Mécanisme de leucémogénèse par les oncogènes SCL et LMO1

La leucémie lymphoïde représente 30% de tous les cancers chez l’enfant. SCL (« Stem cell leukemia ») et LMO1/2 (« LIM only protein ») sont les oncogènes les plus fréquemment activés dans les leucémies aiguës des cellules T chez l'enfant (T-ALL). L’expression ectopique de ces deux oncoprotéines dans le thymus de souris transgéniques induit un blocage de la différenciation des cellules T suivie d’une leucémie agressive qui reproduit la maladie humaine. Afin de définir les voies génétiques qui collaborent avec ces oncogènes pour induire des leucémies T-ALL, nous avons utilisé plusieurs approches. Par une approche de gène candidat, nous avons premièrement identifié le pTalpha, un gène crucial pour la différenciation des cellules T, comme cible directe des hétérodimères E2AHEB dans les thymocytes immatures. De plus, nous avons montré que pendant la différenciation normale des thymocytes, SCL inhibe la fonction E2A et HEB et qu’un dosage entre les protéines E2A, HEB et SCL détermine l’expression du pTalpha. Deuxièmement, par l’utilisation d’une approche globale et fonctionnelle, nous avons identifié de nouveaux gènes cibles des facteurs de transcription E2A et HEB et montré que SCL et LMO1 affectent la différenciation thymocytaire au stade préleucémique en inhibant globalement l’activité transcriptionnelle des protéines E par un mécanisme dépendant de la liaison à l’ADN. De plus, nous avons découvert que les oncogènes SCL et LMO1 sont soit incapables d’inhiber totalement l’activité suppresseur de tumeur des protéines E ou agissent par une voie d’induction de la leucémie différente de la perte de fonction des protéines E. Troisièmement, nous avons trouvé que Notch1, un gène retrouvé activé dans la majorité des leucémies T-ALL chez l’enfant, opère dans la même voie génétique que le pré-TCR pour collaborer avec les oncogènes SCL et LMO1 lors du processus de leucémogénèse. De plus, cette collaboration entre des facteurs de transcription oncogéniques et des voies de signalisation normales et importantes pour la détermination de la destinée cellulaire pourraient expliquer la transformation spécifique à un type cellulaire. Quatrièmement, nous avons trouvé que les oncogènes SCL et LMO1 sont des inducteurs de sénescence au stade préleucémique. De plus, la délétion du locus INK4A/ARF, un évènement retrouvé dans la majorité des leucémies pédiatriques T-ALL associées avec une activation de SCL, collabore aves les oncogènes SCL et LMO1 dans l’induction de la leucémie. Cette collaboration entre la perte de régulateurs de la sénescence suggère qu’un contournement de la réponse de sénescence pourrait être nécessaire à la transformation. Finalement, nous avons aussi montré que l’interaction directe entre les protéines SCL et LMO1 est critique pour l’induction de la leucémie. Ces études ont donc permis d’identifier des évènements collaborateurs, ainsi que des propriétés cellulaires affectées par les oncogènes associés avec la leucémie et de façon plus générale dans le développement du cancer.

The in vivo characterization of the DNA repair gene apn-1 in the model organism Caenorhabditis elegans

Les sites apuriniques/apyrimidinique (AP) représentent une forme de dommage à l’ADN hautement mutagène et ce type de dommage peut survenir spontanément ou être induit par une variété d’agents. Afin de préserver la stabilité génomique, deux familles d’endonucléases de type AP, endo-IV et exo-III, sont nécessaires pour contrecarrer les effets mutagènes des sites AP. Malgré l’identification de membres des deux familles dans plusieurs organismes unicellulaire tels que E.coli et S. cerevisiae, aucun membre de la famille endo-IV n’a été identifié chez les organismes multicellulaires à l’exception de C. elegans et de C. briggsae. Nous avons donc décidé d’investiguer l’importance biologique de APN-1 chez C. elegans par l’utilisation d’une approche de knockdown du gène. Dans notre étude, nous avons montré que le knockdown du gène apn-1 chez C. elegans, en utilisant des ARN d’interférence (ARNi), cause une accumulation de mutations spontanées et induites par des drogues résultant en un délai de l’éclosion des œufs ainsi que par une diminution de la survie et de la longévité des vers adultes. De plus, nous avons montré que cette accumulation de mutations mène à un délai dans la progression du cycle cellulaire durant l’embryogénèse, représentant possiblement une explication du délai dans l’éclosion des œufs. Nous avons montré qu’il y avait une augmentation du niveau de mutations dans la gorge des vers, sans toutefois pouvoir confirmer la distribution de APN-1 qui possède une étiquette GFP. Les animaux transgéniques APN-1-GFP n’exprimaient pas suffisamment de la protéine de fusion pour permettre une visualisation à l’aide d’un microscope à fluorescence, mais la protéine a été détectée par immunobuvardage de type western. Les animaux transgéniques APN-1-GFP étaient instables et avaient des phénotypes concordants avec les défauts génétiques. En conclusion, il semble que C. elegans aie évolué afin de retenir un niveau de base de APN-1 jouant ainsi un rôle versatile afin de maintenir l’intégrité génétique d’autant plus que cet organisme semble manquer plusieurs enzymes de la voie de réparation par excision de base.

