Stress oxydatif, fonction mitochondriale et maladie inflammatoire de l'intestin

CONTEXTE: Bien que la dysfunction mitochondriale et le stress oxydant jouent des rôles prépondérants dans plusieurs conditions pathologiques, ils n’ont pas été étudiés de façon extensive au niveau du tube digestif qui est constamment exposé aux oxydants (provenant de l’alimentation) et à divers agents pathogènes. L’ingestion simultanée de sels ferreux et d’acide ascorbique peut causer le dommage des macromolécules par oxydation. Le ‘’Nuclear factor erythroid 2 related factor’’ (Nrf2) est un important facteur de transcription sensible au potentiel redox et qui protège contre le stress oxydant en induisant des gènes anti-oxydants et de detoxification par sa liaison à l’élément de réponse antioxydante (ARE). Les fonctions anti-oxydantes et anti-inflammatoires de Nrf2 ont été décrites dans une variété de types cellulaires et de tissus. Cependant son rôle est très peu connu au niveau du tube digestif. OBJECTIFS: Les objectifs sont d’évaluer comment la peroxydation lipidique médiée par le fer/ascorbate (FE/ASC) affecte les fonctions mitochondriales dans les cellules Caco-2/15, et de déterminer l’ampleur de l’implication de Nrf2. MÉTHODES: Le stress oxydant a été induit dans les cellules Caco2/15 en les traitant avec 0.2mm/2mm de FE/ASC. L’augmentation de l’expression de Nrf2 a été obtenue suite au prétraitement des cellules Caco2/15 avec 50 μM d’Olitpraz (OPZ), un puissant activateur. L’invalidation du gène de Nrf2 a été réalisée dans les cellules par transfection avec un vecteur lentiviral contenant un shRNA contre Nrf2. RÉSULTATS: Nos résultats montrent que le traitement des cellules Caco-2/15 avec du FE/ASC (0.2 mm/2 mm) augmente les niveaux du malondialdehyde (MDA), réduit la production d’ATP, entraîne une surcharge mitochondriale de calcium, active l’expression protéique du cytochrome C et de l’AIF (apoptotic inducing factor), réduit l’activité des complexes I, II, 2 III et IV de la chaîne respiratoire mitochondriale, augmente les niveaux de 8-OHdG, un marqueur des dommages à l’ADN mitochondrial, diminue la DNA glycosylase, et altère les expressions génique et protéique des facteurs de transcription mitochondriaux (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). De plus, nos observations montrent que l’induction et l’activation de Nrf2 dans les cellules Caco-2/15 résultent en: une augmentation des enzymes anti-oxydantes endogènes (catalase, glutathion peroxydase, et superoxyde dismutase), une réduction du facteur nucléaire NFκβ et de TNF-α, une augmentation de la production d’ ATP et de l’activité des complexes respiratoires (I, II, III, IV) et de PGC-1α, et une régulation des niveaux de la prohibitine mitochondriale, du Bcl-2 anti-apoptotique et de l’occludine. CONCLUSION: Dans l’ensemble, nos résultats montrent que l’exposition aigüe des cellules Caco-2/15 à la peroxydation par le FE/ASC entraîne des effets pathologiques sur les fonctions mitochondriales et l’intégrité de l’ADN, qui sont abolis par l’induction de Nrf2. Il en ressort que Nrf2 joue un rôle majeur dans la protection de l’épithélium intestinal contre le stress oxydant.

Role of the protein tyrosine phosphatase DEP-1 in Src activation and the mediation of biological cell functions of endothelial and breast cancer cells

