Rôle et expression de l'interleukine-27 dans le contexte de la sclérose en plaques

Des études antérieures ont indiqué que l’IL-27 supprime le développement de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), un modèle murin de la sclérose en plaques (SEP). L’expression en ARNm d’IL-27 est maximale au pic du développement de l’EAE. Cependant, sa contribution dans la pathogenèse de la SEP demeure irrésolue. Nous avons investigué si l’IL-27 contribue à moduler les réponses immunes dans le système nerveux central (SNC) de patients SEP. Nos résultats d’immunohistochimie sur échantillons post-mortem de cerveaux humains ont révélé que la production des deux sous-unités d’IL-27 (EBI-3 et p28) est plus élevée chez des patients comparés à des contrôles. De plus, les astrocytes (GFAP) et les microglies/macrophages (Iba1) représentent des sources biologiques importantes de l’IL-27 dans les lésions. Les lymphocytes T CD4 et CD8 qui infiltrent le SNC des patients expriment d’ailleurs le récepteur de l’IL-27 composé des chaînes gp130 et TCCR, supportant le concept que ces cellules pourraient répondre aux sources locales d’IL-27. Nous avons également démontré que des combinaisons de cytokines pro-inflammatoires (IFNγ, IL-1β et TNF) augmentent l’expression in vitro d’IL-27 par les astrocytes et macrophages humains, et que les microglies/macrophages de phénotype M1 produisent l’IL-27. Enfin, nous avons démontré que les astrocytes humains expriment aussi le récepteur à l’IL-27 et répondent à l’IL-27 par la phosphorylation de STAT1, mais pas de STAT3. Une telle signalisation dans ces cellules mène à l’augmentation d’expression de la molécule de co-inhibition PD-L1 et de la sécrétion de la chimiokine CXCL10.

Conception et évaluation d’un nouveau système de transfection ciblée, basé sur l’utilisation du système E/Kcoil

Actuellement le polyéthylènimine (PEI) est l’agent de transfection transitoire le plus utilisé par l’industrie pharmaceutique pour la production de protéines recombinantes à grande échelle par les cellules de mammifères. Il permet la condensation de l’ADN plasmidique (ADNp) en formant spontanément des nanoparticules positives appelées polyplexes, lui procurant la possibilité de s’attacher sur la membrane cellulaire afin d’être internalisé, ainsi qu’une protection face aux nucléases intracellulaires. Cependant, alors que les polyplexes s’attachent sur la quasi-totalité des cellules seulement 5 à 10 % de l’ADNp internalisé atteint leur noyau, ce qui indique que la majorité des polyplexes ne participent pas à l’expression du transgène. Ceci contraste avec l’efficacité des vecteurs viraux où une seule particule virale par cellule peut être suffisante. Les virus ont évolués afin d’exploiter les voies d’internalisation et de routage cellulaire pour exprimer efficacement leur matériel génétique. Nous avons donc supposé que l’exploitation des voies d’internalisation et de routage cellulaire d’un récepteur pourrait, de façon similaire à plusieurs virus, permettre d’optimiser le processus de transfection en réduisant les quantités d’ADNp et d’agent de transfection nécessaires. Une alternative au PEI pour transfecter les cellules de mammifèreest l’utilisation de protéines possédant un domaine de liaison à l’ADNp. Toutefois, leur utilisation reste marginale à cause de la grande quantité requise pour atteindre l’expression du transgène. Dans cette étude, nous avons utilisé le système E/Kcoil afin de cibler un récepteur membranaire dans le but de délivrer l’ADNp dans des cellules de mammifères. Le Ecoil et le Kcoil sont des heptapeptides répétés qui peuvent interagir ensemble avec une grande affinité et spécificité afin de former des structures coiled-coil. Nous avons fusionné le Ecoil avec des protéines capables d’interagir avec l’ADNp et le Kcoil avec un récepteur membranaire que nous avons surexprimé dans les cellules HEK293 de manière stable. Nous avons découvert que la réduction de la sulfatation de la surface cellulaire permettait l’attachement ciblé sur les cellules par l’intermédiaire du système E/Kcoil. Nous démontrons dans cette étude comment utiliser le système E/Kcoil et une protéine interagissant avec l’ADNp pour délivrer un transgène de manière ciblée. Cette nouvelle méthode de transfection permet de réduire les quantités de protéines nécessaires pour l’expression du transgène.