A new paradigm for the folding of ribonucleic acids

De récentes découvertes montrent le rôle important que joue l’acide ribonucléique (ARN) au sein des cellules, que ce soit le contrôle de l’expression génétique, la régulation de plusieurs processus homéostasiques, en plus de la transcription et la traduction de l’acide désoxyribonucléique (ADN) en protéine. Si l’on veut comprendre comment la cellule fonctionne, nous devons d’abords comprendre ses composantes et comment ils interagissent, et en particulier chez l’ARN. La fonction d’une molécule est tributaire de sa structure tridimensionnelle (3D). Or, déterminer expérimentalement la structure 3D d’un ARN s’avère fort coûteux. Les méthodes courantes de prédiction par ordinateur de la structure d’un ARN ne tiennent compte que des appariements classiques ou canoniques, similaires à ceux de la fameuse structure en double-hélice de l’ADN. Ici, nous avons amélioré la prédiction de structures d’ARN en tenant compte de tous les types possibles d’appariements, dont ceux dits non-canoniques. Cela est rendu possible dans le contexte d’un nouveau paradigme pour le repliement des ARN, basé sur les motifs cycliques de nucléotides ; des blocs de bases pour la construction des ARN. De plus, nous avons dévelopées de nouvelles métriques pour quantifier la précision des méthodes de prédiction des structures 3D des ARN, vue l’introduction récente de plusieurs de ces méthodes. Enfin, nous avons évalué le pouvoir prédictif des nouvelles techniques de sondage de basse résolution des structures d’ARN.

Niveaux de vitamine a (retinol et acide retinoïque) mesurés dans le sang de cordon ombilical et dévéloppement rénal des nouveau-nés

Introduction : La Vitamine A (rétinol, ROL) et son métabolite l’acide rétinoïque (AR) sont essentielles pour l’embryogénèse. L’excès comme l’insuffisance d’AR sont nocives. L’AR est régularisé dans l’embryon par des gènes spécifiques (ALDH, CRABP, CYP). Hypothèse : Les grandes variations d’AR dans le plasma des adultes normaux, nous ont orienté à mesurer les rétinoïdes (ROL et RA) dans le sang de cordon ombilical, pour évaluer des corrélations avec des polymorphismes des gènes impliquées dans le métabolisme de l’AR et le développement rénal-(RALDH2, CRABP2, CYP26A1; B1). Vérifier pour des corrélations entre ces rétinoïdes et/ou avec la taille de reins à la naissance. Méthodes : Extraction du ROL et RA du sang de cordon ombilical de 145 enfants et analyse par HPLC. Le volume des reins a été mesuré par ultrasonographie et l’ADN génomique leucocytaire extrait (FlexiGene DNA-Kit). 10 échantillons d’ADN ont été exclus (qualité). Les htSNP : ALDH1A2, CRABP2, CYP26A1;B1 du génome humain (HapMap) ont été séquencés et génotypés (Sequenom iPlex PCR).Des testes bio-statistiques des fréquences génotypiques et alléliques ont été effectués (Single-Locus, χ2, Kruskal-Wallis, Allelic-Exact).Des corrélations (ROL, RA, SNPs, V-reins) ont été analysés (Kendall-tau /Oakes). Résultats : La Δ RA (0.07-550.27 nmol/l) non corrélé avec la Δ ROL (51.39-3892.70 nmol/l). Il n’y a pas d’association ROL ou RA avec les volumes des reins ou avec les SNPs/ CYP21A1;B1. Corrélations trouvées : 1. (p=0.035), polymorphisme génétique ALDH1A2-SNP (rs12591551:A/C) hétérozygote/CA, (25enfants, 19%) avec moyennes d’AR (62.21nmol/l). 2. (p=0.013), polymorphisme CRABP2-SNP (rs12724719:A/G) homozygote/AA (4 enfants, 3%) avec hautes valeurs moyennes d’AR (141,3 nmol/l). Discussion-Conclusion : Les grandes ΔRA suggèrent une variabilité génique individuelle du métabolisme de ROL. Les génotypes (CA)-ALDH1A2/ SNP (rs12591551:A/C) et (AA) -CRABP2/SNP (rs12724719:A/G) sont associés à des valeurs moyennes hautes d’AR, pouvant protéger l’embryogénèse lors d’une hypovitaminose A maternelle.