L’implication des protéines tyrosines phosphatases (PTPs) dans la régulation de la signalisation et la médiation des fonctions cellulaires a été bien établie dans les dernières années. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels les PTPs régulent les processus fondamentaux tels que l’angiogenèse demeurent méconnus. Il a été rapporté que l’expression de la PTP DEP-1 (Density-enhanced phosphatase 1) augmente avec la densité cellulaire et corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2. Cette déphosphorylation contribue à l’inhibition de contact dans les cellules endothéliales à confluence et diminue l’activité du VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement ses résidus catalytiques Y1054/1059. De plus, la plupart des voies de signalisation en aval du VEGFR2 sont diminuées sauf la voie Src-Gab1-AKT. DEP-1 déphosphoryle la Y529 de Src et contribue à la promotion de la survie dans les cellules endothéliales. L’objectif de cette thèse est de mieux définir le rôle de DEP-1 dans la régulation de l’activité de Src et les réponses biologiques dans les cellules endothéliales. Nous avons identifié les résidus Y1311 et Y1320 dans la queue C-terminale de DEP-1 comme sites majeurs de phosphorylation en réponse au VEGF. La phosphorylation de ces résidus est requise pour l’activation de Src et médie le remodelage des jonctions cellules-cellules dépendantes de Src. Ce remodelage induit la perméabilité, l’invasion et la formation de capillaires en réponse au VEGF. Nos résultats démontrent que la phosphorylation de DEP-1 sur résidu tyrosine est requise pour diriger la spécificité de DEP-1 vers son substrat Src. Les travaux révèlent pour la première fois un rôle positif de DEP-1 sur l’induction du programme angiogénique des cellules endothéliales. En plus de la phosphorylation sur tyrosine, DEP-1 est constitutivement phosphorylé sur la thréonine 1318 situé à proximité de la Y1320 en C-terminal. Cette localisation de la T1318 suggère que ce résidu pourrait être impliqué dans la régulation de la Y1320. En effet, nous avons observé que la T1318 de DEP-1 est phosphorylée potentiellement par CK2, et que cette phosphorylation régule la phosphorylation de DEP-1 sur tyrosine et sa capacité de lier et d’activer Src. En accord avec ces résultats, nos travaux révèlent que la surexpression du mutant DEP-1 T1318A diminue le remodelage des jonctions cellules-cellules et par conséquent la perméabilité. Nos résultats suggèrent donc que la T1318 de DEP-1 constitue un nouveau mécanisme de contrôle de la phosphorylation sur tyrosine et que ceci résulte en l’activation de Src et l’induction des fonctions biologiques des cellules endothéliales en réponse au VEGF. Suite à ces travaux dans les cellules endothéliales qui démontrent un rôle positif de DEP-1 dans la médiation des réponses angiogéniques, nous avons voulu approfondir nos connaissances sur l’implication potentielle de DEP-1 dans les cellules cancéreuses où l’activité de Src est requise pour la progression tumorale. Malgré le rôle connu de DEP-1 comme suppresseur tumoral dans différents types de cancer, nous avons émis l’hypothèse que DEP-1 pourrait promouvoir les fonctions biologiques dépendantes de Src telles que la migration et l’invasion dans les cellules cancéreuses. Ainsi, nous avons observé que l’expression de DEP-1 est plus élevée dans les lignées basales de cancer du sein qui sont plus invasives comparativement aux lignées luminales peu invasives. Dans les lignées basales, DEP-1 active Src, médie la motilité cellulaire dépendante de Src et régule la localisation des protéines impliquées dans l’organisation du cytosquelette. L’analyse d’un micro-étalage de tissu a révélé que l’expression de DEP-1 est associée avec une réduction tendencielle de survie des patients. Nos résultats proposent donc, un rôle de promoteur tumoral pour DEP-1 dans la progression du cancer du sein. Les travaux présentés dans cette thèse démontrent pour la première fois que DEP-1 peut agir comme promoteur des réponses angiogéniques et du phénotype pro-invasif des lignées basales du cancer du sein probablement du à sa capacité d’activer Src. Nos résultats suggèrent ainsi que l’expression de DEP-1 pourrait contribuer à la progression tumorale et la formation de métastases. Ces découvertes laissent donc entrevoir que DEP-1 représente une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour contrer l’angiogenèse et le développement du cancer.

Devenir environnemental des antidépresseurs dans les rejets urbains par chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem

