile et la moins invasive. Dans ce contexte, il est important de comprendre les interactions possibles entre les cellules souches et la paroi vasculaire du SNC qui sera responsable de leur recrutement dans le parenchyme cérébral. En collaborant avec des chercheurs de la Belgique spécialisés en CSN, nos travaux nous ont permis de confirmer, in vitro, que les cellules souches neurales humaines migrent à travers les CE humaines de la BHE avant d’entamer leur différenciation en cellules du SNC. Suite à la migration à travers les cellules de la BHE les CSN se différencient spontanément en neurones, en astrocytes et en oligodendrocytes. Ces effets sont notés préférentiellement avec les cellules de la BHE par rapport aux CE non cérébrales. Ces propriétés spécifiques aux cellules de la BHE dépendent de la chimiokine MCP-1/CCL2 sécrétée par ces dernières. Ainsi, cette dernière partie suggère que la BHE n’est pas un obstacle à la migration de CSN vers le SNC. De plus, la chimiokine MCP-1 est identifiée comme un facteur sécrété par la BHE qui permet l’accumulation et la différentiation préférentielle de cellules souches neurales dans l’espace sous-endothélial. Ces trois études démontrent l’importance de la BHE dans la migration des cellules inflammatoires et des CSN vers le SNC et indiquent que de multiples mécanismes moléculaires contribuent au dérèglement de l’homéostasie du SNC dans les réactions neuro-immunes. En utilisant des modèles in vitro, in situ et in vivo, nous avons identifié trois nouveaux mécanismes qui permettent d’influencer les interactions entre les cellules du sang et la BHE. L’identification de ces mécanismes permet non seulement une meilleure compréhension de la pathophysiologie des réactions neuroinflammatoires du SNC et des maladies qui y sont associées, mais suggère également des cibles thérapeutiques potentielles pour influencer l’infiltration des cellules du sang vers le cerveau

Exploration du rôle du fragment LG3 sur les cellules souches mésenchymateuses dans le contexte du rejet vasculaire

La vasculopathie du greffon est une pathologie caractérisée par un rétrécissement progressif et oblitérant des vaisseaux sanguins menant à une ischémie et une perte de fonction du greffon. Le rétrécissement vasculaire est dû à une accumulation de matrice extracellulaire (MEC) et de cellules mononuclées positives pour l’actine musculaire lisse alpha (alphaSMA) dont les cellules souches mésenchymateuses, le tout formant une néointima oblitérante. Cette pathologie est la cause principale de la perte des greffons rénaux et cardiaques à long terme. Le rejet vasculaire aigu est un prédicteur de la vasculopathie du greffon. L’équipe du Dr Hébert a démontré que l’apoptose endothéliale, qui joue un rôle important dans le développement du rejet vasculaire, initie la libération de LG3, un fragment du protéoglycan perlécan. Les taux sanguins et urinaires de LG3 sont augmentés chez les receveurs d’allogreffe rénale avec rejet vasculaire et vasculopathie du greffon. Les résultats obtenus en laboratoire durant ma maîtrise ont permis de mieux caractériser l’impact du LG3 sur un type cellulaire important participant à la formation de néointima : les cellules souches mésenchymateuses. Mes travaux ont démontré que le LG3 induit à la fois la migration horizontale des MSC et la transmigration des MSC. Cette migration est dépendante de la voie de signalisation d’ERK1/2, précédemment identifiée comme voie centrale dans la formation de néointima. De plus, nos résultats démontrent que la kinase Src est activée en amont de l’activation de la voie MAPK. La migration horizontale et la transmigration induites par le LG3 sont aussi dépendantes des intégrines alpha2beta1, ainsi que l’activation de la voie MAPK. Dans un modèle de transplantation murin, nous avons également démontré que l’injection sérique de LG3 recombinant favorise l’accumulation de cellules positives pour alphaSMA dans la néointima. En outre, lorsque le receveur est déficient pour l’intégrine alpha2, mais que le greffon est sauvage, la formation de néointima induite par l’injection de LG3 est diminuée dans le greffon suggérant que les cellules du receveur jouent un rôle important dans la formation de la néointima. Enfin, nous avons démontré que l’injection de LG3 augmente aussi le nombre de cellules positives pour la forme phosphorylée d’ERK1/2 (p-ERK1/2) dans la néointima du greffon et que cette accumulation est dépendante de la présence des intégrines 2 1 chez les cellules du receveur.Lorsque le receveur est sauvage, il y a une augmentation du nombre de cellules positives pour p-ERK1/2. L’investigation de ces mécanismes dans le remodelage vasculaire expose de nouvelles opportunités pour inhiber la réponse cellulaire qui mène au remodelage inadapté lors d’un dommage vasculaire chronique et ainsi prolonger la survie du greffon.

