81 resultados para CD4 T-lymphocytes
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During tissue inflammation, infiltrated leukocytes may have physical contacts with fibroblasts. We observed that neutrophils and B lymphocytes adhered in a larger proportion than T cells on cultured fibroblasts. Microscopy showed that adhesion was also characterized by leukocyte engulfment by the fibroblasts. In migration assays, only neutrophils and B lymphocytes were selectively able to migrate through a fibroblast barrier. Adhesion and migration were increased by stimulation with tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) and phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA). Antibodies against ICAM-1/beta2 integrin blocked the interaction of neutrophils to fibroblasts. For B lymphocytes the couple VCAM-1/alpha4 integrin was also involved in this interaction. Human skin fibroblasts presented similar adhesion characteristics as rat cardiac fibroblasts. By measuring the distance between the border of migration holes and cadherin-positive adherens junctions, more than 65% of the holes correspond to the transcellular route over the paracellular route. Furthermore, vimentin staining revealed that the migration holes were highly nested by intermediate filaments in accordance with the transcellular route. Our results demonstrated that engulfment of neutrophils and B lymphocytes by fibroblasts resulted in selective passage by a transcellular route.
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Linterfron- pegyl en combinaison avec la ribavirin est le seul traitement approuv pour le traitement de linfection au virus de lhpatite C (VHC). Lefficacit est de 50-75%, la thrapie est coteuse et induit beaucoup deffets secondaires. Il est impratif davoir une meilleure comprhension de la pathogense du VHC afin de dvelopper des traitements plus efficaces ou un vaccin. cette fin, notre approche est de caractriser la rponse immunitaire cellulaire induite par ARFP, un antigne nouveau et conserv chez le VHC, et de cartographier les pitopes de la rponse immunitaire cellulaire dun patient infect au gnotype 3a ayant rsolu spontanment. Le gnotype 3a, tant prvalant chez les utilisateurs de drogues intraveineuses (IDUs) constitue 60% des nouvelles infections. Peu dpitopes furent identifis auparavant pour ce gnotype, ce qui rend ltude de la rponse immunitaire difficile chez cette population. Dans cette tude, pour la rponse immunitaire cellulaire dirige contre ARFP, nous navons pas observ de diffrence significative entre les patients ayant rsolu spontanment comparativement avec ceux ayant dvelopp une infection persistante. Ceci suggre fortement que ARFP ne joue pas un rle majeur lors de la rsolution de linfection aigue au VHC. Pour la caractrisation de la rponse immunitaire cellulaire chez un des patients infects au gnotype 3a, nous avons identifi et caractris 5 pitopes spcifiquement reconnus par des lymphocytes T, CD3+, CD4+ et CD8- : E2504-521, NS31064-1081, NS4b1759-1776, NS5a2074-2091, NS5b2421-2436. Nous avons compar avec ceux connus pour le gnotype 1a. Nous avons identifi 4 nouveaux pitopes. Enfin, lpitope NS4b1759-1776, identifi auparavant, pourrait savrer tre un candidat intressant dans la mise au point dun vaccin base de peptides immunogniques contre le VHC.
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La barrire hmato-encphalique (BHE) protge le systme nerveux central (SNC) en contrlant le passage des substances sanguines et des cellules immunitaires. La BHE est forme de cellules endothliales lies ensemble par des jonctions serres et ses fonctions sont maintenues par des astrocytes, celles ci scrtant un nombre de facteurs essentiels. Une analyse protomique de radeaux lipidiques de cellules endothliales de la BHE humaine a identifi la prsence de la voie de signalisation Hedgehog (Hh), une voie souvent lies des processus de dveloppement embryologique ainsi quau niveau des tissus adultes. Suite nos expriences, jai dtermin que les astrocytes produisent et secrtent le ligand Sonic Hh (Shh) et que les cellules endothliales humaines en cultures primaires expriment le rcepteur Patched (Ptch)-1, le co-rcepteur Smoothened (Smo) et le facteur de transcription Gli-1. De plus, lactivation de la voie Hh augmente ltanchit des cellules endothliales de la BHE in vitro. Le blocage de lactivation de la voie Hh en utilisant lantagoniste cyclopamine ainsi quen utilisant des souris Shh dficientes (-/-) diminue lexpression des protines de jonctions serres, claudin-5, occcludin, et ZO-1. La voie de signalisation sest aussi montre comme tant immunomodulatoire, puisque lactivation de la voie dans les cellules endothliales de la BHE diminue lexpression de surface des molcules dadhsion ICAM-1 et VCAM-1, ainsi que la scrtion des chimiokines pro-inflammatoires IL-8/CXCL8 et MCP-1/CCL2, crant une diminution de la migration des lymphocytes CD4+ travers une monocouche de cellules endothliales de la BHE. Des traitements avec des cytokines pro-inflammatoires TNF- and IFN- in vitro, augmente la production de Shh par les astrocytes ainsi que lexpression de surface de Ptch-1 et de Smo. Dans des lsions actives de la sclrose en plaques (SEP), o la BHE est plus permable, les astrocytes hypertrophiques augmentent leur expression de Shh. Par contre, les cellules endothliales de la BHE naugmentent pas leur expression de Ptch-1 ou Smo, suggrant une dysfonction dans la voie de signalisation Hh. Ces rsultats montrent que la voie de signalisation Hh promeut les proprits de la BHE, et quun environnement dinflammation pourrait potentiellement drgler la BHE en affectant la voie de signalisation Hh des cellules endothliales.
