Integrase, the central DNA flap and human immunodeficiency virus type 1 nuclear import

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Remodelage électrique cardiaque chez les souris transgéniques surexprimant le récepteur de type 1 de l'angiotensine II

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Molecular and functional studies of human immunodeficiency virus type 1 accessory protein

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le traitement nutritionnel des épisodes d'hypoglycémie dans le diabète de type 1

Les patients atteints de diabète de type 1 (DbT1) semblent sur-traiter leurs hypoglycémies par rapport aux recommandations des Lignes directrices Canadiennes en diabète. Objectifs : 1) Décrire les habitudes des patients DbT1 pour le traitement des hypoglycémies et estimer les impacts sur le profil de risque cardio-métabolique et 2) explorer les excursions glycémiques suite à un traitement d’hypoglycémie qui respecte les recommandations. Méthodologie (analyses secondaires) : Objectif 1 : 121 patients DbT1 ont complété un journal alimentaire et de glycémies de 48 h. Des variables cardio-métaboliques ont été mesurées et un questionnaire sur la peur des hypoglycémies a été complété. Objectif 2 : 57 patients DbT1 ont complété les bras contrôles de notre programme sur le pancréas artificiel (traitement des hypoglycémies standardisé). Les valeurs de glycémie étaient disponibles aux 5 minutes. Résultats : Projet 1 : Les patients ont fait en moyenne 1,45 hypoglycémies/jour et 73% sur-traitaient avec une consommation moyenne de glucides de 32 ± 24 g. Ce sur-traitement est associé avec un plus jeune âge et une peur des hypoglycémies plus importante, mais pas avec un profil de risque cardio-métabolique plus défavorable. Projet 2 : Dans 20% des cas, traiter une hypoglycémie avec 15 g de glucides était efficace pour ramener la glycémie ≥ 4,0 mmol/L en 15 minutes, le temps moyen étant de 24 ± 12 minutes. La proportion d’insuline basale, le temps depuis le dernier repas et la pratique d’activité physique sont les éléments qui semblent avoir le plus d’impact sur l’efficacité du traitement. Conclusion : L’éducation entourant le traitement des hypoglycémies a besoin d’être renforcée et d’autres études sont nécessaires afin de valider les recommandations.

La protéine majeure de la capside de l’HSV-1 est ubiquitinée

Le virus de l’Herpès simplex de type 1 (HSV-1) est le pathogène humain responsable des lésions herpétiques labiales, plus communément appelé « feux sauvages ». Annuellement, il est responsable de plusieurs cas d’encéphalites et d’infections de l’appareil visuel qui sont la principale cause de cécité en Amérique du Nord. Bien qu’il existe quelques traitements antiviraux, aucun vaccin ou médicament ne permet de prévenir ou de guérir les infections causées par ce virus. Aujourd’hui, les infections produites par l’HSV-1 sont présentes partout sur la planète. Récemment, une étude en protéomique effectuée sur les virus matures extracellulaires a permis d’identifier la présence d’ubiquitines libres et d’enzymes reliées à la machinerie d’ubiquitination dans le virus. De plus, le virus exploite cette machinerie au cours de l’infection. Il est connu que certaines protéines virales sont ubiquitinées durant une infection et que le virus imite même certaines enzymes d’ubiquitination. Nous avons donc entrepris des recherches afin d’identifier des protéines virales ubiquitinées qui pourraient être présentes dans les virus matures ainsi que leurs rôles potentiels. La protéine majeure de la capside, VP5, un constituant très important du virus, a été identifiée. Nos recherches nous ont permis de caractériser le type d’ubiquitination, une monoubiquitination sur les lysines K810 et/ou K1275 de VP5. Le rôle que pourrait jouer l’ubiquitination de VP5 dans le cycle de réplication virale et dans les virus matures n’est toutefois pas encore connu.

Manipulation of the ubiquitin-proteasome system by HIV-1 : role of the accessory protein Vpr