Les troubles reliés à la dépression, l’épuisement professionnel et l’anxiété sont de plus en plus répandus dans notre société moderne. La consommation croissante d’antidépresseurs dans les différents pays du monde est responsable de la récente détection de résidus à l’état de traces dans les rejets urbains municipaux. Ainsi, ces substances dites « émergentes » qui possèdent une activité pharmacologique destinée à la régulation de certains neurotransmetteurs dans le cerveau suscitent maintenant de nombreuses inquiétudes de la part de la communauté scientifique. L’objectif principal de ce projet de doctorat a été de mieux comprendre le devenir de plusieurs classes d’antidépresseurs présents dans diverses matrices environnementales (i.e. eaux de surfaces, eaux usées, boues de traitement, tissus biologiques) en développant de nouvelles méthodes analytiques fiables capables de les détecter, quantifier et confirmer par chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-QqQMS, LC-QqToFMS). Une première étude complétée à la station d’épuration de la ville de Montréal a permis de confirmer la présence de six antidépresseurs et quatre métabolites N-desmethyl dans les affluents (2 - 330 ng L-1). Pour ce traitement primaire (physico-chimique), de faibles taux d’enlèvement (≤ 15%) ont été obtenus. Des concentrations d’antidépresseurs atteignant près de 100 ng L-1 ont également été détectées dans le fleuve St-Laurent à 0.5 km du point de rejet de la station d’épuration. Une seconde étude menée à la même station a permis l’extraction sélective d’antidépresseurs dans trois tissus (i.e. foie, cerveau et filet) de truites mouchetées juvéniles exposées à différentes concentrations d’effluent dilué traité et non-traité à l’ozone. Un certain potentiel de bioaccumulation dans les tissus (0.08-10 ng g-1) a été observé pour les spécimens exposés à l’effluent non-traité (20% v/v) avec distribution majoritaire dans le foie et le cerveau. Une intéressante corrélation a été établie entre les concentrations de trois antidépresseurs dans le cerveau et l’activité d’un biomarqueur d’exposition (i.e. pompe N/K ATPase impliquée dans la régulation de la sérotonine) mesurée à partir de synaptosomes de truites exposées aux effluents. Une investigation de l’efficacité de plusieurs stations d’épuration canadiennes opérant différents types de traitements a permis de constater que les traitements secondaires (biologiques) étaient plus performants que ceux primaires (physico-chimiques) pour enlever les antidépresseurs (taux moyen d’enlèvement : 30%). Les teneurs les plus élevées dans les boues traitées (biosolides) ont été obtenues avec le citalopram (1033 ng g-1), la venlafaxine (833 ng g-1) et l’amitriptyline (78 ng g-1). Des coefficients de sorption expérimentaux (Kd) calculés pour chacun des antidépresseurs ont permis d’estimer une grande sorption des composés sertraline, desméthylsertraline, paroxetine et fluoxetine sur les solides (log Kd > 4). Finalement, un excellent taux d’enlèvement moyen de 88% a été obtenu après ozonation (5 mg L-1) d’un effluent primaire. Toutefois, la caractérisation de nouveaux sous-produits N-oxyde (venlafaxine, desmethylvenlafaxine) par spectrométrie de masse à haute résolution (LC-QqToFMS) dans l’effluent traité à l’ozone a mis en lumière la possibilité de formation de multiples composés polaires de toxicité inconnue.

The Effects of Pro-inflammatory Cytokines on the L-type Calcium Current in Mouse Ventricular Myocytes

L’inflammation: Une réponse adaptative du système immunitaire face à une insulte est aujourd’hui reconnue comme une composante essentielle à presque toutes les maladies infectieuses ou autres stimuli néfastes, tels les dommages tissulaires incluant l’infarctus du myocarde et l’insuffisance cardiaque. Dans le contexte des maladies cardiovasculaires, l’inflammation se caractérise principalement par une activation à long terme du système immunitaire, menant à une faible, mais chronique sécrétion de peptides modulateurs, appelés cytokines pro-inflammatoires. En effet, la littérature a montré à plusieurs reprises que les patients souffrant d’arythmies et de défaillance cardiaque présentent des taux élevés de cytokines pro-inflammatoires tels le facteur de nécrose tissulaire alpha (TNFα), l’interleukine 1β (IL-1β) et l’interleukine 6. De plus, ces patients souffrent souvent d’une baisse de la capacité contractile du myocarde. Le but de notre étude était donc de déterminer si un lien de cause à effet existe entre ces phénomènes et plus spécifiquement si le TNFα, l’IL-1β et l’IL-6 peuvent affecter les propriétés électriques et contractiles du cœur en modulant le courant Ca2+ de type L (ICaL) un courant ionique qui joue un rôle primordial au niveau de la phase plateau du potentiel d’action ainsi qu’au niveau du couplage excitation-contraction. Les possibles méchansimes par lesquels ces cytokines exercent leurs effets seront aussi explorés. Pour ce faire, des cardiomyocytes ventriculaires de souris nouveau-nées ont été mis en culture et traités 24 heures avec des concentrations pathophysiologiques (30 pg/mL) de TNFα, IL-1β ou IL-6. Des enregistrements de ICaL réalisés par la technique du patch-clamp en configuration cellule entière ont été obtenus par la suite et les résultats montrent que le TNFα n’affecte pas ICaL, même à des concentrations plus élevées (1 ng/mL). En revanche, l’IL-1β réduisait de près de 40% la densité d’ICaL. Afin d’examiner si le TNFα et l’IL-1β pouvaient avoir un effet synergique, les cardiomyocytes ont été traité avec un combinaison des deux cytokines. Toutefois aucun effet synergique sur ICaL n’a été constaté. En outre, l’IL-6 réduisait ICaL significativement, cependant la réduction de 20% était moindre que celle induite par IL-1β. Afin d’élucider les mécanismes sous-jacents à la réduction de ICaL après un traitement avec IL-1β, l’expression d’ARNm de CaV1.2, sous-unité α codante pour ICaL, a été mesurée par qPCR et les résultats obtenus montrent aucun changement du niveau d’expression. Plusieurs études ont montré que l’inflammation et le stress oxydatif vont de pair. En effet, l’imagerie confocale nous a permis de constater une augmentation accrue du stress oxydatif induit par IL-1β et malgré un traitement aux antioxydants, la diminution de ICaL n’a pas été prévenue. Cette étude montre qu’IL-1β et IL-6 réduisent ICaL de façon importante et ce indépendamment d’une régulation transcriptionelle ou du stress oxydatif. De nouvelles données préliminaires suggèrent que ICaL serait réduit suite à l’activation des protéines kinase C mais des études additionelles seront nécessaires afin d’étudier cette avenue. Nos résultats pourraient contribuer à expliquer les troubles du rythme et de contractilité observés chez les patients souffrant de défaillance cardiaque.