Régulation de la fonction vasculaire pendant le vieillissement : rôles de l’environnement post-natal et du gène suppresseur de tumeurs p53

La dysfonction endothéliale vasculaire constitue un marqueur précoce des maladies cardiovasculaires car l’endothélium est l’une des premières cibles des facteurs de risque cardiovasculaire. La présence d'un stress chronique engendré par les facteurs de risque cardiovasculaire sollicite les mécanismes de défense endogènes, tels que les enzymes antioxydantes, qui servent au maintien de la fonction endothéliale. L’environnement vasculaire auquel l’endothélium est exposé a un effet direct sur son fonctionnement à long terme. Certaines habitudes de vie sont ainsi associées à une bonne santé cardiovasculaire. Par exemple, la diète méditerranéenne et/ou la pratique régulière de l’exercice physique aident à maintenir une fonction endothéliale adéquate et à réduire l’incidence des maladies cardiovasculaires. D'autre part, certains gènes clés, comme le gène suppresseur de tumeurs p53, régulent plusieurs voies métaboliques importantes pour préserver l’intégrité des cellules endothéliales. Nous posons l’hypothèse que l’environnement vasculaire post-natal influence la mise en place de mécanismes de défenses endogènes tels que les enzymes antioxydantes afin de faire face à des stress plus tard dans la vie. Notre objectif global était d’évaluer les impacts d’interventions post-natales bénéfiques et d’une diminution endogène du gène suppresseur de tumeurs p53, sur la fonction endothéliale vasculaire et sur sa capacité à faire face à un stress métabolique. Dans une première étude, nous avons soumis des souris saines C57Bl/6 dès leur sevrage et jusqu’à l’âge de 9 mois, à un programme d’exercice physique volontaire (course dans une roue) ou à un antioxydant (catéchine), comparé à un groupe de souris sédentaires et sans antioxydant. Puis les interventions ont été stoppées et une diète riche en gras a été introduite, ou non, pour une période de 3 mois; les souris ont été sacrifiées à l'âge de 9 ou 12 mois. Nous avons observé que l’exercice a protégé les cellules endothéliales des effets délétères induits par la diète riche en gras en préservant la fonction endothéliale par le maintien d’un profil rédox sain et en évitant la hausse de l’inflammation. La catéchine a maintenu la fonction endothéliale aortique, mais n’a pas prévenu le profil inflammatoire en présence de la diète riche en gras. Finalement, chez les souris sédentaires, la fonction endothéliale a été détériorée en présence de la diète riche en gras, sans indice d’inflammation vasculaire. Dans une seconde étude, des souris partiellement déficientes en p53 (p53+/-) et contrôles C57Bl/6 ont été exposées à la même diète riche en gras à partir de 3 mois et ce jusqu’à l’âge de 6 mois. Notre raisonnement était basé sur la démonstration que p53 est un régulateur de l’expression des enzymes antioxydantes in vitro. Chez les souris p53+/-, les cellules endothéliales ont été protégées du stress induit par l’hypercholestérolémie engendrée par la diète riche en gras. Cependant, chez les souris p53+/- cette protection pourrait être secondaire à un métabolisme accru des acides biliaires, qui en prévenant la hausse de cholestérol, protègerait indirectement l'endothélium. Nous avons donc pu démontrer l’importance de l’environnement vasculaire sur la fonction endothéliale. La diète riche en gras a stimulé certains mécanismes de défense vasculaires tels que la voie des EDHF et la superoxyde dismutase afin de maintenir la fonction endothéliale malgré les conditions pro-athérosclérotiques. Nous avons observé que l’exercice et la catéchine influencent différemment l’endothélium malgré leurs capacités antioxydantes. Ces études soulignent la sensibilité de l’endothélium aux changements dans l’environnement vasculaire. En accord avec le vieillissement de la population et la progression des maladies cardiovasculaires, la proportion de personnes ayant une dysfonction endothéliale augmente. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes ou d’interventions qui permettent le maintien de la fonction endothéliale à long terme s’avère utile.