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), l’agent étiologique du SIDA, est un rétrovirus complexe arborant plusieurs protéines accessoires : Nef, Vif, Vpr, et Vpu. Celles-ci sont impliquées dans la modulation de la réplication virale, dans l’évasion immunitaire et dans la progression de la pathogenèse du SIDA. Dans ce contexte, il a été démontré que la protéine virale R (Vpr) induit un arrêt de cycle cellulaire en phase G2. Le mécanisme par lequel Vpr exerce cette fonction est l’activation, ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related)-dépendante, du point de contrôle de dommage à l’ADN, mais les facteurs et mécanismes moléculaires directement impliqués dans cette activité demeurent inconnus. Afin d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires interagissant avec Vpr, nous avons utilisé une purification d’affinité en tandem (TAP) pour isoler des complexes protéiques natifs contenant Vpr. Nous avons découvert que Vpr s’associait avec CRL4A(VprBP), un complexe cellulaire d’E3 ubiquitine ligase, comprenant les protéines Cullin 4A, DDB1 (DNA damage-binding protein 1) et VprBP (Vpr-binding protein). Nos études ont mis en évidence que le recrutement de la E3 ligase par Vpr était nécessaire mais non suffisant pour l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2, suggérant ainsi que des événements additionnels seraient impliqués dans ce processus. À cet égard, nous apportons des preuves directes que Vpr détourne les fonctions de CRL4A(VprBP) pour induire la polyubiquitination de type K48 et la dégradation protéosomale de protéines cellulaires encore inconnues. Ces événements d’ubiquitination induits par Vpr ont été démontrés comme étant nécessaire à l’activation d’ATR. Finalement, nous montrons que Vpr forme des foyers ancrés à la chromatine co-localisant avec VprBP ainsi qu’avec des facteurs impliqués dans la réparation de l’ADN. La formation de ces foyers représente un événement essentiel et précoce dans l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2. Enfin, nous démontrons que Vpr est capable de recruter CRL4A(VprBP) au niveau de la chromatine et nous apportons des preuves indiquant que le substrat inconnu ciblé par Vpr est une protéine associée à la chromatine. Globalement, nos résultats révèlent certains des ménanismes par lesquels Vpr induit des perturbations du cycle cellulaire. En outre, cette étude contribue à notre compréhension de la modulation du système ubiquitine-protéasome par le VIH-1 et son implication fonctionnelle dans la manipulation de l’environnement cellulaire de l’hôte.

Contribution de la Glycoprotéine M dans la Sortie de HSV-1

Le Virus Herpès Simplex de type 1 (HSV-1) est un agent infectieux qui cause l’herpès chez une grande proportion de la population mondiale. L’herpès est généralement considéré comme une maladie bénigne dont la forme la plus commune est l'herpès labial (communément appelé « bouton de fièvre »), mais elle peut se révéler très sérieuse et causer la cécité et l’encéphalite, voir létale dans certain cas. Le virus persiste toute la vie dans le corps de son hôte. Jusqu'à présent, aucun traitement ne peut éliminer le virus et aucun vaccin n’a été prouvé efficace pour contrôler l’infection herpétique. HSV-1 est un virus avec un génome d’ADN bicaténaire contenu dans une capside icosaèdrale entourée d’une enveloppe lipidique. Treize glycoprotéines virales se trouvent dans cette enveloppe et sont connues ou supposées jouer des rôles distincts dans différentes étapes du cycle de réplication viral, incluant l'attachement, l'entrée, l’assemblage, et la propagation des virus. La glycoprotéine M (gM) qui figure parmi ces glycoprotéines d’enveloppe, est la seule glycoprotéine non essentielle mais est conservée dans toute la famille herpesviridae. Récemment, l’homologue de gM dans le Pseudorabies virus (PRV), un autre herpesvirus, a été impliqué dans la phase finale de l’assemblage (i.e. l’enveloppement cytoplasmique) au niveau du réseau trans-Golgi (TGN) en reconnaissant spécifiquement des protéines tégumentaires et d’autres glycoprotéines d’enveloppe ([1]). Toutefois, il a été proposé que cette hypothèse ne s’applique pas pour le HSV-1 ([2]). De plus, contrairement à la localisation au TGN dans les cellules transfectées, HSV-1 gM se localise dans la membrane nucléaire et sur les virions périnucléaires durant une infection. L’objectif du projet présenté ici était d’éclaircir la relation de la localisation et la fonction de HSV-1 gM dans le contexte d’une infection. Dans les résultats rapportés ici, nous décrivons tout abord un mécanisme spécifique de ciblage nucléaire de HSV-1 gM. En phase précoce d’une infection, gM est ciblée à la membrane nucléaire d'une manière virus ii dépendante. Cela se produit avant la réorganisation du TGN normalement induite par l’infection et avant que gM n’entre dans la voie de sécrétion. Ce ciblage nucléaire actif et spécifique de gM ne semble pas dépendre des plusieurs des partenaires d’interaction proposés dans la littérature. Ces données suggèrent que la forme nucléaire de gM pourrait avoir un nouveau rôle indépendant de l’enveloppement final dans le cytoplasme. Dans la deuxième partie du travail présenté ici, nous avons concentré nos efforts sur le rôle de gM dans l’assemblage du virus en phase tardive de l’infection et en identifiant un domaine critique de gM. Nos résultats mettent en valeur l’importance du domaine carboxyl-terminal cytoplasmique de gM dans le transport de gM du réticulum endoplasmique (RE) à l’appareil de Golgi, dans l’enveloppement cytoplasmique et la propagation intercellulaire du virus. Ainsi, l’export du RE de gM a été complètement compromis dans les cellules transfectées exprimant un mutant de gM dépourvu de sa région C-terminale. La délétion la queue cytoplasmique de gM cause une réduction légère du titre viral et de la taille des plaques. L'analyse de ces mutants par microscopie électronique a démontré une accumulation des nucléocapsides sans enveloppe dans le cytoplasme par rapport aux virus de type sauvage. Étrangement, ce phénotype était apparent dans les cellules BHK mais absent dans les cellules 143B, suggérant que la fonction de gM dépende du type cellulaire. Finalement, le criblage de partenaires d’interaction du domaine C-terminal de gM identifiés par le système de double-hybride nous a permis de proposer plusieurs candidats susceptibles de réguler la fonction de gM dans la morphogénèse et la propagation de virus.