Structure-fonction de MARCH1, une E3 ubiquitine ligase régulant la présentation antigénique par le CMH II

Les molécules classiques du CMH de classe II sont responsables de la présentation de peptides exogènes par les cellules présentatrices d’antigène aux lymphocytes T CD4+. Cette présentation antigénique est essentielle à l’établissement d’une réponse immunitaire adaptative. Cependant, la reconnaissance d’auto-antigènes ainsi que l’élimination des cellules du Soi sont des problèmes à l’origine de nombreuses maladies auto-immunes. Notamment, le diabète et la sclérose en plaque. D’éventuels traitements de ces maladies pourraient impliquer la manipulation de la présentation antigénique chez les cellules dont la reconnaissance et l’élimination engendrent ces maladies. Il est donc primordial d’approfondir nos connaissances en ce qui concerne les mécanismes de régulation de la présentation antigénique. La présentation antigénique est régulée tant au niveau transcriptionnel que post-traductionnel. Au niveau post-traductionnel, diverses cytokines affectent le processus. Parmi celles-ci, l’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, cause une rétention intracellulaire des molécules du CMH II. Son mécanisme d’action consiste en l’ubiquitination de la queue cytoplasmique de la chaîne bêta des molécules de CMH II. Cette modification protéique est effectuée par MARCH1, une E3 ubiquitine ligase dont l’expression est restreinte aux organes lymphoïdes secondaires. Jusqu’à tout récemment, il y avait très peu de connaissance concernant la structure et les cibles de MARCH1. Considérant son impact majeur sur la présentation antigénique, nous nous sommes intéressé à la structure-fonction de cette molécule afin de mieux caractériser sa régulation ainsi que les diverses conditions nécessaires à son fonctionnement. Dans un premier article, nous avons étudié la régulation de l’expression de MARCH1 au niveau protéique. Nos résultats ont révélé l’autorégulation de la molécule par formation de dimères et son autoubiquitination. Nous avons également démontré l’importance des domaines transmembranaires de MARCH1 dans la formation de dimères et l’interaction avec le CMH II. Dans un second article, nous avons investigué l’importance de la localisation de MARCH1 pour sa fonction. Les résultats obtenus montrent la fonctionnalité des motifs de localisation de la portion C-terminale de MARCH1 ainsi que la présence d’autres éléments de localisation dans la portion N-terminale de la protéine. Les nombreux mutants utilisés pour ce projet nous ont permis d’identifier un motif ‘‘VQNC’’, situé dans la portion cytoplasmique C-terminale de MARCH1, dont la valine est requise au fonctionnement optimal de la molécule. En effet, la mutation de la valine engendre une diminution de la fonction de la molécule et des expériences de BRET ont démontré une modification de l’orientation spatiale des queues cytoplasmiques. De plus, une recherche d’homologie de séquence a révélé la présence de ce même motif dans d’autres ubiquitines ligases, dont Parkin. Parkin est fortement exprimée dans le cerveau et agirait, entre autre, sur la dégradation des agrégats protéiques. La dysfonction de Parkin cause l’accumulation de ces agrégats, nommés corps de Lewy, qui entraînent des déficiences au niveau du fonctionnement neural observé chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. La valine comprise dans le motif ‘’VQNC’’ a d’ailleurs été identifiée comme étant mutée au sein d’une famille où cette maladie est génétiquement transmise. Nous croyons que l’importance de ce motif ne se restreint pas à MARCH1, mais serait généralisée à d’autres E3 ligases. Ce projet de recherche a permis de caractériser des mécanismes de régulation de MARCH1 ainsi que de découvrir divers éléments structuraux requis à sa fonction. Nos travaux ont permis de mieux comprendre les mécanismes de contrôle de la présentation antigénique par les molécules de CMH II.