Caractérisation d'une famille de récepteurs kinases impliqués dans le développement gamétophytique chez Arabidopsis thaliana

Au cours du développement des végétaux, de l’établissement de l’identité cellulaire des premiers organes au guidage du tube pollinique, la communication cellule à cellule est d’une importance capitale. En réponse, les voies de signalisation moléculaires sont élaborées pour la perception d’un signal extérieur et la transduction en une réponse génique via une cascade intracellulaire. Les récepteurs kinases font partie des protéines perceptrices des stimuli et constituent chez les plantes une catégorie de protéines avec une occurrence considérable, mais dont très peu d’informations détaillées sont disponibles à ce jour. Une famille de récepteurs kinases chez Arabidopsis thaliana, AtORK11 (Arabidopsis thaliana Ovule Receptor Kinase 11), a été identifiée par orthologie à un récepteur spécifique aux ovaires chez une solanacéee sauvage, Solanum chacoense. La fonction présumée de cette famille de récepteurs kinases de type leucine-rich repeat, suggérée par son patron d’expression, implique les événements relatifs au développement des gamétophytes et à la reproduction. Afin de caractériser la fonction des quatre gènes de la famille (AtORK11a, AtORK11b, AtORK11c et AtORK11d) une stratégie d’analyse de mutants d’insertion de l’ADN-T et d’évaluation du mode d’action par complémentation bimoléculaire par fluorescence (BiFC) a été entreprise. Aucune fonction précise n’a pu être attribuée aux doubles mutants d’insertion, par contre la surexpression d’une construction dominante négative indique un rôle dans le développement gamétophytique. Il a aussi été démontré que les quatre récepteurs peuvent interagir par homodimérisation aussi bien que par hétérodimérisation. Une hypothèse de redondance fonctionnelle est ainsi mise à jour parmi la famille des gènes AtORK11.

Régulation dépendante du cycle cellulaire de la réparation par excision de nucléotides

La réparation par excision de nucléotides (NER) est une voie critique chez l'homme pour enlever des lésions qui déforment l’hélice d'ADN et qui bloquent à la fois la réplication et la transcription. Parmi ces lésions, il y a les dimères cyclobutyliques de pyrimidines (CPDs) et les adduits pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4PPs) induient par les rayons ultraviolets. L'importance physiologique de la NER est mise en évidence par l’existence de la maladie Xeroderma pigmentosum (XP), causée par des mutations affectant des gènes impliqués dans cette voie de réparation. Les personnes atteintes sont caractérisées par une photosensibilité extrême et une forte prédisposition à développer des tumeurs cutanées (plus de 1000 fois). Les patients atteints du type variant de la maladie Xeroderma pigmentosum (XPV), apparemment compétents en réparation, portent plutôt des mutations dans le gène codant pour l'ADN polymérase η (polη). Polη est une ADN polymérase translésionnelle capable de contourner avec une grande fidélité certaines lésions telles que les CPDs, qui autrement bloquent les polymérases réplicatives. Ainsi, la polη prévient la formation de mutations et permet la reprise de la synthèse d'ADN. L'objectif principal de cette thèse est d'évaluer le rôle potentiel de voies de signalisation majeures dans la régulation de la NER, dont celles régulées par la kinase ATR (Ataxia Télangiectasia and Rad3-related kinase). Suite à l'irradiation UV, ATR est rapidement activée et phosphoryle des centaines de protéines qui régulent les points de contrôle du cycle cellulaire et joue un rôle notoire dans le maintient de la stabilité génomique. Nous avons postulé qu’ATR puisse réguler la NER de manière dépendante du cycle cellulaire. Cependant, tester cette hypothèse représente un grand défi car, pour des raisons techniques, les méthodes conventionnelles n’ont pas à ce jour été adaptées pour l'évaluation de la cinétique de réparation au cours des différentes phases du cycle cellulaire. Nous avons donc développé une méthode novatrice basée sur la cytométrie en flux permettant de quantifier avec grande précision la cinétique de réparation des 6-4PPs et CPDs dans chacune des phases G0/G1, S et G2/M. Avec cette nouvelle méthode, nous avons pu démontrer que l'inhibition d'ATR ou polη résulte en une très forte inhibition de la NER exclusivement durant la phase S du cycle cellulaire. Ces études ont révélé, pour la première fois, une fonction critique pour ces protéines dans le retrait des lésions qui bloquent la réplication. En outre, nous avons démontré que la synthèse d'ADN est indispensable pour l’inhibition de la réparation en phase-S, reflétant un lien potentiel entre la NER et la réplication. Curieusement, nous avons également montré que parmi six lignées cellulaires tumorales choisies aléatoirement, trois présentent une abrogation totale de la NER uniquement pendant la phase S, ce qui indique que de nombreux cancers humains pourraient être caractérisés par un tel défaut. Nos observations pourraient avoir d'importantes implications pour le traitement du cancer. En effet, le statut de la NER semble constituer un déterminant majeur dans la réponse clinique aux médicaments chimiothérapeutiques tels que le cisplatine, qui inhibent la croissance des cellules cancéreuses via l'induction de lésions à l’ADN.