Caractérisation de l’ubiquitin-fold modifier (UFM1) dans un modèle C. elegans

L’ubiquitin-fold modifier (UFM1) fait partie de la classe 1 de la famille de protéine ubiquitin-like (Ubl). UFM1 et Ub ont très peu d’homologie de séquence, mais partagent des similarités remarquables au niveau de leur structure tertiaire. Tout comme l’Ub et la majorité des autres Ubls, UFM1 se lie de façon covalente à ses substrats par l’intermédiaire d’une cascade enzymatique. Il est de plus en plus fréquemment rapporté que les protéines Ubls sont impliquées dans des maladies humaines. Le gène Ufm1 est surexprimé chez des souris de type MCP développant une ischémie myocardique et dans les îlots de Langerhans de patients atteints du diabète de type 2. UFM1 et ses enzymes spécifiques, UBA5, UFL1 et UFC1, sont conservés chez les métazoaires et les plantes suggérant un rôle important pour les organismes multicellulaires. Le Caenorhabditis elegans est le modèle animal le plus simple utilisé en biologie. Sa morphologie, ses phénotypes visibles et ses lignées cellulaires ont été décrits de façon détaillée. De plus, son cycle de vie court permet de rapidement observer les effets de certains gènes sur la longévité. Ce modèle nous permet de facilement manipuler l’expression du gène Ufm1 et de mieux connaître ses fonctions. En diminuant l’expression du gène ufm-1 chez le C.elegans, par la technique de l’ARN interférence par alimentation, nous n’avons observé aucun problème morphologique grave. Les vers ressemblaient aux vers sauvages et possédaient un nombre de progéniture normal. Cependant, les vers sauvage exposés à l’ARNi d’ufm-1 vivent significativement moins longtemps que les contrôles et ce, de façon indépendante de la voie de signalisation de l’insuline/IGF. Chez le C. elegans la longévité et la résistance au stress cellulaire sont intimement liées. Nous n’avons remarqué aucun effet d’ufm-1 sur le stress thermal, osmotique ou oxydatif, mais il est requis pour la protection contre le stress protéotoxique. Il est également nécessaire au maintien de l’intégrité neuronale au cours du vieillissement des animaux. L’ensemble de nos données nous renseigne sur les fonctions putatives du gène Ufm1.

Développement d'une méthode d'isolation des noyaux adaptée aux macrophages pour une caractérisation protéomique d'une nouvelle structure autophagique induite par le virus HSV-1

L’autophagie est un processus cellulaire catabolique qui a été conservé durant l’évolution de la levure à l’homme. Cet important mécanisme consiste en une dégradation des composants cytoplasmiques dans une structure lytique, le lysosome. Il existe trois types de l’autophagie : la microautophagie, l’autophagie médiée par les chaperones et la macroautophagie nommée « autophagie ». Il a été démontré que lors de l’autophagie, le matériel cytoplasmique (protéines cytosoliques et organites) est séquestré dans l’autophagosome qui finit par fusionner avec le lysosome, formant ainsi l’autophagolysosome. Le matériel séquestré et la membrane interne de l’autophagosome seront dégradés par les hydrolases lysosomales. Plusieurs études se sont focalisées sur la détermination de la machinerie moléculaire et les mécanismes de l’autophagie. Il a été démontré l’implication de 31 molécules Atg essentielles dans le processus de l’autophagie. L’identification de ces protéines a permis de déceler le rôle de l’autophagie non seulement dans le maintien de l’homéostasie cellulaire mais aussi dans la défense contre les agents pathogènes. En effet, l’autophagie joue un rôle important dans l’immunité innée conduisant à contrôler l’évasion des pathogènes dont les bactéries et les virus. Également, l’autophagie est impliquée dans l’immunité adaptative en favorisant la présentation des antigènes viraux par le CMH de classe II aux cellules T CD4+. De plus, une étude récente suggère que l’autophagie contribue à la présentation antigénique par le CMH de classe I aux cellules T CD8+ durant une infection virale par le virus HSV-1 (Herpes simplex type 1). Toutefois, certains virus y compris HSV-1 ont pu développer des mécanismes pour contourner et inhiber en partie le rôle protecteur de l’autophagie. Récemment, une étude dans notre laboratoire a mis en évidence, lors d’une infection virale par HSV-1 des cellules macrophages BMA, la présence d’une nouvelle structure autophagique dans une phase tardive de l’infection. Cette nouvelle structure est différente des autophagosomes classiques à double membrane et est caractérisée morphologiquement par quatre membranes dérivées de l’enveloppe nucléaire interne et externe. Peu de choses ont été rapportées sur cette nouvelle voie autophagique qui peut être un mécanisme de défense cellulaire quand l’autophagie classique dans le cytosol est inhibée par HSV-1. Il devient donc intéressant de caractériser les molécules impliquées dans la formation de ces autophagosomes issus du noyau par spectrométrie de masse. Pour ce faire, il était impératif d’établir un outil d’isolation des noyaux à partir de macrophages infectés par HSV-1 dans lesquels les autophagosomes issus des noyaux seront formés. La validation de cette méthode d’isolation a été effectuée en déterminant la pureté et l’intégrité des noyaux isolés à partir des cellules non infectées (contrôle) et infectées par HSV-1. La pureté des préparations de noyaux isolés a été caractérisée par l’absence de contaminants cellulaires et un enrichissement en noyaux. Également, il a fallu déterminer la cinétique de formation des autophagosomes issus des noyaux pour les deux lignées cellulaires de macrophages utilisées dans ce projet. Dans une perspective future, l’analyse protéomique à partir des échantillons purs des noyaux isolés (non infectés et infectés) mènera à identifier les protéines impliquées dans la formation des autophagosomes dérivés des noyaux, ce qui permettra ultérieurement d’effectuer des études sur les mécanismes moléculaires et les fonctions de cette nouvelle voie autophagique.