Impact du statut de différenciation des cellules promyélocytaires HL-60 sur l’efficacité anticancéreuse et antiinflammatoire de l’EGCG

L’altération de la barrière hématoencéphalique (BHE) par les cellules tumorales et les cellules immunes circulantes peut mener à la neuroinflammation. Les cellules leucémiques promyélocytaires HL-60 sont un excellent modèle pour étudier et comprendre les mécanismes de signalisation moléculaires qui caractérisent le développement tumoral et métastatique. La cancérogenèse peut s’accompagner de modulations de l’expression de biomarqueurs tels que la cyclooxygénase-2 et la métalloprotéase-9. Les recherches décrites dans ce mémoire relatent l’analyse des biomarqueurs inflammatoires et invasifs régulés lors de la différenciation induite par le PMA des cellules HL-60 en macrophages. Le statut de différenciation cellulaire pourrait avoir un impact sur les gènes cibles de la voie NF-κB. Nous émettons l’hypothèse que le PMA active la voie NF-κB et que cette signalisation peut être renversée par l’(-)-épigallocatéchine-gallate (EGCG). En effet, une régulation à la hausse de l’expression de plusieurs gènes combinée à la diminution de l’expression d’IκB mettent en évidence l’implication de la voie NF-κB dans l’activation des mécanismes pro-inflammatoires et pro-invasifs. Les mêmes observations sont faites dans les cellules différenciées appelées «macrophages-like». L’EGCG, un polyphénol dérivé du thé vert, a un potentiel chimiopréventif. Il est capable d’inhiber la signalisation moléculaire passant par la voie NF-κB dans les cellules HL-60 traitées simultanément par l’EGCG et le PMA, mais pas dans les cellules «macrophages-like». Cette différence peut s’expliquer par une modulation de l’expression du récepteur de surface cellulaire de l’EGCG, le récepteur à la laminine de 67 kDa, et de son précurseur de 37 kDa. Collectivement, nos résultats montrent que le statut de différenciation des cellules promyélocytaires HL-60 concorde avec l’activation des mécanismes favorisant le développement d’un cancer et des métastases. Cet effet peut être prévenu par l’utilisation d’agents naturels tel l’EGCG. Le ciblage de biomarqueurs liés au statut de différenciation des cellules tumorales impliquées dans la perturbation de la barrière hématoencéphalique qui cause la neuroinflammation permettrait l’avancement des connaissances dans la prévention de la cancérogenèse.

The Role of Specific Amino Acids in the Formation of Ternary Complexes in Nitrogenase Regulation in the Photosynthetic Bacterium Rhodobacter capsulatus