Identification et caractérisation d'un domaine de transactivation dans l’hélicase E1 des papillomavirus humains

Les papillomavirus sont des virus à ADN qui infectent la peau et les muqueuses. Ils causent des verrues et peuvent aussi mener au développement de cancers, dont le cancer du col de l’utérus. La réplication de leur génome nécessite deux protéines virales : l’hélicase E1 et le facteur de transcription E2, qui recrute E1 à l’origine de réplication virale. Pour faciliter l’étude de la réplication du génome viral, un essai quantitatif et à haut débit basé sur l’expression de la luciférase a été développé. Parallèlement, un domaine de transactivation a été identifié dans la région régulatrice N-terminale de la protéine E1. La caractérisation de ce domaine a montré que son intégrité est importante pour la réplication de l’ADN. Cette étude suggère que le domaine de transactivation de E1 est une région protéique intrinsèquement désordonnée qui permet la régulation de la réplication du génome viral par son interaction avec diverses protéines.

Manipulation of the ubiquitin-proteasome system by HIV-1 : role of the accessory protein Vpr

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), l’agent étiologique du SIDA, est un rétrovirus complexe arborant plusieurs protéines accessoires : Nef, Vif, Vpr, et Vpu. Celles-ci sont impliquées dans la modulation de la réplication virale, dans l’évasion immunitaire et dans la progression de la pathogenèse du SIDA. Dans ce contexte, il a été démontré que la protéine virale R (Vpr) induit un arrêt de cycle cellulaire en phase G2. Le mécanisme par lequel Vpr exerce cette fonction est l’activation, ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related)-dépendante, du point de contrôle de dommage à l’ADN, mais les facteurs et mécanismes moléculaires directement impliqués dans cette activité demeurent inconnus. Afin d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires interagissant avec Vpr, nous avons utilisé une purification d’affinité en tandem (TAP) pour isoler des complexes protéiques natifs contenant Vpr. Nous avons découvert que Vpr s’associait avec CRL4A(VprBP), un complexe cellulaire d’E3 ubiquitine ligase, comprenant les protéines Cullin 4A, DDB1 (DNA damage-binding protein 1) et VprBP (Vpr-binding protein). Nos études ont mis en évidence que le recrutement de la E3 ligase par Vpr était nécessaire mais non suffisant pour l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2, suggérant ainsi que des événements additionnels seraient impliqués dans ce processus. À cet égard, nous apportons des preuves directes que Vpr détourne les fonctions de CRL4A(VprBP) pour induire la polyubiquitination de type K48 et la dégradation protéosomale de protéines cellulaires encore inconnues. Ces événements d’ubiquitination induits par Vpr ont été démontrés comme étant nécessaire à l’activation d’ATR. Finalement, nous montrons que Vpr forme des foyers ancrés à la chromatine co-localisant avec VprBP ainsi qu’avec des facteurs impliqués dans la réparation de l’ADN. La formation de ces foyers représente un événement essentiel et précoce dans l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2. Enfin, nous démontrons que Vpr est capable de recruter CRL4A(VprBP) au niveau de la chromatine et nous apportons des preuves indiquant que le substrat inconnu ciblé par Vpr est une protéine associée à la chromatine. Globalement, nos résultats révèlent certains des ménanismes par lesquels Vpr induit des perturbations du cycle cellulaire. En outre, cette étude contribue à notre compréhension de la modulation du système ubiquitine-protéasome par le VIH-1 et son implication fonctionnelle dans la manipulation de l’environnement cellulaire de l’hôte.

La régulation génique chez Solanum chacoense : de la pollinisation jusqu’à l’embryogenèse