Étude du mécanisme du changement programmé -1 du cadre de lecture par le ribosome

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Role of receptor and non-receptor protein tyrosine kinases in vasoactive peptide-induced signaling

L'endothéline-1 (ET-1) et l'angiotensine II (Ang II) jouent un rôle important dans le maintien de la pression artérielle et l'homéostasie vasculaire. Une activité accrue de ces peptides vasoactifs est présumée contribuer au développement de pathologies vasculaires, telles que l'hypertension, l'athérosclérose, l'hypertrophie et la resténose. Ceci est causé par une activation excessive de plusieurs voies de signalisation hypertrophiques et prolifératives, qui incluent des membres de la famille des Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK), ainsi que la famille phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) / protéine kinase B (PKB). Bien que l'activation de ces voies de signalisation soit bien élucidée, les éléments en amont responsables de l'activation des MAPK et de la PKB, induite par l'ET-1 et Ang II, demeurent mal compris. Durant les dernières années, le concept de la transactivation de récepteurs et/ou non-récepteurs protéines tyrosine kinases (PTK) dans le déclenchement des événements de signalisation induits par les peptides vasoactifs a gagné beaucoup de reconnaissance. Nous avons récemment démontré que la PTK Insulin-like Growth Factor type-1 Receptor (IGF-1R) joue un rôle dans la transduction des signaux induits par l‟H2O2, menant à la phosphorylation de la PKB. Étant donné que les peptides vasoactifs génèrent des espèces réactives d'oxygène, telles que l‟H2O2 lors de leur signalisation, nous avons examiné le rôle de d‟IGF-1R dans la phosphorylation de la PKB et les réponses hypertrophiques dans les cellules muscle lisse vasculaires (CMLV) induites par l'ET-1 et Ang II. AG-1024, un inhibiteur spécifique de l'IGF-1R, a atténué la phosphorylation de la PKB induite à la fois par l'ET-1 et Ang II. Le traitement des CMLVs avec l‟ET-1 et Ang II a également induit une phosphorylation des résidus tyrosine dans les sites d'autophosphorylation d'IGF-1R, celle-ci a été bloquée par l‟AG-1024. En outre, l‟ET-1 et l‟Ang II on tous les deux provoqué la phosphorylation de c-Src, une PTK non-récepteur, bloqué par PP-2, inhibiteur spécifique de la famille Src. La PP-2 a également inhibé la phosphorylation de PKB et d‟IGF-1R induite par l‟ET-1 et l‟Ang II. De plus, la synthèse de protéines ainsi que d‟ADN, marqueurs de la prolifération cellulaire et de l'hypertrophie, ont également été atténuée par l‟AG-1024 et le PP-2. Bien que ce travail démontre le rôle de c-Src dans la phosphorylation PKB induite par l'ET-1 et Ang II, son rôle dans l'activation des MAPK induit par l'ET-1 dans les CMLVs reste controversé. Par conséquent, nous avons examiné l'implication de c-Src dans l'activation de ERK 1/2, JNK et p38MAPK, par l'ET-1 et Ang II, ainsi que leur capacité à régulariser l'expression du facteur de transcription Early growth transcription factor-1 « Egr-1 ». ET-1 et Ang II ont induit la phosphorylation de ERK 1/2, JNK et p38 MAPK, et ont amplifié l'expression d'Egr-1 dans les CMLVs. Cette augmentation de la phosphorylation des MAPK a été diminuée par la PP-2, qui a aussi atténué l'expression d'Egr-1 induite par l'ET-1 et l'Ang II. Une preuve supplémentaire du rôle de c-Src dans ce processus a été obtenue en utilisant des fibroblastes embryonnaires de souris déficientes en c-Src (Src -/- MEF). L'expression d'Egr-1, ainsi que l'activation des trois MAPKs par l'ET-1 ont été atténuées dans les cellules Src -/- par rapport au MEF exprimant des taux normaux Src. En résumé, ces données suggèrent que l'IGF-1R et c-Src PTK jouent un rôle essentiel dans la régulation de la phosphorylation de PKB et des MAPK dans l‟expression d'Egr-1, ainsi que dans les réponses hypertrophiques et prolifératives induites par l'ET-1 et Ang II dans les CMLVs.