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Limportance respective des lymphocytes T rgulateurs naturels gnrs dans le thymus ou induits en priphrie dans la rgulation immunitaire et la rsolution de linflammation est dsormais bien tablie. Nous avons contribu mettre en vidence une nouvelle voie dinduction de lymphocytes T rgulateurs priphriques partir de cellules T humaines CD4+CD25- naves et mmoires. Nous avons montr que lengagement de la molcule ubiquitaire transmembranaire CD47 sur la cellule T par un anticorps monoclonal ou par le peptide 4N1K (peptide driv du domaine carboxy-terminal de la thrombospondine-1 et spcifique du site de liaison CD47) induisait des lymphocytes T CD4+ rgulateurs exerant une fonction suppressive sur les lymphocytes T effecteurs. Les proprits suppressives induites par la thrombospondine-1 confortent les fonctions anti-inflammatoires de cette protine de la matrice extracellulaire. Linhibition exerce par les lymphocytes T rgulateurs induits dpend du contact intercellulaire entre les cellules T rgulatrices et leurs cibles, et est indpendante du TGF-. Nos rsultats dmontrent galement le rle de CD47 sur le lymphocyte T CD4+ dans la rponse immunitaire spcifique de lantigne in vivo. En effet, les souris BALB/c dficientes pour CD47 prsentent un biais de la scrtion danticorps et de cytokines de type Th1, alors que les souris BALB/c sont dcrites comme exprimant un profil de production de cytokines de type Th2. Nos travaux mettent en vidence le rle de CD47 dans linhibition du dveloppement dune rponse cellulaire et humorale de type Th1 in vivo, confirmant de prcdentes tudes in vitro ralises avec des cellules T CD4+ humaines. Nous prsentons galement le rle inhibiteur de lengagement de CD28 in vitro sur la diffrenciation en cellules Th17 des lymphocytes T CD4+ nafs isols de souris BALB/c. Le mcanisme propos est dpendant de la production de lIL-2 et de lIFN- et indpendant de la prsence de lymphocytes T rgulateurs. Notre tude du rle de deux molcules transmembranaires CD47 et CD28 exprimes sur la cellule T CD4+, contribue une meilleure connaissance des mcanismes impliqus dans la tolrance immunologique, la rsolution de linflammation et la diffrenciation des cellules T "helper" CD4+.
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Les anomalies phnotypiques et fonctionnelles des lymphocytes B (LB) sont typiques d'une infection au VIH et se traduisent principalement par une activation polyclonale, une perte de la mmoire immunitaire ainsi qu'une rponse humorale dficiente et des phnomnes auto-immunitaires souvent prcurseurs de lymphomes B. Ces anomalies se retrouvent principalement chez les patients lors de la phase chronique de la maladie et semblent tre relies en partie au niveau de la charge virale ainsi qu' un compartiment de lymphocytes T CD4+ altr. Cependant, quoique controvers, des lments dactivation polyclonale ont galement t observs chez les non-progresseurs long terme (LTNPs) qui prsentent une charge virale faible et un compartiment T CD4+ semblable aux individus srongatifs. Ainsi, les objectifs principaux de cette tude sont 1) dtablir une chronologie des anomalies du compartiment des cellules B chez des individus infects par le VIH qui ont une progression diffrente de la maladie (PHI normaux, rapides, sains et LTNP). 2) corrler les niveaux sriques du stimulateur de lymphocytes B (BLyS), un facteur de croissance des cellules B, avec les phnotypes observs chez ces mmes patients. Lhyperglobulinmie, les niveaux sriques de BLyS et dauto-anticorps ont t mesur longitudinalement chez une cohorte dindividus en primo-infection (PHI) avec des progressions diffrentes de la maladie (rapides et normaux), LTNP et sujets sains. Nos rsultats dmontrent que lactivation polyclonale des LB survient indpendamment de la vitesse de progression et persiste chez les LTNP ou malgr une thrapie antirtrovirale efficace chez les progresseurs rapides. Des niveaux levs de BLyS dans le srum des progresseurs rapides corrlent avec des frquences altres de monocytes et cellules dendritiques, suggrant un rle de celles-ci dans latteinte du compartiment des cellules B.
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Les molcules classiques du complexe majeur dhistocompatibilit de classe II (CMHII) sont des glycoprotines de surface spcialises dans la prsentation de peptides, principalement drivs de pathognes extracellulaires, aux rcepteurs des lymphocytes T CD4+ afin dinitier la rponse immunitaire adaptative. Elles sont encodes, avec celles du CMH de classe I, par les gnes les plus polymorphiques identifis jusqu maintenant, avec plusieurs loci et une grande diversit alllique chacun deux. De plus, le polymorphisme des gnes du CMHII nest pas limit quaux squences codantes. Il est galement observ dans les promoteurs o on a dmontr ses effets sur le niveau dexpression des gnes. La variation de la rgulation dun gne est considre comme un facteur important et pour laquelle des modifications morphologiques, physiologiques et comportementales sont observes chez tous les organismes. Des squences dADN rptes impliques dans cette rgulation ont t identifies dans les rgions non-codantes des gnomes. Dun autre ct, la slection par les pathognes permettrait lvolution et le maintien du polymorphisme des gnes du CMH chez les vertbrs. ce sujet, plusieurs tudes ont montr limplication de diffrents allles du CMH dans la rsistance ou la susceptibilit aux maladies. Cette tude avait pour objectifs de caractriser le polymorphisme du gne MHIIb chez lomble de fontaine (Salvelinus fontinalis) et de documenter ses effets au niveau de la survie confre par des allles et/ou gnotypes particuliers lors dune infection, ainsi que sur la variation du niveau dexpression du gne dans diffrentes conditions. Dans une premire partie, nous avons identifi un total de 6 allles du gne MHIIb, dsigns Safo-DAB*0101 Safo-DAB*0601, qui montrent une grande similarit avec les squences codantes provenant de poissons tlostens et de lhumain. Lanalyse