Chez les végétaux supérieurs, l’embryogenèse est une phase clé du développement au cours de laquelle l’embryon établit les principales structures qui formeront la future plante et synthétise et accumule des réserves définissant le rendement et la qualité nutritionnelle des graines. Ainsi, la compréhension des évènements moléculaires et physiologiques menant à la formation de la graine représente un intérêt agronomique majeur. Toutefois, l'analyse des premiers stades de développement est souvent difficile parce que l'embryon est petit et intégré à l'intérieur du tissu maternel. Solanum chacoense qui présente des fleurs relativement grande facilitant l’isolation des ovules, a été utilisée pour l’étude de la biologie de la reproduction plus précisément la formation des gamètes femelles, la pollinisation, la fécondation et le développement des embryons. Afin d'analyser le programme transcriptionnel induit au cours de la structuration de ces étapes de la reproduction sexuée, nous avons mis à profit un projet de séquençage de 7741 ESTs (6700 unigènes) exprimés dans l’ovule à différents stades du développement embryonnaire. L’ADN de ces ESTs a été utilisé pour la fabrication de biopuces d’ADN. Dans un premier temps, ces biopuces ont été utilisé pour comparer des ADNc issus des ovules de chaque stade de développement embryonnaire (depuis le zygote jusqu’au embryon mature) versus un ovule non fécondé. Trois profils d’expression correspondant au stade précoce, intermédiaire et tardive ont été trouvés. Une analyse plus approfondie entre chaque point étudié (de 0 à 22 jours après pollinisation), a permis d'identifier des gènes spécifiques caractérisant des phases de transition spécifiques. Les annotations Fonctionnelles des gènes differentiellement exprimés nous ont permis d'identifier les principales fonctions cellulaires impliquées à chaque stade de développement, révélant que les embryons sont engagés dans des actifs processus de différenciation. Ces biopuces d’ADN ont été par la suite utilisé pour comparer différent types de pollinisation (compatible, incompatible, semi-compatible et inter-espèce) afin d’identifier les gènes répondants à plusieurs stimuli avant l'arrivé du tube pollinique aux ovules (activation à distance). Nous avons pu démontrer que le signal perçu par l’ovaire était différent et dépend de plusieurs facteurs, incluant le type de pollen et la distance parcourue par le pollen dans le style. Une autre analyse permettant la comparaison des différentes pollinisations et la blessure du style nous a permis d’identifier que les programmes génétiques de la pollinisation chevauchent en partie avec ceux du stress. Cela était confirmé en traitant les fleurs par une hormone de stress, méthyle jasmonate. Dans le dernier chapitre, nous avons utilisé ces biopuces pour étudier le changement transcriptionnel d’un mutant sur exprimant une protéine kinase FRK2 impliqué dans l’identité des ovules. Nous avons pu sélectionner plusieurs gènes candidat touchés par la surexpression de cette kinase pour mieux comprendre la voie se signalisation. Ces biopuces ont ainsi servi à déterminer la variation au niveau transcriptionnelle des gènes impliqués lors de différents stades de la reproduction sexuée chez les plantes et nous a permis de mieux comprendre ces étapes.

Étude sur le rôle des mutations de novo dans l’étiologie génétique de la schizophrénie

La schizophrénie est une maladie psychiatrique grave qui affecte approximativement 1 % de la population. Il est clairement établi que la maladie possède une composante génétique très importante, mais jusqu’à présent, les études ont été limitées au niveau de l’identification de facteurs génétiques spécifiquement liés à la maladie. Avec l’avènement des nouvelles avancées technologiques dans le domaine du séquençage de l’ADN, il est maintenant possible d’effectuer des études sur un type de variation génétique jusqu’à présent laissé pour compte : les mutations de novo, c.-à-d. les nouvelles mutations non transmises de manière mendélienne par les parents. Ces mutations peuvent avoir deux origines distinctes : une origine germinale au niveau des gamètes chez les parents ou une origine somatique, donc au niveau embryonnaire directement chez l’individu. L’objectif général de la présente recherche est de mieux caractériser les mutations de novo dans la schizophrénie. Comme le rôle de ces variations est peu connu, il sera également nécessaire de les étudier dans un contexte global au niveau de la population humaine. La première partie du projet consiste en une analyse exhaustive des mutations de novo dans la partie codante (exome) de patients atteints de schizophrénie. Nous avons pu constater que non seulement le taux de mutations était plus élevé qu’attendu, mais nous avons également été en mesure de relever un nombre anormalement élevé de mutations non-sens, ce qui suggère un profil pathogénique. Ainsi, nous avons pu fortement suggérer que les mutations de novo sont des actrices importantes dans le mécanisme génétique de la schizophrénie. La deuxième partie du projet porte directement sur les gènes identifiés lors de la première partie. Nous avons séquencé ces gènes dans une plus grande cohorte de cas et de contrôles afin d’établir le profil des variations rares pour ces gènes. Nous avons ainsi conclu que l’ensemble des gènes identifiés par les études de mutations de novo possède un profil pathogénique, ce qui permet d’établir que la plupart de ces gènes ont un rôle réel dans la maladie et ne sont pas des artéfacts expérimentaux. De plus, nous avons pu établir une association directe avec quelques gènes qui montrent un profil aberrant de variations rares. La troisième partie du projet se concentre sur l’effet de l’âge paternel sur le taux de mutations de novo. En effet, pour la schizophrénie, il est démontré que l’âge du père est un facteur de risque important. Ainsi, nous avons tenté de caractériser l’effet de l’âge du père chez des patients en santé. Nous avons observé une grande corrélation entre l’âge du père et le taux de mutations germinales et nous avons ainsi pu répertorier certaines zones avec un grand nombre de mutations de novo, ce qui suggère l’existence de zone chaude pour les mutations. Nos résultats ont été parmi les premiers impliquant directement les mutations de novo dans le mécanisme génétique de la schizophrénie. Ils permettent de jeter un nouveau regard sur les réseaux biologiques à l’origine de la schizophrénie en mettant sous les projecteurs un type de variations génétiques longtemps laissé pour compte.