Importance des protéines cellulaires incorporées dans les virions matures d’HSV-1

Pour compléter leur cycle de vie, les virus interagissent avec de nombreux facteurs de la cellule-hôte. Le virus Herpès simplex de type 1 (HSV-1) ne fait pas exception. Une récente étude protéomique du virus effectuée par notre laboratoire a permis d’identifier 49protéines cellulaires potentiellement incorporées dans les virions matures d’HSV-1 [1]. Étant donné que certaines de ces protéines peuvent jouer des rôles importants au cours du cycle de vie du virus, elles constituent des cibles de choix pour identifier et caractériser de nouvelles interactions hôte-pathogène dans le contexte d’HSV-1. D’ailleurs le laboratoire a été effectué un criblage aux petits ARN d’interférence qui a démontré qu'au moins 15 des protéines incorporées sont impliqués dans le cycle de réplication de HSV-1 en culture cellulaire (Annexe 1). Des nombreuses études rapportent l'incorporation des protéines de l'hôte dans les virions matures mais très peu abordent l'importance de la fraction des protéines cellulaires incorporée dans les virions pour le cycle virale. Pour vérifier ça, nous avons déplété ces protéines des virions matures extracellulaires en utilisant des petits ARN d’interférence. Par la suite, nous avons utilisé ces virus déplétés pour réinfecter des cellules déplétées ou normales. Cette méthode nous a permis d'identifier pour la première fois 8 protéines (DDX3X, HSPA8, KRT10, MIF, Rab5A, Rab6A, Rab10 et 14-3-3ζ) dont l'absence dans les virions réduit la production virale d'au moins 50%. Pour mieux comprendre à quelle étape du cycle viral ces protéines sont nécessaires, nous avons aussi quantifié les virus intracellulaires, produits des cellules déplétées individuellement des quinze protéines cellulaires. Ainsi, nous avons trouvé que dans nos conditions 7 de ces 8 protéines cellulaires (DDX3X, HSPA8, KRT10, MIF, Rab5A, Rab6A et Rab10) semblent impliquées dans la production des virus intracellulaires, ce qui nous a stimulés à débuter une série de tests plus approfondis de l’entrée d’HSV-1. Les résultats préliminaires, démontrent l’implication dans l’entrée d’HSV-1 d’au moins 3 à 4 de ces protéines (HSPA8, KRT10, Rab5A et Rab10).