Le système endocannabinoïde dans la rétine du singe : expression, localisation et fonctions

Le cannabis produit de nombreux effets psychologiques et physiologiques sur le corps humain. Les molécules contenues dans cette plante, désignées comme « phytocannabinoïdes », activent un système endogène qu’on appelle le système endocannabinoïde (eCB). Les effets de la consommation de cannabis sur la vision ont déjà été décrits sans cependant de formulation sur les mécanismes sous-jacents. Ces résultats comportementaux suggèrent, malgré tout, la présence de ce système eCB dans le système visuel, et particulièrement dans la rétine. Cette thèse vise donc à caractériser l’expression, la localisation et le rôle du système eCB dans la rétine du singe vervet, une espèce animale ayant un système visuel semblable à celui de l’humain. Nous avons mis au point un protocole expérimental d’immunohistochimie décrit dans l’article apparaissant dans l’Annexe I que nous avons utilisé pour répondre à notre objectif principal. Dans une première série de quatre articles, nous avons ainsi caractérisé l’expression et la localisation de deux récepteurs eCBs reconnus, les récepteurs cannabinoïdes de type 1 (CB1R) et de type 2 (CB2R), et d’un 3e présumé récepteur aux cannabinoïdes, le récepteur GPR55. Dans l’article 1, nous avons démontré que CB1R et une enzyme clé de ce système, la fatty acid amide hydrolase (FAAH), sont exprimés dans les parties centrale et périphérique de la rétine, et abondamment présents dans la fovéa, une région où l’acuité visuelle est maximale. Dans l’article 2, nous avons localisé le CB2R dans des cellules gliales de la rétine : les cellules de Müller et nous avons proposé un modèle sur l’action de cette protéine dans la fonction rétinienne faisant appel à une cascade chimique impliquant les canaux potassiques. Dans l’article 3, nous avons observé le GPR55 exclusivement dans les bâtonnets qui sont responsables de la vision scotopique et nous avons soumis un deuxième modèle de fonctionnement de ce récepteur par le biais d'une modulation des canaux calciques et sodiques des bâtonnets. Vu que ces 3 récepteurs se retrouvent dans des cellules distinctes, nous avons suggéré leur rôle primordial dans l’analyse de l’information visuelle au niveau rétinien. Dans l’article 4, nous avons effectué une analyse comparative de l’expression du système eCB dans la rétine de souris, de toupayes (petits mammifères insectivores qui sont sont considérés comme l’étape intermédiaire entre les rongeurs et les primates) et de deux espèces de singe (le vervet et le rhésus). Ces résultats nous ont menés à présenter une hypothèse évolutionniste quant à l’apparition et à la fonction précise de ces récepteurs. Dans les articles subséquents, nous avons confirmé notre hypothèse sur le rôle spécifique de ces trois récepteurs par l’utilisation de l’électrorétinographie (ERG) après injection intravitréenne d’agonistes et d’antagonistes de ces récepteurs. Nous avons conclu sur leur influence indéniable dans le processus visuel rétinien chez le primate. Dans l’article 5, nous avons établi le protocole d’enregistrement ERG normalisé sur le singe vervet, et nous avons produit un atlas d’ondes ERG spécifique à cette espèce, selon les règles de l’International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV). Les patrons électrorétinographiques se sont avérés semblables à ceux de l’humain et ont confirmé la similarité entre ces deux espèces. Dans l’article 6, nous avons démontré que le blocage de CB1R ou CB2R entraine une modification de l’électrorétinogramme, tant au niveau photopique que scotopique, ce qui supporte l’implication de ces récepteurs dans la modulation des ondes de l’ERG. Finalement, dans l’article 7, nous avons confirmé le modèle neurochimique proposé dans l’article 3 pour expliquer le rôle fonctionnel de GPR55, en montrant que l’activation ou le blocage de ce récepteur, respectivement par un agoniste (lysophosphatidylglucoside, LPG) ou un antagoniste (CID16020046), entraine soit une augmentation ou une baisse significative de l’ERG scotopique seulement. Ces données, prises ensemble, démontrent que les récepteurs CB1R, CB2R et GPR55 sont exprimés dans des types cellulaires bien distincts de la rétine du singe et ont chacun un rôle spécifique. L’importance de notre travail se manifeste aussi par des applications cliniques en permettant le développement de cibles pharmacologiques potentielles dans le traitement des maladies de la rétine.