des squences du domaine b1 a permis de dtecter leffet dune pression slective positive pour maintenir le polymorphisme dans cette rgion de la molcule. Quatre de ces allles ont t tests lors dune exprience dinfection avec le pathogne Aeromonas salmonicida afin dvaluer leffet quils pouvaient avoir sur la survie des poissons. Nous avons trouv que lallle DAB*0101 tait significativement associ la rsistance la furonculose. En plus davoir t identifi chez les individus homozygotes pour cet allle, leffet a galement t remarqu au niveau de la survie les poissons de gnotype DAB*0101/*0201. loppos, les facteurs de risque lev obtenus pour les gnotypes DAB*0201/*0301 et DAB*0301/*0401 suggrent plutt une association la susceptibilit. tant donn la faible frquence laquelle lallle DAB*0101 a t retrouv dans la population, le modle de la slection dpendante de la frquence pourrait expliquer lavantage confr par ce dernier et souligne limportance de ce mcanisme pour le maintien du polymorphisme du gne MHIIb chez lomble de fontaine. Dans une seconde partie, nous avons rapport la prsence dun minisatellite polymorphique form dun motif de 32 nuclotides dans le second intron du gne MHIIb, et pour lequel un nombre exclusif de rptitions du motif a t associ chaque allle (69, 27, 20, 40, 19 et 25 rptitions pour les allles DAB*0101 DAB*0601 respectivement). Lexpression relative de quatre allles a t value dans des poissons htrozygotes aux tempratures de 6 C et 18 C. Les rsultats indiquent que les allles possdant un long minisatellite montrent une rduction de lexpression du gne dun facteur 1,67 2,56 par rapport aux allles qui en contiennent un court. De mme, des allles qui incluent des minisatellites de tailles similaires naffichent pas de diffrence significative au niveau de labondance du transcrit aux deux tempratures. De plus, leffet rpressif associ aux longs minisatellites est amplifi la temprature de 18 C dans des poissons de trois gnotypes diffrents. Nous avons finalement observ une augmentation significative par un facteur 2,08 de lexpression totale du gne MHIIb la temprature de 6 C. Ces rsultats appuient limplication des squences dADN rptes dans la rgulation de lactivit transcriptionnelle dun gne et suggrent quun minisatellite sensible aux diffrences de tempratures pourrait tre soumis aux forces slectives et jouer un rle important dans lexpression de gnes et lvolution des organismes pokilothermes.
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Le VIH-1 a dvelopp plusieurs mcanismes menant la dgradation de son rcepteur cellulaire, la molcule CD4, dans le but daugmenter la relche de particules virales infectieuses et dviter que la cellule soit surinfecte. Lun de ces mcanismes est la dgradation, induite par la protine virale Vpu, du CD4 nouvellement synthtis au niveau du rticulum endoplasmique (RE). Vpu doit lier CD4 et recruter lubiquitine ligase cellulaire SCF-TrCP, via sa liaison -TrCP, afin de dgrader CD4. Puisque CD4 doit tre retenu au RE pour permettre Vpu dinduire sa dgradation via le systme ubiquitine-protasome, il a t suggr que ce processus implique un mcanisme semblable une voie cellulaire de dgradation des protines mal-replies appele ERAD ( endoplasmic reticulum-associated degradation ). La dgradation par ERAD implique gnralement la dislocation des protines du RE vers le cytoplasme afin de permettre leur poly-ubiquitination et leur dgradation par le protasome. Nous avons dmontr que Vpu induit la poly-ubiquitination de CD4 dans des cellules humaines. Nos rsultats suggrent aussi que CD4 doit subir une dislocation afin dtre dgrad par le protasome en prsence de Vpu. De plus, un mutant transdominant ngatif de lATPase p97, qui est implique dans la dislocation des substrats ERAD, inhibe compltement la dgradation de CD4 par Vpu. Enfin, nos rsultats ont montr que lubiquitination sur des rsidus accepteurs de lubiquitine (lysines) de la queue cytoplasmique de CD4 ntait pas essentielle, mais que la mutation des lysines ralentit le processus de dgradation de CD4. Ce rsultat suggre que lubiquitination de la queue cytosolique de CD4 pourrait reprsenter un vnement important dans le processus de dgradation induit par Vpu. Lattachement de lubiquitine a gnralement lieu sur les lysines de la protine cible. Toutefois, lubiquitination sur des rsidus non-lysine (srine, thronine et cystine) a aussi t dmontre. Nous avons dmontr que la mutation de tous les sites potentiels dubiquitination cytoplasmiques de CD4 (K, C, S et T) inhibe la dgradation par Vpu. De plus, la prsence de cystines dans la queue cytoplasmique apparat suffisante pour rendre CD4 sensible Vpu en absence de lysine, srine et thronine. Afin dexpliquer ces rsultats, nous proposons un modle dans lequel lubiquitination de la queue cytosolique de CD4 serait ncessaire sa dgradation et o les sites dubiquitination de CD4 seraient slectionns de faon non spcifique par lubiquitine ligase recrute par Vpu. Enfin, nous avons observ que la co-expression dune protine Vpu incapable de recruter -TrCP (Vpu S52,56/D) semble stabiliser le CD4 qui est retenu au RE. De plus, dautres mutants de Vpu qui semblent capables de recruter -TrCP et CD4 sont toutefois incapables dinduire sa dgradation. Ces rsultats suggrent que lassociation de Vpu CD4 et -TrCP est essentielle mais pas suffisante pour induire la dgradation de CD4. Par consquent, ces rsultats soulvent la possibilit que Vpu puisse recruter dautres facteurs cellulaires pour induire la dgradation de CD4. Les rsultats prsents ont permis de mieux dfinir le mcanisme de dgradation de CD4 par Vpu dans des cellules humaines. De plus, ces rsultats nous ont permis dlaborer un modle dans lequel lubiquitine ligase cellulaire SCF-TrCP dmontre de la flexibilit dans le choix des rsidus ubiquitiner afin dinduire la dgradation de CD4. Enfin, ces tudes jettent un oeil nouveau sur le rle de Vpu dans ce processus puisque nos rsultats suggrent que Vpu doive recruter dautres partenaires cellulaires, mis part -TrCP, pour induire la dgradation de CD4.