L'azote est l'un des éléments les plus essentiels dans le monde pour les êtres vivants, car il est essentiel pour la production des éléments de base de la cellule, les acides aminés, les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires. L’atmosphère est composé de 78% d'azote gazeux, une source d'azote inutilisable par la plupart des organismes à l'exception de ceux qui possèdent l’enzyme nitrogénase, tels que les bactéries diazotrophique. Ces micro-organismes sont capables de convertir l'azote atmosphérique en ammoniac (NH3), qui est l'une des sources d'azote les plus préférables. Cette réaction exigeant l’ATP, appelée fixation de l'azote, est catalysée par une enzyme, nitrogénase, qui est l'enzyme la plus importante dans le cycle de l'azote. Certaines protéines sont des régulateurs potentiels de la synthèse de la nitrogénase et de son activité; AmtB, DraT, DraG, les protéines PII, etc.. Dans cette thèse, j'ai effectué diverses expériences afin de mieux comprendre leurs rôles détailés dans Rhodobacter capsulatus. La protéine membranaire AmtB, très répandue chez les archaea, les bactéries et les eucaryotes, est un membre de la famille MEP / Amt / Rh. Les protéines AmtB sont des transporteurs d'ammonium, importateurs d'ammonium externe, et ont également été suggéré d’agir comme des senseurs d'ammonium. Il a été montré que l’AmtB de Rhodobacter capsulatus fonctionne comme un capteur pour détecter la présence d'ammonium externe pour réguler la nitrogénase. La nitrogénase est constituée de deux métalloprotéines nommées MoFe-protéine et Fe-protéine. L'addition d'ammoniaque à une culture R. capsulatus conduit à une série de réactions qui mènent à la désactivation de la nitrogénase, appelé "nitrogénase switch-off". Une réaction critique dans ce processus est l’ajout d’un groupe ADP-ribose à la Fe-protéine par DraT. L'entrée de l'ammoniac dans la cellule à travers le pore AmtB est contrôlée par la séquestration de GlnK. GlnK est une protéine PII et les protéines PII sont des protéines centrales dans la régulation du métabolisme de l'azote. Non seulement la séquestration de GlnK par AmtB est importante dans la régulation nitrogénase, mais la liaison de l'ammonium par AmtB ou de son transport partiel est également nécessaire. Les complexes AmtB-GlnK sont supposés de lier DraG, l’enzyme responsable pour enlever l'ADP-ribose ajouté à la nitrogénase par DraT, ainsi formant un complexe ternaire. Dans cette thèse certains détails du mécanisme de transduction du signal et de transport d'ammonium ont été examinés par la génération et la caractérisation d’un mutant dirigé, RCZC, (D335A). La capacité de ce mutant, ainsi que des mutants construits précédemment, RCIA1 (D338A), RCIA2 (G344C), RCIA3 (H193E) et RCIA4 (W237A), d’effectuer le « switch-off » de la nitrogénase a été mesurée par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats ont révélé que tous les résidus d'acides aminés ci-dessus ont un rôle essentiel dans la régulation de la nitrogénase. L’immunobuvardage a également été effectués afin de vérifier la présence de la Fe-protéine l'ADP-ribosylée. D335, D388 et W237 semblent être cruciales pour l’ADP-ribosylation, puisque les mutants RCZC, RCIA1 et RCIA4 n'a pas montré de l’ADP-ribosylation de la Fe-protéine. En outre, même si une légère ADP-ribosylation a été observée pour RCIA2 (G344C), nous le considérons comme un résidu d'acide aminé important dans la régulation de la nitrogénase. D’un autre coté, le mutant RCIA3 (H193E) a montré une ADP-ribosylation de la Fe-protéine après un choc d'ammonium, par conséquent, il ne semble pas jouer un rôle important dans l’ADP-ribosylation. Par ailleurs R. capsulatus possède une deuxième Amt appelé AmtY, qui, contrairement à AmtB, ne semble pas avoir des rôles spécifiques. Afin de découvrir ses fonctionnalités, AmtY a été surexprimée dans une souche d’E. coli manquant l’AmtB (GT1001 pRSG1) (réalisée précédemment par d'autres membres du laboratoire) et la formation des complexes AmtY-GlnK en réponse à l'addition d’ammoniac a été examinée. Il a été montré que même si AmtY est en mesure de transporter l'ammoniac lorsqu'il est exprimé dans E. coli, elle ne peut pass’ associer à GlnK en réponse à NH4 +.

Les prostanoïdes contrôlent la circulation placentaire : implication dans la prééclampsie