L'accélération de la rigidité vasculaire associée au diabète de type 1 : implication de la protéine Gla de la matrice

L'hypertension systolique isolée (HSI), amenée par une augmentation de la rigidité vasculaire, est la forme d'hypertension la plus fréquente chez les personnes âgées de plus de 60 ans. L'augmentation de la rigidité vasculaire, causée en partie par la calcification aortique médiale, est accélérée de 15 ans chez les diabétiques. Il est suggéré que la calcification aortique serait responsable de la résistance aux agents antihypertenseurs chez les patients souffrant d'HSI, d'où la nécessité de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant la calcification artérielle. La protéine Gla de la matrice (MGP) est une protéine anti-calcifiante dépendante de la vitamine K, qui doit être γ-carboxylée pour être active. Deux enzymes sont responsables de la γ-carboxylation, soit la γ-glutamyl-carboxylase et la vitamine K époxyde réductase (VKOR). Plusieurs études récentes ont indiqué que la calcification vasculaire semblait être associée à une réduction de la γ-carboxylation de la MGP, et à un déficit en vitamine K. La modulation de l'expression et/ou de l'activité de la γ-carboxylase et de la VKOR et l'impact de cette modulation sur la γ-carboxylation de la MGP en présence de diabète n'est pas connue. L'objectif principal de cette thèse était de déterminer les mécanismes impliqués dans l'accélération de la rigidité artérielle causée par la calcification des gros troncs artériels dans le diabète. Nous avons ainsi confirmé, dans un modèle animal de rigidité artérielle en présence de diabète de type 1, que la γ-carboxylation de la MGP était bel et bien altérée au niveau aortique. En fait, nous avons démontré que la quantité de MGP active (i.e. MGP γ-carboxylée, cMGP) au sein de la paroi vasculaire est diminuée significativement. Parallèlement, l'expression de la γ-carboxylase était diminuée de façon importante, alors que ni l'expression ni l'activité de la VKOR n'étaient modifiées. La diminution de l'expression de la γ-carboxylase a pu être reproduite dans un modèle ex vivo d'hyperglycémie. À l'aide de ce modèle, nous avons démontré que la supplémentation en vitamine K dans le milieu de culture prévenait la diminution de l'expression de la γ-carboxylase, alors que les animaux diabétiques de notre modèle in vivo avaient des concentrations plasmatiques de vitamine K pratiquement triplées. D'autre part, l'étude des voies de signalisation impliquées a révélé que la voie PKCβ pourrait être responsable de l'altération de la γ-carboxylase. Ces résultats génèrent de nouvelles pistes de réflexion et de nouvelles idées de recherche. Par exemple, il serait important de vérifier l'effet de la supplémentation en vitamine K dans le modèle animal de rigidité artérielle en présence de diabète pour évaluer l'effet sur la γ-carboxylation de la MGP et par le fait même, sur la calcification vasculaire. De plus, l'évaluation de l'effet de l'administration de molécules ciblant la voie PKC chez ce même modèle animal permettrait de déterminer leur impact sur le développement de la calcification vasculaire et d'évaluer leur potentiel thérapeutique. Selon les résultats de ces études, de nouvelles options pourraient alors être à notre disposition pour prévenir ou traiter la calcification artérielle médiale associée au diabète, ce qui aurait pour effet de ralentir le développement de la rigidité artérielle et d'ainsi diminuer le risque cardiovasculaire associé à l'HSI.

Validation et conditionnement d'un test PAMPA amélioré pour l'évaluation de la perméabilité membranaire de médicaments.

Les tests PAMPA et les tests Caco-2 sont des essais in vitro de l’évaluation de la perméabilité intestinale des médicaments. Ils sont réalisés lors de la phase de découverte du médicament. Les tests PAMPA ne sont pas biologiquement représentatifs de la paroi intestinale, mais ils sont rapides et peu coûteux. Les tests Caco-2 nécessitent plus de 21 jours pour la culture cellulaire et des installations spécifiques sont requises. Ils sont constitués d’une monocouche d’entérocytes à confluence et donc plus biologiquement représentatifs. Il y a un besoin pour le développement d’un essai qui est biologiquement représentatif de la membrane intestinale humaine, rapide et peu coûteux. Le premier but de ce projet était de développer une méthode analytique qui permettrait l’évaluation simultanée de huit médicaments témoins utilisés pour la validation de l’essai de perméabilité. Le deuxième but de ce projet était donc d’améliorer la membrane des tests PAMPA pour proposer un nouveau test : le néoPAMPA. Contrairement au test PAMPA traditionnel, cette membrane est constituée de trois composantes : (1) un filtre poreux qui agit à titre de support, (2) un coussin polydopamine chargé négativement qui sert d’ancrage et qui assure la fluidité de la bicouche et (3) une bicouche lipidique formée par fusion de vésicules. Une méthode analytique HPLC-MS/MS a été validée selon les spécifications de la FDA et de la EMA. Cette méthode a permis de quantifier simultanément les huit médicaments standards utilisés pour le test néoPAMPA. Le test PAMPA traditionnel a été mis en place à titre d’essai control. Les coefficients de perméabilité mesurés pour les huit médicaments au travers de la membrane PAMPA comparaient favorablement aux résultats de la littérature. Les composantes de la membrane néoPAMPA ont été optimisées. Les conditions optimales retenues étaient les filtres de polycarbonate hydrophile ayant des pores de 15 nm, les plaques Costar 12 puits comme dispositif des tests de perméabilité, une bicouche lipidique composée de 70 % DOPC et de 30 % cholestérol cationique ainsi qu’une déposition des liposomes en présence de 150 mM NaCl suivi d’un équilibre d’1 h en présence d’une solution saturée en DOPC. Les stabilités de la cassette de médicaments et des liposomes sont insuffisantes pour le conditionnement commercial des membranes néoPAMPA. Les différentes optimisations réalisées ont permis d’améliorer la membrane néoPAMPA sans toutefois la rendre fonctionnelle. La membrane néoPAMPA n’est toujours pas en mesure de discriminer des molécules en fonction de leur perméabilité attendue.