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Lhistoire naturelle de linfection anale par le virus du papillome de type 16 (VPH-16) est mal dfinie pour les hommes ayant des relations sexuelles avec dautres hommes (HARSAHs) VIH-sropositifs. Le but de cette tude tait dvaluer lassociation entre la charge pisomale et intgre du VPH-16 et la progression de la noplasie intrapithliale anale (AIN). Les charges pisomales et intgres du VPH-16 furent mesures par PCR quantitatif en temps rel sur 665 spcimens anaux obtenus de 135 hommes VPH-16-positifs participant ltude prospective HIPVIRG (Human Immunodeficiency and Papilloma VIrus Research Group). Le grade de lAIN fut dtermin sur des biopsies obtenues lors des anuscopies haute rsolution priodiques. Lintgration du VPH-16 fut confirme par DIPS-PCR pour dmontrer la prsence de jonctions virales-cellulaires. La charge pisomale du VPH-16 [ratio de cote (OR) 1.5, intervalle de confiance (IC) 95%=1.12.1], le nombre de types de VPH [OR 1.4 (IC 95%=1.11.8)] et le tabagisme actuel [OR 4.8 (IC 95%=1.318.6)], mais non la charge intgre, furent associs aux lsions de haut-grade (AIN-2,3) aprs ajustement pour lge et le dcompte des lymphocytes CD4. La charge pisomale du VPH-16 tait le seul facteur prdictif de progression de lAIN de bas-grade (AIN-1) vers lAIN-2,3 [OR 8.0 (IC 95%=1.255.4)]. Les spcimens avec une charge pisomale du VPH-16 leve taient moins susceptibles de contenir de lintgration [OR 0.5 (IC 95%=0.30.8)]. Lintgration du VPH-16 fut dtecte en absence dAIN, dans lAIN-1 et dans lAIN-2,3. Lanalyse des jonctions virales-cellulaires ne permit pas didentifier un site dintgration spcifique.
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Linfection par le VIH-1 est caractrise par une dpltion progressive des cellules T CD4+ ainsi que par un dysfonctionnement des cellules T qui, en labsence de traitements anti-rtroviraux, conduit inluctablement la progression de la maladie vers le stade SIDA. Certains des mcanismes impliqus dans ce dysfonctionnement de la rponse cellulaire T ont t lucids et ont rvl un rle important de la molcule PD-1 dans lexhaustion des cellules T en phase chronique de linfection. En effet, des niveaux levs de PD-1 ont t associs une charge virale leve ainsi qu une diminution de la production de cytokines et de la capacit de prolifrer des cellules T spcifiques du virus. De plus, bloquer in vitro linteraction de PD-1 avec son ligand PD-L1 en utilisant un anticorps bloquant rtabli la fonction de ces cellules. De faon intressante, notre groupe ainsi que dautres quipes, ont montr que lexpression de PD-1 tait non seulement augmente sur les cellules spcifiques de lantigne mais aussi sur les cellules T totales. Cependant, peu de choses sont connues quant limpact de lexpression de PD-1 sur le renouvellement et la diffrenciation des cellules T qui expriment PD-1, et ce au cours de linfection. Lexpression de PD-1 na notamment pas t tudie en phase aigue de linfection. Nous montrons clairement que, aussi bien chez les individus en phase aigue quen phase chronique de linfection, lexpression de PD-1 est augmente sur toutes les sous-populations T, y compris les cellules naves. Nous avons galement mis en relief une distribution anormale des sous-populations T, ces cellules ayant un phnotype plus diffrenci, et ce tous les stades de la maladie. Dans cette thse, nous discutons le rle possible de PD-1 dans lhomostasie des cellules T chez les individus infects par le VIH-1. En tudiant la transition de la phase aigue la phase chronique de linfection, nous avons trouv que les sous-populations T CD8+ des individus rcemment infects exprimaient moins de PD-1 que celles des individus un stade plus avanc de la maladie. Ces niveaux plus levs de PD-1 sur les cellules T CD8+ en phase chronique sont associs des niveaux rduits de prolifration in vivo comme mesur par lexpression de Ki67 suggrant que lexpression de PD-1 est partiellement implique dans cette perte de fonction des cellules T CD8+. De plus, les cellules naves saccumulent en frquence lors de la transition de la phase aigue la phase chronique de linfection. Considrant que les cellules naves expriment dj des hauts niveaux de PD-1, nous avons mis lhypothse que lactivation initiale des cellules T chez les individus chroniquement infects est affecte. En rsum, nous proposons un modle o des hauts niveaux dexpression de PD-1 sont associs (1) un dysfonctionnement de la rponse cellulaire T CD8+ et (2) un dfaut dactivation des cellules naves ce qui contribue non seulement la progression de la maladie mais aussi ce qui va limiter lefficacit de potentiels vaccins dans linfection par le VIH-1 en empchant toute nouvelle rponse dtre initie. Afin de mieux dissquer la rponse immunitaire mise en place lors dune infection comme celle du VIH-1, nous avons dvelopp un outil qui permet de dtecter les cellules T CD4+ i.e. des ttramres de CMH de classe II. Ces ractifs ont pour but daugmenter lavidit du CMH de classe II pour son ligand et donc de dtecter des TCR de faible affinit. Dans cette thse, nous dcrivons une mthode originale et efficace pour produire diverses molcules de HLA-DR liant de faon covalente le peptide antignique. Mieux dterminer les mcanismes responsables de lexhaustion des cellules T dans linfection par le VIH-1 et de la progression de la maladie, ainsi que dvelopper des outils de pointe pour suivre ces rponses T, est central une meilleure comprhension de linteraction entre le virus et le systme immunitaire de lhte, et permettra ainsi le dveloppement de stratgies pertinentes pour lutter contre linfection par le VIH-1.