Études structurales d’interactions protéine/protéine impliquées dans l’érythropoïèse

Le développement hématopoïétique est régulé par l’action combinée de facteurs de transcription lignée spécifiques et de la machinerie transcriptionnelle de base, permettant ainsi l’expression de gènes en temps et lieu appropriés. Les travaux présentés dans cette thèse portent sur l’étude structurale et fonctionnelle d’interactions décisives pour la régulation de l’expression de gènes et impliquant des domaines de transactivation (TAD). En effet, les interactions faisant intervenir les TAD d’activateurs permettent de réguler l’activation de la transcription de façon spécifique. La première étude présentée dans cette thèse relate l'identification et la caractérisation d'une nouvelle interaction entre deux facteurs de transcription : le facteur hématopoïétique GATA-1 et la protéine suppresseur de tumeur p53. En combinant des études in vitro par titrage calorimétrique en condition isotherme (ITC) et par spectroscopie RMN et des études in vivo, nous avons identifié et caractérisé cette nouvelle interaction. Il s'avère que le TAD de p53 et le domaine de liaison à l’ADN de GATA-1 sont les domaines minimaux requis pour la formation de ce complexe. L'inhibition de la voie p53 par GATA-1 s’est avérée être la conséquence majeure de cette interaction, permettant ainsi le maintien en vie des précurseurs érythrocytaires via l’inhibition de l’apoptose. Un deuxième type d’interaction a fait l’objet d’études : l’interaction entre divers TAD et la machinerie transcriptionnelle de base, plus spécifiquement avec le Facteur général de Transcription IIH (TFIIH). La structure des complexes constitués par la sous-unité Tfb1/p62 du facteur TFIIH en interaction avec le TAD viral de VP16 d’une part, et avec le TAD humain du facteur érythrocytaire « Erythroid Krüppel-like factor» (EKLF) d’autre part, ont été résolues par spectroscopie RMN. La structure du complexe Tfb1/VP16 a révélée que le mode de liaison de VP16 à Tfb1 est similaire au mode de liaison du TAD de p53 avec le même partenaire. En effet, les TAD de VP16 et de p53 forment tous deux une hélice α de 9 résidus en interaction avec Tfb1. En dépit de partager avec p53 et VP16 le même site de liaison sur Tfb1/p62, la structure RMN du complexe EKLF/Tfb1 démontre que le mode d’interaction de ce TAD se distingue du mode de liaison canonique des activeurs transcriptionnels. Etonnamment, EKLF adopte un mécanisme de liaison semblable au mécanisme de liaison du facteur général de transcription TFIIEα avec p62, leurs conformations demeurent étendues en interaction avec Tfb1/p62. En se basant sur nos données structurales, nous avons identifié un résidu dans le TAD d'EKLF décisif pour la formation du complexe EKLF/p62 : le Trp73. La mutation de cet acide aminé perturbe son interaction avec Tfb1PH/p62PH et réduit significativement l'activité transcriptionnelle d'EKLF dans les érythrocytes.

Mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de l’acide polysialique (PSA) dans le néocortex visuel des souris durant la maturation des synapses GABAergiques