Étude de la traduction IRES-dépendante du VIH-1

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est responsable de la pandémie du SIDA (syndrome de l’immunodéficience acquise). Des souches virales résistantes aux antirétroviraux actuellement utilisés apparaissent rapidement. Il est donc important d’identifier de nouvelles cibles dans le cycle de réplication du VIH-1 pour développer de nouveaux agents contre ce virus. La traduction des protéines de structure et des enzymes du VIH-1 est une étape essentielle du cycle de réplication virale. Ces protéines sont exprimées à partir de l’ARN messager (ARNm) pleine-longueur (ARNmPL) à la fin du cycle de réplication. L’ARNmPL du VIH-1 peut utiliser un mode d’initiation de la traduction coiffe-dépendant, comme la majorité des ARNm cellulaires, mais peut aussi utiliser un mode d’initiation alternatif, car sa région 5’ non-traduite (5’UTR) contient un site interne d’entrée du ribosome (IRES), ce qui lui permet d’initier la traduction suivant un mode IRES-dépendant. L’initiation IRES-dépendante permet à l’ARNmPL d’être traduit quand l’initiation coiffe-dépendante est inhibée. L’activité de l’IRES de la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1 (IRES5’UTR) est faible dans des conditions physiologiques, mais est stimulée lorsque la cellule est arrêtée à la transition G2/M du cycle cellulaire, un arrêt qu’induit l’infection par le VIH-1. Une grande portion de l’IRES5’UTR, que nous nommons IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux et a une activité semblable à celle de l’ IRES5’UTR, ce qui indique que le mode IRES-dépendant peut être utilisé par tous les messagers du VIH-1. Lors de mes études doctorales, j’ai caractérisé le fonctionnement de l’IRES5’UTR du VIH-1. J’ai transfecté des cellules lymphocytaires Jurkat T, dérivées des cibles naturelles du VIH-1, avec un vecteur dual-luciférase contenant les séquences codantes des luciférases de la Renilla (Rluc) et de la luciole (Fluc) séparées par la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1. La traduction de la Rluc est coiffe-dépendante alors que celle de la Fluc dépend de l’IRES5’UTR. J’ai d’abord effectué une analyse mutationnelle et j’ai identifié trois régions qui stimulent l’activité de l’IRES5’UTR et une tige-boucle qui réprime l’activité de cet IRES, que j’ai nommée IRENE (IRES negative element). J’ai montré que l’effet répresseur d’IRENE est aboli lorsque les cellules sont soumises à un stress oxydatif, un type de stress induit lors d’une infection par le VIH-1. Nous proposons que IRENE maintiendrait l’IRES5’UTR dans une conformation peu active dans des conditions physiologiques. On sait que les IRES sont activés par divers facteurs cellulaires, appelés ITAF (IRES trans-acting factors). Nous proposons que l’IRES5’UTR adopterait une conformation active suite à la liaison d’un ITAF exprimé ou relocalisé lors d’un stress oxydatif. Ces travaux ont fait l’objet d’une publication (Gendron et al., 2011, Nucleic Acids Research, 39, 902-912). J’ai ensuite étudié l’effet de la protéine virale Tat sur l’activité de l’IRES5’UTR. En plus de son rôle essentiel dans la transactivation de la transcription des ARNm viraux, Tat stimule leur traduction coiffe-dépendante, en empêchant l’inhibition d’un facteur d’initiation canonique, eIF2, induite par la protéine kinase modulée par l’ARN double-brin (PKR) et en déroulant la structure TAR présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm du VIH-1. Elle affecte aussi l’expression de plusieurs gènes cellulaires. J’ai montré que les isoformes Tat86 et Tat72, mais non Tat101, stimulent l’activité de l’IRES5’UTR. Cet effet est indépendant de PKR et de TAR, mais dépendrait de la conformation de Tat. Nous proposons que Tat activerait un facteur de transcription cellulaire qui déclenche l’expression d’un ITAF de l’IRES5’UTR ou encore qu’elle activerait directement un tel ITAF. J’ai de plus montré que PKR stimule l’activité de l’IRES5’UTR, ce qui est surprenant puisque PKR est une protéine antivirale. Cet effet est indépendant de l’inhibition d’eIF2 par PKR et pourrait résulter de l’activation d’un ITAF. Sachant qu’une portion active de l’IRES5’UTR, IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux, notre hypothèse est que la stimulation de cet IRES par PKR permettait de traduire l’ARNm de Tat au début du cycle de réplication, ce qui permettrait ensuite la traduction coiffe-dépendante des ARNm du VIH-1, qui est stimulée par Tat. Ces travaux font l’objet d’un manuscrit (Gendron et al., soumis à RNA). Mes résultats, couplés aux données de la littérature, me conduisent à la conclusion que, à la fin du cycle de réplication du VIH-1, l’activité de l’IRES5’UTR est stimulée par le stress oxydatif, l’arrêt en G2/M et la présence de quantités élevées de Tat, alors que la traduction coiffe-dépendante est compromise. L’initiation IRES-dépendante serait alors indispensable pour que le VIH-1 traduise l’ARNmPL. L’IRES5’UTR constituerait donc une cible très intéressante pour développer des agents anti-VIH.