Au cours de la grossesse, une perfusion placentaire adéquate est indispensable au bon développement du fœtus. Dans certaines maladies comme la prééclampsie, celle-ci est altérée, compromettant ainsi la vie du fœtus, mais aussi celle de sa mère. Le retrait du placenta mène à la disparition des symptômes de la prééclampsie, suggérant un rôle central de ce dernier dans la maladie. Le placenta étant dépourvu d’innervation autonome, le tonus vasculaire placentaire doit être sous le contrôle de facteurs humoraux et tissulaires. Les vaisseaux placentaires sont très réactifs aux prostanoïdes. Le rapport thromboxane A2 (TXA2)/prostacycline (PGI2) est fortement augmenté dans les placentas de grossesses avec prééclampsie. De plus, le taux d’isoprostane, marqueur du stress oxydatif, est accru dans les placentas de femmes avec prééclampsie. Finalement, la prééclampsie s’accompagne d’un stress oxydatif placentaire marqué. Les espèces réactives de l’oxygène sont connues d’une part, pour oxyder l’acide arachidonique (AA), formant ainsi des isoprostanes et d’autre part, pour augmenter la production de TXA2 dans différents tissus, suite à l’activation des cyclooxygénases (COXs). Nous proposons que : 1. les prostanoïdes sont parmi les molécules endogènes qui contrôlent le tonus vasculaire placentaire. 2. la maladie modifie la réponse aux isoprostanes dans les vaisseaux placentaires. 3. l’induction d’un stress oxydatif placentaire entraîne une réponse vasoactive par activation de la voie du métabolisme de l’AA. Nous avons tout d’abord montré, dans des placentas obtenus de grossesses normotensives, que l’U-46619, un mimétique de la TXA2, de même que l’isoprostane, 8-iso-prostaglandine E2 (8-isoPGE2), ont augmenté fortement la pression de perfusion dans les cotylédons perfusés in vitro et la tension dans les anneaux d’artères chorioniques suspendus dans des bains à organe isolé. En revanche, dans les artères chorioniques de placentas obtenus de grossesses avec prééclampsie, ces réponses étaient modifiées puisque la réponse maximale à l’U-46619 était augmentée et celle à la 8-isoPGE2 diminuée. D’autre part, nous avons montré que les réponses maximales aux deux prostanoïdes étaient augmentées dans les vaisseaux placentaires de grossesse normale ou avec prééclampsie issus d’une délivrance prématurée par rapport à ceux d’une délivrance à terme. Ceci suggère une évolution de la réactivité des artères placentaires au cours du 3e trimestre de grossesse. En outre, les vaisseaux placentaires ont répondu aux prostanoïdes de façon semblable qu’ils aient été issus d’un accouchement vaginal ou d’une césarienne élective. Ceci indique que les prostanoïdes placentaires n’interviennent pas dans le processus de délivrance. D’un autre côté, l’utilisation de bloqueurs spécifiques des récepteurs TP à la TXA2, le SQ29,548 et l’ICI192,605, et des récepteurs EP à la prostaglandine E2, l’AH6809, nous ont permis de mettre en évidence le fait que l’U-46619 et la 8-isoPGE2 pouvaient agir de façon non-sélective sur l’un ou l’autre des récepteurs. Ces résultats supportent donc nos 2 premières hypothèses : les prostanoïdes font partie des molécules endogènes qui peuvent contrôler le tonus vasculaire placentaire et la prééclampsie modifie la réponse aux isoprostanes dans les artères chorioniques d’une manière compatible avec l’augmentation de la production de ces substances qui elle, est probablement le résultat du stress oxydatif. En revanche, en ce qui concerne les substances capables de jouer la contrepartie vasodilatatrice, l’utilisation d’un inhibiteur des synthases de monoxyde d’azote, le L-NAME, et celle d’inhibiteurs des COXs, l’ibuprofène, l’indométacine et le N-2PIA, ne nous a pas permis de mettre en évidence un quelconque rôle du monoxyde d’azote ou des prostanoïdes vasodilatatrices à ce niveau. Finalement, nous avons montré que l’induction d’un stress oxydatif dans les cotylédons perfusés in vitro et les artères chorioniques entraînait une vasoconstriction marquée. Celle-ci semble résulter de l’action des prostanoïdes puisqu’un blocage des récepteurs TP ou des COXs diminuait significativement la réponse maximale au peroxyde d’hydrogène. Les prostanoïdes impliquées dans la réponse au stress oxydatif proviendraient essentiellement d’une activation des COXs puisque l’étude ne nous permet pas de conclure à une quelconque implication des isoprostanes dans cette réponse. Ces observations confirment donc notre hypothèse que, dans le placenta, le stress oxydatif possède des propriétés vasoactives par activation du métabolisme de l’AA. En résumé, les résultats obtenus dans les placentas de grossesses normotensives et avec prééclampsie suggèrent que les prostanoïdes sont des molécules d’importance dans la régulation du tonus vasculaire placentaire. Le fait que la prééclampsie modifie la réponse aux prostanoïdes pourrait expliquer pourquoi la perfusion placentaire est altérée chez ces patientes. En outre, il apparaît évident qu’il existe un lien étroit entre le stress oxydatif et la voie de synthèse des prostanoïdes placentaires. Cependant d’autres études sont nécessaires pour mieux comprendre la nature de ce lien, qui pourrait, d’une certaine façon, jouer un rôle important dans le développement de la prééclampsie.