Le fonctionnement du cortex cérébral nécessite l’action coordonnée de deux des sous-types majeurs de neurones, soient les neurones à projections glutamatergiques et les interneurones GABAergiques. Les interneurones GABAergiques ne constituent que 20 à 30% des cellules corticales par rapport au grand nombre de neurones glutamatergiques. Leur rôle est toutefois prépondérant puisqu’ils modulent fortement la dynamique et la plasticité des réseaux néocorticaux. Il n’est donc pas surprenant que les altérations de développement des circuits GABAergiques soient associées à plusieurs maladies du cerveau, incluant l’épilepsie, le syndrome de Rett et la schizophrénie. La compréhension des mécanismes moléculaires régissant le développement des circuits GABAergiques est une étape essentielle menant vers une meilleure compréhension de la façon dont les anormalités se produisent. Conséquemment, nous nous intéressons au rôle de l’acide polysialique (PSA) dans le développement des synapses GABAergiques. PSA est un homopolymère de chaînons polysialylés en α-2,8, et est exclusivement lié à la molécule d’adhésion aux cellules neuronales (NCAM) dans les cerveaux de mammifères. PSA est impliqué dans plusieurs processus développementaux, y compris la formation et la plasticité des synapses glutamatergiques, mais son rôle dans les réseaux GABAergiques reste à préciser. Les données générées dans le laboratoire du Dr. Di Cristo démontrent que PSA est fortement exprimé post- natalement dans le néocortex des rongeurs, que son abondance diminue au cours du développement, et, faits importants, que son expression dépend de l’activité visuelle i et est inversement corrélée à la maturation des synapses GABAergiques. La présente propose de caractériser les mécanismes moléculaires régulant l’expression de PSA dans le néocortex visuel de la souris. Les enzymes polysialyltransférases ST8SiaII (STX) et ST8SiaIV (PST) sont responsables de la formation de la chaîne de PSA sur NCAM. En contrôlant ainsi la quantité de PSA sur NCAM, ils influenceraient le développement des synapses GABAergiques. Mon projet consiste à déterminer comment l’expression des polysialyltransférases est régulée dans le néocortex visuel des souris durant la période post-natale; ces données sont à la fois inconnues, et cruciales. Nous utilisons un système de cultures organotypiques dont la maturation des synapses GABAergiques est comparable au modèle in vivo. L’analyse de l’expression génique par qPCR a démontré que l’expression des polysialyltransférases diminue au cours du développement; une baisse majeure corrélant avec l’ouverture des yeux chez la souris. Nous avons de plus illustré pour la première fois que l’expression de STX, et non celle de PST, est activité-dépendante, et que ce processus requiert l’activation du récepteur NMDA, une augmentation du niveau de calcium intracellulaire et la protéine kinase C (PKC). Ces données démontrent que STX est l’enzyme régulant préférentiellement le niveau de PSA sur NCAM au cours de la période post-natale dans le cortex visuel des souris. Des données préliminaires d’un second volet de notre investigation suggèrent que l’acétylation des histones et la méthylation de l’ADN pourraient également contribuer à la régulation de la transcription de cette enzyme durant le développement. Plus d’investigations seront toutefois nécessaires afin de confirmer cette hypothèse. En somme, la connaissance des mécanismes par lesquels l’expression des ii polysialyltransférases est modulée est essentielle à la compréhension du processus de maturation des synapses GABAergiques. Ceci permettrait de moduler pharmacologiquement l’expression de ces enzymes; la sur-expression de STX et/ou PST pourrait produire une plus grande quantité de PSA, déstabiliser les synapses GABAergiques, et conséquemment, ré-induire la plasticité cérébrale.

Innate immunity genes as determinants of resistance/susceptibility to human disease : studies in leukemia patients

La leucémie lymphoblastique aiguë des cellules Pré-B (B-ALL) reste le type de cancer le plus souvent diagnostiqué chez les enfants. Des études ont montré que des déterminants génétiques jouent un rôle important dans la susceptibilité/résistance au développement de ce cancer. À cet égard, les gènes Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor (KIR) sont d'une importance particulière. Ces gènes sont fortement polymorphiques et codent pour des récepteurs qui contrôlent l’activité fonctionnelle des cellules Natural Killer (NK). Notre hypothèse est que les gènes activateurs des KIR s’associent avec la résistance innée pour développer la B-ALL. Afin d'évaluer cette hypothèse, nous avons entrepris une étude de cas-contrôles chez des enfants canadiens-français dans laquelle nous avons utilisé l'ADN génomique de 100 patients atteints de B-ALL ainsi que l’ADN de 245 individus sains. La présence ou l'absence de chaque gène KIR a été détectée par PCR en utilisant des amorces de séquences spécifiques. Nous avons trouvé que la présence des gènes KIR activateurs est significativement diminuée chez les enfants leucémiques par rapport aux témoins. En outre, le nombre de ces gènes a aussi montré une association significative linéaire avec la résistance au développement d’une B-ALL. Cela suggère des effets additifs de ces gènes permettant de conférer une protection contre ce cancer. Ces résultats pourraient être utiles afin de déceler de façon précoce les enfants ayant un risque de développer cette leucémie. Enfin, des stratégies thérapeutiques basées sur les récepteurs KIR pourraient être envisagées et s'avérer utiles concernant le traitement de ce cancer chez les enfants.