Mécanismes moléculaires de la réplication préférentielle du VIH-1 dans les cellules à polarisation Th1Th17 versus Th1 : rôle de PPARG dans la régulation négative de la réplication virale

Les cellules T CD4+ humaines sont hétérogènes du point de vue de la permissivité à l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Notre laboratoire a préalablement démontré que les cellules Th1 à phénotype CXCR3+CCR6- sont relativement résistantes à l’infection par le VIH-1 alors que les cellules Th1Th17 à phénotype CXCR3+CCR6+ y sont hautement permissives. La réplication du VIH dépend de plusieurs facteurs cellulaires de restriction ou de permissivité agissant à différentes étapes du cycle viral. Toutefois, malgré plusieurs avancées, la compréhension des voies de signalisation cellulaire impliquées dans la régulation de la réplication du VIH est encore limitée. L’objectif majeur de ce projet de maîtrise est de caractériser les mécanismes moléculaires de la permissivité et de la résistance au VIH respectivement dans les cellules Th1Th17 et Th1. Ce mémoire est divisé en quatre parties qui visent: (i) l’identification des voies canoniques et des fonctions biologiques différemment régulées dans les cellules Th1Th17 versus Th1 par l’analyse de leur transcriptome au niveau du génome entier; (ii) la validation de l’expression différentielle des gènes d’intérêt identifiés par biopuces au niveau des transcrits et des protéines; (iii) la caractérisation du rôle fonctionnel de certains de ces facteurs (i.e., PPARG, AhR) sur la réplication du VIH dans les cellules Th1Th17 versus Th1; et (iv) l’identification du niveau auquel ces facteurs interfèrent avec le cycle de réplication du VIH. Nos résultats d’analyse du transcriptome du génome entier par Gene Set Enrichment Analysis et Ingenuity Pathway Analysis indiquent que les cellules à profil Th1Th17 sont plus susceptibles à l’activation cellulaire et à l’apoptose, favorisent plus l’inflammation et expriment moins fortement les gènes liés à la dégradation protéosomale comparé aux cellules à profil Th1. Ces différences dans la régulation de diverses voies et fonctions biologiques permettent en partie d’expliquer la susceptibilité à l’infection par le VIH dans ces cellules. Nous avons ensuite confirmé l’expression différentielle de certains gènes d’intérêt dans les cellules Th1Th17 (CXCR6, PPARG, ARNTL, CTSH, PTPN13, MAP3K4) versus Th1 (SERPINB6, PTK2) au niveau de l’ARNm et des protéines. Finalement, nous avons démontré le rôle des facteurs de transcription PPARG et AhR dans la régulation de la réplication du VIH. L’activation de la voie PPARG par la rosiglitazone induit la diminution importante de la réplication du VIH dans les cellules T CD4+, alors que l’activation de la voie AhR par les ligands exogènes TCDD et FICZ augmente de façon significative la réplication virale. Nous proposons que la voie PPARG agit comme un régulateur négatif de la réplication du VIH dans ces cellules, en interférant avec la polarisation Th17 et probablement en inhibant l’activité transcriptionnelle du facteur NF-kB. Les rôles des formes nucléaires versus cytoplasmiques du récepteur Ahr semblent être diamétralement opposés, dans la mesure où l’interférence ARN contre AhR s’associe également à l’augmentation de la réplication virale. Il est ainsi possible que la forme cytoplasmique d’AhR, connue par son activité E3 ligase, participe à la dégradation protéosomale des particules virales. Le mécanisme par lequel le AhR nucléaire versus cytoplasmique interfère avec la réplication virale est en cours d’étude au laboratoire. Cette étude représente la première caractérisation de l’expression différentielle de gènes au niveau du génome entier de sous-populations T CD4+ permissives versus résistantes à l’infection par le VIH. Nos résultats identifient de nouvelles cibles moléculaires pour de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à limiter la réplication du VIH dans les lymphocytes T CD4+ primaires.