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Linjection de cellules immunologiquement comptentes un hte histo-incompatible amne une raction qui peut se traduire par la maladie du greffon-contre-lhte (GVHD). La GVHD demeure une barrire importante une utilisation plus rpandue de la greffe allognique de cellules hmatopotiques (AHCT), pourtant un traitement efficace pour traiter de nombreuses maladies. Une meilleure comprhension des mcanismes qui sous-tendent cette pathologie pourrait en faciliter le traitement et la prvention. LInterfron-gamma (IFN-) et le Transforming Growth Factor-bta (TGF-) sont deux cytokines matresses de limmunit impliques dans la fonction et lhomostasie des cellules greffes. Nous dmontrons chez la souris que lIFN- limite la reconstitution lympho-hmatopotique de faon dose-dpendante en mobilisant des mcanismes dapoptose et en inhibant la prolifration cellulaire. Le TGF- est quant lui gnralement connu comme un immunosuppresseur qui contrle limmunit en utilisant plusieurs voies de signalisation. Le rle relatif de ces voies en AHCT est inconnu. Nous avons tudi une de ces voies en greffant des cellules provenant de donneurs dficients pour le gne SMAD3 (SMAD3-KO), un mdiateur central de la voie canonique du TGF-, des souris histo-incompatibles. Bien que labsence de SMAD3 ne cause aucune maladie chez nos souris donneuses, linjection de cellules SMAD3-KO amne une GVHD du colon svre chez le receveur. Cette atteinte est caractrise par une diffrenciation Th1 et une infiltration massive de granulocytes tmoignant dun rle central de SMAD3 dans la physiologie des lymphocytes T CD4 et des cellules mylodes. Nous avons focalis ensuite nos efforts sur le rle de SMAD3 chez les lymphocytes T CD4 en sachant que SMAD3 tait actif chez les lymphocytes T CD4 tolrants. Nous avons dcouvert que SMAD3 tait rapidement inactiv aprs une activation des cellules T, suggrant que linactivation de SMAD3 tait fonctionnellement importante pour briser ltat de tolrance. Des tudes de micro-puces dADNc nous ont montr que SMAD3 contrlait en effet lexpression de nombreux transcrits de gnes connus comme tant relis la tolrance et/ou des processus biologiques dont les rles dans le maintien de la tolrance sont plausibles.
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La prolifration, la diffrenciation ainsi que les fonctions des cellules du systme immunitaire sont contrles en partie par les cytokines. Lors de linfection par le VIH-1, les dfauts observs dans les fonctions, la maintenance, ainsi que la consistance des cellules du systme immunitaire sont en large partie attribus une production altre des cytokines et un manque defficacit au niveau de leurs effets biologiques. Durant ces tudes, nous nous sommes intrsss la rgulation et aux fonctions de deux cytokines qui sont lIL-18 et lIL-21. Nous avons observ une corrlation inverse significative entre les concentrations sriques dIL-18 et le nombre des cellules NK chez les patients infects par le VIH-1. Nos expriences in vitro ont dmontr que cette cytokine induit lapoptose des cellules NK primaires et que cette mort peut tre inhibe par des anticorps neutralisants spcifiques pour FasL et TNF-. Cette mort cellulaire est due lexpression de FasL sur les cellules NK et la production de TNF- par ces cellules. LIL-18 augmente aussi la susceptibilit la mort des cellules NK par un stimulus pro-apoptotique, en diminuant lexpression de la protine anti-apoptotique Bcl-XL. Nous dmontrons aussi que, contrairement lIL-18, les niveaux dIL-18BP sont plus faibles dans les srum de patients infects. Ceci rsulte sur une production non coordonne de ces deux facteurs, aboutissant des niveaux levs dIL-18 libre et biologiquement active chez les patients infects. Linfection de macrophages in vitro induit la production dIL-18 et rduit celle dIL-18BP. De plus, lIL-10 et le TGF-, dont les concentrations sont leves chez les patients infects, rduisent la production dIL-18BP par les macrophages in vitro. Finalement, nous dmontrons que lIL-18 augmente la rplication du VIH-1 dans les lymphocytes T CD4+ infects. Les niveaux levs dIL-18 libres et biologiquement actives chez les patients infects contribuent donc limmuno-pathognse induite par le VIH-1 en perturbant lhomostasie des cellules NK ainsi quen augmentant la rplication du virus chez les patients. Ces tudes suggrent donc la neutralisation des effets nfastes de lIL-18 en utilisant son inhibiteur naturel soit de lIL-18BP exogne. Ceci permettrait de moduler lactivit de lIL-18 in vivo des niveaux souhaitables. LIL-21 joue un rle clef dans le contrle des infections virales chroniques. Lors de ces tudes, nous avons dtermin la dynamique de la production dIL-21 lors de linfection par le VIH-1 et sa consquence sur la survie des cellules T CD4+ et la frquence des cellules T CD8+ spcifiques au VIH-1. Nous avons dmontr que sa production est compromise tt au cours de linfection et que les concentrations dIL-21 corrlent avec le compte de cellules T CD4+ chez les personnes infectes. Nos tudes ont dmontr que le traitement antirtroviral restaure partiellement la production dIL-21. De plus, linfection par le VIH-1 de cellules T CD4+ humaines inhibe sa production en rduisant lexpression du facteur de transcription c-Maf. Nous avons aussi dmontr que la frquence des cellules T CD4+ spcifiques au VIH-1 qui produisent de lIL-21 est rduite chez les patients virmiques. Selon nos rsultats, lIL-21 empche lapoptose spontane des cellules T CD4+ de patients infects et labsence dIL-21 rduit la frquence des cellules T CD8+ spcifiques au VIH-1 chez ces patients. Nos rsultats dmontrent que l'IL-21R est exprim de faon gale sur tous les sous-types de cellules NK chez les donneurs sains et chez les patients infects. LIL-21 active les protines STAT-3, MAPK et Akt afin d'augmenter les fonctions effectrices des cellules NK. L'activation de STAT-3 joue un rle clef dans ces fonctions avec ou sans un traitement avec de l'IL-21. L'IL-21 augmente l'expression des protines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-XL, augmente la viabilit des cellules NK, mais ne possde aucun effet sur leur prolifration. Nous dmontrons de plus que l'IL-21 augmente l'ADCC, les fonctions scrtrices et cytotoxiques ainsi que la viabilit des cellules NK provenant de patients chroniquement infects par le VIH-1. De plus, cette cytokine semble prsenter ces effets sans augmenter en contrepartie la rplication du VIH-1. Elle permet donc d'inhiber la rplication virale lors de co-cultures autologues de cellules NK avec des cellules T CD4+ infectes d'une manire dpendante l'expression de perforine et l'utilisation de la protine LFA-1. Les niveaux dIL-21 pourraient donc servir de marqueurs biologiques pour accompagner les informations sur le taux de cellules T CD4+ circulantes en nous donnant des informations sur ltat de fonctionnalit de ce compartiment cellulaire. De plus, ces rsultats suggrent lutilisation de cette cytokine en tant quagent immunothrapeutique pour restaurer les niveaux normaux dIL-21 et augmenter la rponse antivirale chez les patients infects par le VIH-1.