The role of GAPDH in maintaining the functional state of the DNA repair enzyme APE1

Les sites apuriniques/apyrimidiniques (AP) sont des sites de l’ADN hautement mutagène. Les dommages au niveau de ces sites peuvent survenir spontanément ou être induits par une variété d’agents. Chez l’humain, les sites AP sont réparés principalement par APE1, une enzyme de réparation de l’ADN qui fait partie de la voie de réparation par excision de base (BER). APE1 est une enzyme multifonctionnelle; c’est une AP endonucléase, 3’-diestérase et un facteur redox impliqué dans l’activation des facteurs de transcription. Récemment, il a été démontré qu’APE1 interagit avec l’enzyme glycolytique GAPDH. Cette interaction induit l’activation d’APE1 par réduction. En outre, la délétion du gène GAPDH sensibilise les cellules aux agents endommageant l’ADN, induit une augmentation de formation spontanée des sites AP et réduit la prolifération cellulaire. A partir de toutes ces données, il était donc intéressant d’étudier l’effet de la délétion de GAPDH sur la progression du cycle cellulaire, sur la distribution cellulaire d’APE1 et d’identifier la cystéine(s) d’APE1 cible(s) de la réduction par GAPDH. Nos travaux de recherche ont montré que la déficience en GAPDH cause un arrêt du cycle cellulaire en phase G1. Cet arrêt est probablement dû à l’accumulation des dommages engendrant un retard au cours duquel la cellule pourra réparer son ADN. De plus, nous avons observé des foci nucléaires dans les cellules déficientes en GAPDH qui peuvent représenter des agrégats d’APE1 sous sa forme oxydée ou bien des focis de la protéine inactive au niveau des lésions d’ADN. Nous avons utilisé la mutagénèse dirigée pour créer des mutants (Cys en Ala) des sept cystéines d’APE1 qui ont été cloné dans un vecteur d’expression dans les cellules de mammifères. Nous émettons l’hypothèse qu’au moins un mutant ou plus va être résistant à l’inactivation par oxydation puisque l’alanine ne peut pas s’engager dans la formation des ponts disulfures. Par conséquent, on anticipe que l’expression de ce mutant dans les cellules déficientes en GAPDH pourrait restaurer une distribution cellulaire normale de APE1, libérerait les cellules de l’arrêt en phase G1 et diminuerait la sensibilité aux agents endommageant l’ADN. En conclusion, il semble que GAPDH, en préservant l’activité d’APE1, joue un nouveau rôle pour maintenir l’intégrité génomique des cellules aussi bien dans les conditions normales qu’en réponse au stress oxydatif.

Réparation par excision de nucléotides spécifique au cycle cellulaire : implications pour la résistance à la chimiothérapie dans le cancer de l'ovaire humain

Le cancer de l’ovaire est un cancer ayant un taux de décès particulièrement élevé. Les patientes répondent habituellement bien aux traitements chimiothérapeutiques mais la majorité connaîtront une rechute. Plusieurs mécanismes ont été identifiés comme partiellement responsables du développement de la résistance clinique à la chimiothérapie, dont la réparation plus efficace de l’ADN par la réparation par excision de nucléotides (NER). L'un des agents communément utilisés pour traiter ce cancer est le cisplatine, qui induit des dommages à l'ADN réparés par le NER. Une étude précédente de notre laboratoire a démontré qu'une déficience uniquement en phase S de la réparation par le NER peut se produire. Cette déficience est aussi dépendante de la kinase ATR. Nous avons choisi de déterminer si cette déficience est présente dans certains cas de cancer de l’ovaire et si cette déficience joue un rôle sur la résistance à la chimiothérapie. Nos objectifs sont donc : (i) vérifier la présence de cette déficience dans diverses lignées isolées du cancer de l’ovaire ; (ii) vérifier si le traitement chimiothérapeutique par des agents à base de platine peut favoriser la survie de cellules ayant une meilleure capacité de réparation par le NER; (iii) mesurer la sensibilité de ces lignées au cisplatine et vérifier si ceci corrèle avec leur capacité de réparation par le NER en phase S; (iv) déterminer si cette déficience est causée par la kinase ATR dans ces lignées. Nous avons déterminé qu’une déficience importante de la réparation par le GG-NER en phase S est présente dans de nombreuses lignées. De plus, des lignées isolées d’une même patiente pré-chimiothérapie et post-chimiothérapie montrent une augmentation significative de leur capacité de réparation par le GG-NER en phase S, suggérant un rôle de ce processus dans la résistance à la chimiothérapie. Nous avons aussi démontré qu’il y a une corrélation entre la capacité de réparation en phase S par le GG-NER et la sensibilité des lignées au cisplatine. Toutefois, nos résultats suggèrent que cette déficience n’est pas causée par ATR dans ces lignées puisque la phosphorylation de H2AX en réponse aux UV est similaire dans toutes les lignées. En plus d’un important apport fondamental, cette étude permettra d’étudier un potentiel mécanisme de résistance aux traitements chimiothérapeutiques dans le cancer de l’ovaire humain.