Évolution de la répartition de mise en charge au cours de la réadaptation chez les personnes présentant une hémiparésie consécutive à un accident vasculaire cérébral

Il est connu que les personnes ayant une hémiparésie à la suite d’un accident vasculaire cérébral (AVC) présentent une mise en charge (MEC) asymétrique lors de la station debout et lors du passage assis à debout (PAD). Par contre, peu d’études ont quantifié l’évolution de la MEC avec la réadaptation ou la précision avec laquelle ces personnes sont capables de la juger. L’objectif principal de ce projet était d’étudier l’évolution de la répartition et la perception de MEC en position debout et lors du PAD chez des personnes hémiparétiques en réadaptation fonctionnelle intensive (RFI). Un objectif secondaire était d’identifier les facteurs qui caractérisent les personnes hémiparétiques les plus asymétriques et les plus atteintes dans leur perception. Cette étude a été menée auprès de seize participants. Les résultats ont démontré qu’une asymétrie de répartition de l’appui en faveur du côté non parétique est présente dès les premiers mois après l’AVC et qu’elle persiste malgré la RFI. Chez les personnes avec une atteinte sévère de la fonction motrice, la MEC était plus symétrique pour le PAD que la station debout. En termes de perception, les personnes hémiparétiques étaient capables d’identifier le côté sur lequel ils mettaient plus d’appui mais ils avaient tendance à surestimer l’appui sur le côté parétique et donc à se juger moins asymétriques qu’ils ne l’étaient en réalité. Très peu de changements ont été observés lorsque les données au congé étaient comparées aux données à l’entrée dans l’étude. En réponse à l’objectif secondaire, la fonction motrice du membre inférieur parétique évaluée par le Chedoke et la différence de force des extenseurs entre les genoux étaient les facteurs les plus déterminants de l’asymétrie et de la perception de MEC. Les résultats obtenus constituent donc une étape supplémentaire vers la compréhension de la répartition asymétrique et les troubles de perception de MEC lors de la station debout et le PAD chez les personnes hémiparétiques. Il serait intéressant dans le futur d’explorer davantage les facteurs susceptibles d’influencer l’asymétrie et la perception de MEC et d’objectiver la relation de cause à effet entre ces deux variables en plus de préciser l’effet réel de l’asymétrie sur la stabilité posturale.

Étude rétrospective évaluant le VEGF comme biomarqueur d’athérosclérose mesurée par coronarographie quantitative et ultrason intra-vasculaire

Introduction : Puisque le VEGF promeut l’inflammation et la néovascularisation des plaques athérosclérotiques, il pourrait contribuer à l’athérogénèse. Cependant, les données cliniques tentant de lier le VEGF à la maladie cardiaque athérosclérotique (MCAS) sont controversées. Nous avons investigué l’association entre les niveaux de VEGF et la sévérité de la MCAS. Méthode : Nous avons effectué une étude rétrospective transversale : 56 patients présentant une MCAS stable et 112 patients avec un syndrome coronarien aigue (SCA) ont été étudiés. Nous avons investigué la relation entre la charge athérosclérotique et les niveaux sériques de VEGF en utilisant la coronarographie par analyse quantitative (QCA) et avons évalué la morphologie des plaques athérosclérotiques en utilisant l’imagerie intravasculaire ultrasonore (IVUS). Résultats : Les niveaux de VEGF étaient plus bas chez les patients avec SCA que chez ceux avec MCAS stable. On observe une corrélation positive entre les niveaux de VEGF et le fardeau de la MCAS stable mesurée par le QCA Cumulative Coronary Stenosis Score - CCSS (Pearson r= 0,423 et p = 0,001). En analyse multivariée, les niveaux sériques de VEGF demeuraient prédicteurs du CCSS (p=0,003) des patients avec une MCAS stable. Nous avons observé une corrélation positive entre les niveaux de VEGF et le volume de plaque (Spearman r = 0.381, p = 0.035) ainsi que le pourcentage de volume d’athérome (Spearman r = 0.466, p = 0.008) mesurés par IVUS. Conclusions : Notre étude suggère un usage potentiel des niveaux sérique de VEGF comme biomarqueur de MCAS.