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Lhpatite autoimmune (HAI) rsulte dune perte de tolrance du systme immunitaire envers des antignes de lhpatocyte. Elle peut se prsenter sous forme dhpatite aigu, parfois fulminante, ou comme une maladie chronique menant progressivement une cirrhose hpatique. En absence de traitement, cette maladie est fatale. La pathogense de lHAI et les mcanismes responsables de sa progression restent inconnus ce jour. Lobjectif global de ce projet est dexaminer les facteurs prdisposants et les mcanismes immunologiques responsables de lapparition et de la progression de lHAI. Pour permettre ltude de la pathogense de lHAI, nous avons dvelopp un modle murin exprimental dhpatite autoimmune de type 2. Celui-ci est bas sur la xnoimmunisation de souris C57BL/6 avec les deux antignes cibls dans lHAI de type 2 chez lhomme (CYP2D6 et FTCD). Par mimtisme molculaire, le systme immunitaire de ces souris ragit contre les protines murines homologues et une HAI sensuit. Ce modle exprimental prsente la plupart des caractristiques histologiques, biochimiques et srologiques dune HAI de type 2. Les souris dveloppent une inflammation autoimmune chronique avec prsence dhpatite dinterface et dinfiltrations intralobulaires, un infiltrat compos majoritairement de lymphocytes T CD4+ mais aussi de lymphocytes T CD8+ et B, dune lvation des ALT sriques, des niveaux dimmunoglobulines G circulantes augments ainsi que dautoanticorps anti-LKM1 et anti-LC1. Ltude de linfluence du bagage gntique a permis de dfinir limportance relative des gnes du CMH et des gnes non-CMH sur le dveloppement dune HAI. Les gnes du locus CMH sont essentiels mais insuffisants pour mener au dveloppement dune HAI et donc, la susceptibilit gntique lHAI est comme chez lhomme, multignique. Les patients atteints dHAI de type 2 sont gnralement des jeunes filles. Ltude des influences de lge et du sexe dans ce modle a permis de montrer que les souris femelles avant et au dbut de leur maturit sexuelle sont plus susceptibles au dveloppement dune HAI de type 2. De plus, les femelles ont un nombre rduit de lymphocytes T rgulateurs, ce qui leur confre une susceptibilit accrue compar aux mles. Lensemble de ces travaux nous a conduits proposer un mcanisme o le dveloppement dune HAI chez les femelles dun ge particulier rsulterait de lactivation de cellules T CD4+ autoractives ayant chapp aux mcanismes de tolrance centrale, via un mcanisme de mimtisme molculaire avec un antigne exogne. En prsence dune tolrance priphrique rduite due un faible nombre de cellules T rgulatrices, les cellules T autoractives prolifreraient et activeraient des cellules B autoractives entranant la scrtion dautoanticorps. Lactivation subsquente de cellules T CD8+ cytotoxiques spcifiques amnerait la lyse des hpatocytes et la relche dautoantignes permettant la perptuation de lautoimmunit.
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Le systme immunitaire se doit dtre troitement rgul afin dviter que des rponses immunologiques inappropries ou de trop forte intensit ne surviennent. Ainsi, diffrents mcanismes permettent de maintenir une tolrance priphrique, mais aussi dattnuer la rponse lorsque celle-ci nest plus ncessaire. De tels mcanismes sont cependant aussi exploits par les tumeurs, qui peuvent ainsi chapper une attaque par le systme immunitaire et donc poursuivre leur progression. Ces mcanismes immunosuppresseurs nuisent non seulement la rponse naturelle contre les cellules tumorales, mais font aussi obstacle aux tentatives de manipulation clinique de limmunit visant gnrer une rponse anti-tumorale par limmunothrapie. Lun des mcanismes par lesquels les tumeurs svadent du systme immunitaire est lexpression denzymes responsables du mtabolisme des acides amins dont lune des principales est lindoleamine 2,3-dioxygnase (IDO). Cette dernire dgrade le tryptophane et diminue ainsi sa disponibilit dans le microenvironnement tumoral, ce qui engendre des effets ngatifs sur la prolifration, les fonctions et la survie des lymphocytes T qui y sont prsents. Bien que la rgulation de lexpression de cette enzyme ait t largement tudie chez certaines cellules prsentatrices dantignes, dont les macrophages et les cellules dendritiques, peu est encore connu sur sa rgulation dans les cellules tumorales humaines. Nous avons pos lhypothse que diffrents facteurs produits par les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs (TIIC) rgulent lexpression de lIDO dans les cellules tumorales. Nous avons effectivement dmontr quune expression de lIDO est induite chez les cellules tumorales humaines, suite une interaction avec des TIIC. Cette induction indpendante du contact cellulaire rsulte principalement de linterfron-gamma (IFN-g) produit par les lymphocytes T activs, mais est rgule la baisse par linterleukine (IL)-13. De plus, la fludarabine utilise comme agent chimiothrapeutique inhibe linduction de lIDO chez les cellules tumorales en rponse aux lymphocytes T activs. Cette observation pourrait avoir des consquences importantes en clinique sachant quune forte proportion dchantillons cliniques provenant de tumeurs humaines exprime lIDO. Enfin, les lymphocytes B, qui sont retrouvs galement dans certaines tumeurs et qui interagissent troitement avec les lymphocytes T, sont aussi susceptibles une induction transcriptionnelle et traductionnelle de lIDO. Cette enzyme est cependant produite sous une forme inactive dans les lymphocytes B, ce qui rend peu probable lutilisation de lIDO par les lymphocytes B comme mcanisme pour freiner la rponse immunitaire. Nos travaux apportent des informations importantes quant la rgulation de lexpression de la molcule immunosuppressive IDO dans les cellules cancreuses. Ils dmontrent que lexpression de lIDO est influence par la nature des cytokines prsentes dans le microenvironnement tumoral. De plus son expression est inhibe par la fludarabine, un agent utilis pour le traitement de certains cancers. Ces donnes devraient tre prises en considration dans la planification de futurs essais immunothrapeutiques, et pourraient avoir un impact sur les rponses cliniques anti-tumorales.