The role of Microsomal prostaglandin synthase-1 (mPGES-1) and Ephrin B2 in Scleroderma

La sclérodermie (sclérose systémique, ScS) est une maladie auto-immune du tissu conjonctif caractérisée  par  l’épaississement  de  la  peau,  l’apparition  spontanée de lésions cicatricielles, des maladies   des   vaisseaux   sanguins,   divers   degrés   d’inflammation,   en   association   avec   un   système   immunitaire hyperactif. La pathogénèse exacte de cette maladie est inconnue et aucun traitement approprié   n’est   disponible.   La fibrose est un élément distinctif de la maladie de ScS et est considérée   résulter   d’une   incapacité   à   mettre   fin   de   façon   appropriée   à   la   réponse   normale   de   réparation   des   plaies.   L’analyse   histologique   du   stade   initial   de   la   ScS   révèle   une   infiltration   périvasculaire de cellules mononucléaires dans le derme, associée à une synthèse accrue de collagène dans les fibroblastes environnants. Ainsi, la compréhension des moyens de contrôler le stade inflammatoire de la ScS pourrait être bénéfique pour contrôler la progression de la maladie peu après son apparition. La mPGES-1 est une enzyme inductible qui agit en aval de la cyclo- oxygénase (COX) pour catalyser spécifiquement la conversion de la prostaglandine (PG) H2 en PGE2. La mPGES-1  joue  un  rôle  clé  dans  l’inflammation,  la  douleur  et  l’arthrite;;  toutefois,  le   rôle de la mPGES-1 dans les mécanismes de fibrose, spécifiquement en rapport avec la ScS humaine, est inconnu. Mon laboratoire a précédemment montré que les souris à mPGES-1 nulle sont résistantes à la fibrose   cutanée   induite   par   la   bléomycine,   à   l’inflammation,   à   l’épaississement  cutané,  à  la  production  de  collagène  et  à  la  formation  de  myofibroblastes.  Sur  la   base  de  ces  résultats,  j’ai  formulé  l’hypothèse  que  l’inhibition pharmacologique de la mPGES-1 régulera à la baisse la production de médiateurs pro-inflammatoires et pro-fibreux au cours de la maladie   de   ScS.   Afin   d’explorer   le   rôle   de   la   mPGES-1   dans   l’inflammation   et   la   fibrose   associées  à  la  maladie  de  ScS,  j’ai  d’abord  examiné  l’expression  de  la  mPGES-1 dans la peau normale comparativement à des biopsies de peau extraites de patients atteints de ScS. Mes résultats ont montré que la mPGES-1 est nettement élevée dans la peau de patients atteints de ScS en comparaison avec la peau humaine normale. De plus, les niveaux de PGE2 dérivés de la mPGES-1 étaient également significativement plus élevés dans les fibroblastes cutanés isolés de patients  atteints  de  ScS  comparativement  aux  fibroblastes  isolés  de  témoins  sains.  J’ai  également   étudié  l’effet  de  l’inhibition pharmacologique de la mPGES-1  sur  l’expression  de  marqueurs  pro- fibreux.   Mes   études   ont   montré   que   l’expression   de   médiateurs   pro-fibreux clés (α-SMA, endothéline-1, collagène de type 1 et facteur de croissance du tissu conjonctif (FCTC)) est élevée dans les fibroblastes cutanés ScS en comparaison avec les fibroblastes cutanés normaux. Un traitement avec un inhibiteur de la mPGES-1 a eu pour effet de réduire significativement l’expression  de  l’α-SMA,  de  l’endothéline-1, du collagène de type 1 mais pas du FCTC dans les fibroblastes  ScS,  sans  effet  significatif  sur  les  fibroblastes  normaux.  J’ai  en  outre  examiné  l’effet   de  l’inhibition  de  la  mPGES-1 sur des cytokines pro-inflammatoires clés impliquées dans la pathologie de la ScS, incluant IL-6, IL-8 et MCP-1.  L’inhibition  pharmacologique  de  la  mPGES- 1 a eu pour effet de réduire significativement les niveaux de production de cytokines pro- inflammatoires IL6, IL8 et MCP-1 dans les fibroblastes avec lésion ScS comparativement à des fibroblastes non traités. De plus, les patients atteints de ScS ont présenté des niveaux plus élevés de p-AKT, de p-FAK et de p-SMAD3 en comparaison avec les fibroblastes cutanés normaux. L’inhibiteur  de  la  mPGES-1 a pu réguler à la baisse cette expression accrue de p-AKT et de p- FAK, mais pas de p-SMAD3,  dans  les  fibroblastes  ScS.  Ces  résultats  ont  suggéré  que  l’inhibition   de la mPGES-1 pourrait être une méthode viable pour réduire le développement de sclérose cutanée et constituent une cible thérapeutique potentielle pour contrôler les mécanismes fibreux et inflammatoires associés à la pathophysiologie de la maladie de ScS. L’un   des   autres   processus   critiques   reliés   à   l’évolution de la réponse fibreuse associée à la maladie de ScS est la différenciation des fibroblastes en des cellules activées spécialisées iii iv appelées myofibroblastes, responsables de déclencher une signalisation adhésive excessive et le dépôt excessif de matrice extracellulaire,   conduisant   à   la   destruction   de   l’architecture   de   l’organe.   Ainsi,   l’identification   des   facteurs   endogènes   qui   initient/   favorisent   la   différenciation   fibroblaste-myofibroblaste peut mener à des stratégies thérapeutiques prometteuses pour contrôler  l’excès  de  signalisation  adhésive  et  de  fibrose  associé  à  la  maladie  de  ScS.  Des  études   antérieures  dans  le  domaine  de  la  biologie  du  cancer  ont  suggéré  que  l’éphrine  B2,  une  protéine   transmembranaire appartenant à la famille des éphrines, est impliquée dans la signalisation adhésive   et   le   remodelage   extracellulaire.   Cependant,   son   rôle   dans   la   fibrose   n’a   jamais   été   exploré.   Dans   la   deuxième   partie   de   mon   étude,   j’ai   donc   étudié   le   rôle   de   l’éphrine   B2   dans   la   fibrose.   Mes   études   montrent   que   l’expression   de   l’éphrine   B2   est   significativement   augmentée   dans la peau humaine ScS comparativement à la peau normale. Plus important encore, le traitement in vitro de   fibroblastes   de   la   peau   humaine   normale   avec   de   l’éphrine   B2   recombinante est capable de transformer des fibroblastes en cellules myofibroblastiques manifestant toutes les caractéristiques myofibroblastiques typiques, incluant la formation accrue de  fibres  de  tension,  des  adhérences  focales,  l’activation  accrue  de  la  FAK,  un  accroissement  de   l’expression  et  de  la  migration  de  fibroblastes  et  de  leur  adhérence  à  la  fibronectine  à  la  fois  chez   les   fibroblastes   cutanés   normaux   et   ScS.   En   outre,   j’ai   traité   des   souris   avec   de   l’éphrine   B2   recombinante et montré que ces souris ont développé une fibrose cutanée significative associée à une épaisseur dermique et à une synthèse de collagène augmentées, une teneur en hydroxyproline (teneur en collagène) accrue et un nombre accru de myofibroblastes exprimant de   l’α-SMA, une activation augmentée de la FAK et de marqueurs pro-fibreux incluant le collagène de type 1 et le FCTC. Dans  l’ensemble,  mes  études  ont  identifié  deux  médiateurs  endogènes  cruciaux  impliqués  dans  la   propagation  de  l’inflammation  et  de  la  fibrose  associées  à  la  maladie  de  ScS.  L’inhibition  de  la   mPGES-1   pourrait   représenter   une   bonne   stratégie   alternative   pour   contrer   l’inflammation   et   la   fibrose au moins durant les stades précoces de la maladie de ScS. De plus, une signalisation excessive   de   l’éphrine B2 favorise la signalisation adhésive et fibreuse en déclenchant la différenciation   de   fibroblastes   en   myofibroblastes   par   l’activation   de   la   voie   de   signalisation   de   la  FAK.  Ainsi,  l’inhibition  d’éphrine  B2  bloquera  la  formation  de  fibroblastes-myofibroblastes et régulera à la baisse la fibrose associée à la maladie de ScS. En somme, la mPGES-1  et  l’éphrine   B2 semblent toutes deux des cibles attrayantes pour le traitement de la ScS et des troubles fibreux qui y sont reliés.