Implication des cellules Nestin+ dans le remodelage vasculaire en conditions pathologiques

La protéine de filament intermédiaire Nestin, marqueur de cellules souches neurales, est exprimée dans les cellules vasculaires. Il a été démontré que les cellules de la crosse aortique dérivent de la crête neurale pendant le développement. Des cellules endothéliales exprimant Nestin sont retrouvées dans les capillaires durant l’embryogénèse ainsi que durant la vascularisation de tumeurs cancéreuses. Cette protéine est impliquée dans les mécanismes de prolifération cellulaire. Récemment des cellules Nestin+ ont été identifiées au niveau des cellules du muscle lisse de l’aorte. La régulation de Nestin dans ces cellules, pendant le développement et en conditions pathologiques, est inconnue. Cette thèse porte sur l’analyse de la protéine Nestin dans le remodelage vasculaire en situation diabétique et d’hypertension au niveau des artères carotide et aortique. Nos travaux examinent l’hypothèse que l’expression vasculaire de Nestine joue un rôle dans l’homéostasie durant le vieillissement physiologique et participe au remodelage suite à des stimuli pathologiques. La protéine Nestin est fortement exprimée dans les aortes de rats néonataux et cette expression diminue rapidement avec le développement. Au niveau de l’aorte l’expression de la protéine Nestin est retrouvée dans une sous-population de cellules du muscle lisse et au niveau des cellules endothéliales. L’expression de la protéine Nestin est corrélée avec sa proximité au cœur, une plus grande expression est observée dans l’arche aortique et une faible expression est détectée dans la partie thoracique. Nous avons déterminé qu’en présence de diabète de type I, il y a une perte de l’expression de la protéine Nestin dans la média de l’aorte et de la carotide. Cette perte d’expression représente un évènement précoce dans la pathologie diabétique et précède la dysfonction endothéliale. La diminution de l’expression de la protéine Nestin est également concomitante avec la perte de la capacité proliférative des cellules du muscle lisse. Dans les rats souffrant de diabète de type 1, une réduction significative de la densité des cellules du muscle lisse exprimant la protéine phosphorylée phosphohistone 3, une protéine impliquée dans un cycle cellulaire actif, est observée. De plus, cette réduction est corrélée avec la perte de l’expression de la protéine Nestin. Nous avons également démontré in vitro qu’un traitement hyperglycémique réduit l’expression de Nestin ainsi que la prolifération des cellules du muscle lisse. Enfin, l’utilisation d’un shARN dirigé contre Nestin nous a permis de déterminer l’implication de cette protéine dans la prolifération des cellules du muscle lisse en condition basale caractérisée par la diminution de l’incorporation de [3H] thymidine. Dans le modèle d’hypertension induite par une constriction aortique abdominale surrénale, l’augmentation de la pression sanguine est associée avec l’augmentation de l’expression de la protéine Nestin dans l’artère carotidienne. Une corrélation positive a été observée entre l’expression de la protéine Nestin dans la carotide et la pression artérielle moyenne à laquelle la paroi de la carotide est soumise. De plus, les facteurs de croissance impliqués dans le remodelage vasculaire secondaire à l’hypertension augmentent l’expression de Nestin dans les cellules du muscle lisse isolées des carotides. Puis, la réduction de l’expression de la protéine Nestin via un shARN atténue l’incorporation de [3H] thymidine, associée à la prolifération cellulaire, stimulée par ces facteurs de croissance alors que l’incorporation de [3H] leucine, associée à la synthèse protéique, demeure inchangée. Ces résultats suggèrent que l’augmentation de l’expression de la protéine Nestin, secondaire à l’hypertension, pourrait représenter une réponse adaptative où il y a une augmentation de la croissance des cellules du muscle lisse afin de permettre à la paroi vasculaire de s’ajuster à l’augmentation de la pression sanguine.