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La drgulation du compartiment B est une consquence importante de linfection par le virus de limmunodficience humaine (VIH), qui peut mener des manifestations autoimmunes et ultimement des lymphomes B. Parmi les premires anomalies dtectes, on dnote lactivation polyclonale, reflte par la prsence dhyperglobulinmie (hyper-Ig) et des titres levs dautoanticorps chez les patients. On observe galement une altration des dynamiques des populations, notamment une expansion de la population des cellules matures actives. De plus, les patients voluent vers lincapacit de gnrer une rponse humorale efficace, et sont sujets une perte de la mmoire immunologique en phase chronique, caractrise par une diminution de la population des cellules mmoires et par lpuisement cellulaire. Toutefois, on connat trs peu les mcanismes impliqus dans de telles altrations. Les cellules dendritiques (DC) sont parmi les premires populations cellulaires rencontrer et propager le VIH lors dune infection, et sen trouvent affectes directement et indirectement, par le virus et ses composantes. On retrouve en effet une diminution des frquences de DC dans le sang, les muqueuses et les organes lymphodes de patients infects par le VIH, ainsi quun blocage au niveau de la maturation cellulaire. Toutefois, un dbat perdure quant lapparition de ces altrations durant la phase aige de linfection, et la restauration des frquences et des fonctions des DC chez les patients sous traitement. Cette controverse est due la raret des tudes longitudinales incluant des suivis qui schelonnent de la phase aige la phase chronique de linfection. Les DC jouent un rle important dans le dveloppement, la survie et lactivation des lymphocytes B, de faon T-dpendante et T-indpendante, notamment via des facteurs de croissance tel que BLyS (B lymphocyte stimulator). Par consquent, nous formulons lhypothse que dans le cadre dune infection VIH, les altrations observes au niveau des cellules B sont modules par les DC. Lobjectif majeur de cette tude est donc dvaluer limplication potentielle des DC dans les altrations des cellules B au cours de linfection par le VIH. Pour ce faire, nous avons dabord caractris de faon longitudinale le statut des populations de DC du sang priphrique de patients infects au VIH et prsentant diffrents types de progression de la maladie. Cela nous a permis dvaluer la prsence dune corrlation entre les dynamiques de DC et le type de progression. Par la suite, nous avons valu la capacit des DC exprimer BLyS, puis mesur sa concentration ainsi que celles dautres facteurs de croissance des cellules B dans le plasma des patients. Enfin, nous avons caractris le statut des lymphocytes B, en fonction du stade de linfection et du taux de progression clinique des patients. Cette tude dmontre une diminution de la frquence des populations de DC mylodes (mDC) dans le sang de patients infects par le VIH sujets une progression clinique. Cette diminution est observe ds le stade aigu de linfection et au-del du traitement antirtroviral (ART). Des concentrations leves de MCP-1 (monocyte chemotactic protein), MIP (macrophage inflammatory protein) -3 et MIP-3 suggrent la possibilit dun drainage vers des sites priphriques. Nous observons galement des niveaux suprieurs la normale de prcurseurs CD11c+CD14+CD16- en phase chronique, possiblement lis une tendence de rgnration des DC. Les patients en phase chronique prsentent de hautes concentrations plasmatiques de BLyS, reflte par un haut taux dexpression de cette cytokine par les mDC et leurs prcurseurs. Paralllement, nous observons une expansion des cellules B matures actives ainsi que des taux levs dIgG et IgA dans le sang de ces patients. De plus, nous constatons lexpansion dune population de cellules B qui prsente la fois des caractristiques de cellules B immatures transitionnelles (TI, transitional immature), et de cellules B recirculantes actives de la zone marginale (MZ, marginal zone), considres ici comme des prcurseurs/actives de la MZ. Cette tude dmontre aussi, chez les progresseurs lents, une meilleure prservation du compartiment des DC du sang priphrique, accompagne dune augmentation de prcurseurs des DC de phnotype CD11c+CD14+CD16+, ainsi que des concentrations plasmatiques et niveaux dexpression normaux de BLyS. Consquemment, nous navons pas observ daugmentation des cellules B matures actives et des cellules B prcurseurs/actives de la MZ. Toutefois, la frquence des cellules B matures de la MZ est diminue, refltant possiblement leur recrutement vers des sites priphriques et leur contribution un mcanisme actif de contrle de la progression de la maladie. Lensemble de ce travail suggre que dans le cadre dune infection au VIH, les altrations observes au niveau des DC modulent les anomalies des cellules B. Par consquent, le maintien de lquilibre des fonctions DC, notamment les fonctions noninflammatoires, pourrait avoir un impact important dans la prvention de la progression de maladies associes aux altrations du compartiment des cellules B.
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Limmunothrapie tumorale mdiation cellulaire est un traitement qui utilise le systme immunitaire des patients afin dinduire une rponse des lymphocytes T CD8+ (T CD8+) contre la tumeur. Cette rponse est produite suite la reconnaissance des antignes par les T CD8+. Ces cibles sont appeles antignes tumoraux (TAA) et dfinies comme des protines exprimes par les cellules cancreuses mais absentes des tissus normaux. Par une approche bio-informatique, notre laboratoire a identifi Dickkopf-1 (DKK1), une protine inhibitrice de la voie de Wnt, comme un TAA potentiel. Une immunothrapie mdiation cellulaire efficace requiert lidentification de TAA candidats pertinents. Le traitement de patients par immunothrapie pourrait galement tre amliores par laugmentation de la puissance daction anti-tumorale ainsi que la persistante des T CD8+ spcifiques aux TAA. Ce projet de doctorat se divise en deux parties : 1- La caractrisation de lexpression de DKK1 dans les cancers communs et la dtermination de son immunognicit afin de valider sa candidature comme TAA. 2- La reprogrammation des T CD8+, de patients atteints dun cancer commun, vers un phnotype moins diffrenti afin daugmenter leur potentiel anti-tumoral et leur persistance. Dans le premier objectif, nous avons caractris lexpression de DKK1 dans le cancer du sein et dans dautres cancers communs. Le profil dexpression de DKK1 a t tudi par RT-PCR et par ELISA dans plusieurs lignes cellulaires de cancer et dans les tissus normaux. Lexpression de DKK1 a aussi t tudie dans des chantillons cliniques provenant de cancers du sein, du poumon et du rein. Trente pourcents (30%) des tumeurs provenant dun cancer du sein exprimaient DKK1. La moiti des tumeurs DKK1(+) tait triple ngative, donc pas de rcepteurs dstrogne et de progestrone et tait Her-2/neu(-) (ces patientes ont des possibilits de traitements trs restreintes). De plus, 50% des chantillons cliniques de tumeurs du poumon et 30% des tumeurs de rein exprimaient DKK1. Les observations effectues dans le cancer du poumon ont t, par la suite, corrobores par d'autres groupes qui ont montr une corrlation entre l'expression de DKK1 et un mauvais pronostic. Aprs avoir confirme lexpression de DKK1 dans les cancers communs, justifiant ainsi sa candidature comme TAA, nous avons valu limmunognicit de DKK1. Pour ce faire, nous avons effectu des stimulations in vitro de cellules mononucles du sang priphrique (PBMC) de patient(e)s atteint(e)s dun cancer du sein ou du poumon avec des peptides drivs de DKK1 pouvant tre prsents par les complexes majeurs dhistocompatibilit (CMH) HLA-A*0201. Des clones de T CD8+ reconnaissant un peptide de DKK1 ont t identifis et isols. Par essai multiplex et cytomtrie de flux intracellulaire, la polyfonctionnalit dun ces clones T CD8+ spcifiques DKK1 a t tudie et a rvle un profil effecteur, renforant ainsi la candidature de DKK1 comme TAA. Dans lensemble, les rsultats obtenus dans cette premire partie de thse suggrent une possible utilisation de DKK1 en immunothrapie contre les cancers communs, attribuable son expression dans ces cancers et la possibilit de faire prolifrer des T CD8+ effecteurs spcifiques DKK1 partir de sang de patients. Dans la seconde partie de cette thse, je dcrirai la manipulation in vitro des T CD8+ de patients atteints dun cancer commun, afin daugmenter la force et la dure de leurs fonctions anti-tumorales. Il a t dmontr que des lymphocytes moins diffrentis sont capables dune rponse immunologique plus efficace et durable. Nous avons bas ce projet sur lutilisation dun inhibiteur pharmacologique de la GSK-3, pour activer de la voie de Wnt chez les T CD8+ et ainsi leur confrer un phnotype moins diffrenti, partageant des caractristiques de la cellule nave et de la cellule mmoire. Des cultures de T CD8+, spcifiques des antignes viraux, en prsence de linhibiteur ont permis daugmenter la scrtion dinterfron (IFN)- et leur activit cytotoxique. Ces rsultats indiquent un effet de lactivation de la voie de Wnt sur la fonction des T CD8+. Ces observations sont rapportes pour la premire fois chez les T CD8+ humains et suggrent une nouvelle stratgie, applicables limmunothrapie du cancer, afin de prolonger la persistance des cellules ainsi que leur activit anti-tumorale. En conclusion, ces travaux de recherche ont men la ralisation dune tape trs importante dans la validation de la candidature de DKK1 comme TAA pour les cancers communs, soit la dmonstration de son expression dans ces cancers et son absence dans les tissus normaux drivs dorganes importants. Ces travaux ont galement men la dmonstration de limmunognicit de DKK1, par lidentification dun peptide de DKK1 reconnu par les T CD8+. De plus, ltude de la polyfonctionnalit des T CD8+ spcifiques DKK1 a rvle un profil effecteur favorable pour lobtention dune rponse anti-tumorale efficace. Ces dcouvertes pourraient servir llaboration dune stratgie dimmunothrapie mdiation cellulaire pour les cancers communs. Pour sa part, ltude phnotypique et fonctionnelle de la modulation de la voie de Wnt dans les T CD8+ a donn lieu lobservation dun phnotype encore jamais rapport chez lhumain, confrant aux T CD8+ un aspect moins diffrenti avec des caractristiques propre un phnotype mmoire. Ces rsultats sont pertinents dans lamlioration de limmunothrapie du cancer, passant par laugmentation de la persistance des lymphocytes. En rsum, les rsultats prsents dans cette thse de doctorat fournissent des vidences indniables quant la validation de DKK1 comme TAA pour une immunothrapie mdiation cellulaire des cancers communs. Ces rsultats fournissent galement des preuves quant la pertinence de la reprogrammation des T CD8+ par lactivation de la voie de la voie de Wnt, afin de gnrer des lymphocytes mdiateurs plus efficaces pour ce type de thrapie.