Activité des cellules souches : identification de nouveaux effecteurs dans le système hématopoïétique

Les cellules souches somatiques présentent habituellement un comportement très différent des cellules souches pluripotentes. Les bases moléculaires de l’auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires ont été récemment déchiffrées grâce à la facilité avec laquelle nous pouvons maintenant les purifier et les maintenir en culture durant de longues périodes de temps. Par contre, il en va tout autrement pour les cellules souches hématopoïétiques. Dans le but d’en apprendre davantage sur le fonctionnement moléculaire de l’auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques, j’ai d’abord conçu une nouvelle méthode de criblage gain-de-fonction qui répond aux caprices particuliers de ces cellules. Partant d’une liste de plus de 700 facteurs nucléaires et facteurs de division asymétrique candidats, j’ai identifié 24 nouveaux facteurs qui augmentent l’activité des cellules souches hématopoïétiques lorsqu’ils sont surexprimés. J’ai par la suite démontré que neuf de ces facteurs agissent de manière extrinsèque aux cellules souches hématopoïétiques, c’est-à-dire que l’effet provient des cellules nourricières modifiées en co-culture. J’ai également mis à jour un nouveau réseau de régulation de transcription qui implique cinq des facteurs identifiés, c’est-à-dire PRDM16, SPI1, KLF10, FOS et TFEC. Ce réseau ressemble étrangement à celui soutenant l’ostéoclastogénèse. Ces résultats soulèvent l’hypothèse selon laquelle les ostéoclastes pourraient aussi faire partie de la niche fonctionnelle des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse. De plus, j’ai identifié un second réseau de régulation impliquant SOX4, SMARCC1 et plusieurs facteurs identifiés précédemment dans le laboratoire, c’est-à-dire BMI1, MSI2 et KDM5B. D’autre part, plusieurs indices accumulés tendent à démontrer qu’il existe des différences fondamentales entre le fonctionnement des cellules souches hématopoïétiques murines et humaines.

Cell wall composition regulates cell shape and growth behaviour in pollen tubes

L’une des particularités fondamentales caractérisant les cellules végétales des cellules animales est la présence de la paroi cellulaire entourant le protoplaste. La paroi cellulaire joue un rôle primordial dans (1) la protection du protoplaste, (2) est impliquée dans les mécanismes de filtration et (3) est le lieu de maintes réactions biochimiques nécessaires à la régulation du métabolisme et des propriétés mécaniques de la cellule. Les propriétés locales d’élasticité, d’extensibilité, de plasticité et de dureté des composants pariétaux déterminent la géométrie et la forme des cellules lors des processus de différentiation et de morphogenèse. Le but de ma thèse est de comprendre les rôles que jouent les différents composants pariétaux dans le modelage de la géométrie et le contrôle de la croissance des cellules végétales. Pour atteindre cet objectif, le modèle cellulaire sur lequel je me suis basé est le tube pollinique ou gamétophyte mâle. Le tube pollinique est une protubérance cellulaire qui se forme à partir du grain de pollen à la suite de son contact avec le stigmate. Sa fonction est la livraison des cellules spermatiques à l’ovaire pour effectuer la double fécondation. Le tube pollinique est une cellule à croissance apicale, caractérisée par la simple composition de sa paroi et par sa vitesse de croissance qui est la plus rapide du règne végétal. Ces propriétés uniques font du tube pollinique le modèle idéal pour l’étude des effets à courts termes du stress sur la croissance et le métabolisme cellulaire ainsi que sur les propriétés mécaniques de la paroi. La paroi du tube pollinique est composée de trois composantes polysaccharidiques : pectines, cellulose et callose et d’une multitude de protéines. Pour comprendre les effets que jouent ces différents composants dans la régulation de la croissance du tube pollinique, j’ai étudié les effets de mutations, de traitements enzymatiques, de l’hyper-gravité et de la gravité omni-directionnelle sur la paroi du tube pollinique. En utilisant des méthodes de modélisation mathématiques combinées à de la biologie moléculaire et de la microscopie à fluorescence et électronique à haute résolution, j’ai montré que (1) la régulation de la chimie des pectines est primordiale pour le contrôle du taux de croissance et de la forme du tube et que (2) la cellulose détermine le diamètre du tube pollinique en partie sub-apicale. De plus, j’ai examiné le rôle d’un groupe d’enzymes digestives de pectines exprimées durant le développement du tube pollinique : les pectate lyases. J’ai montré que ces enzymes sont requises lors de l’initiation de la germination du pollen. J’ai notamment directement prouvé que les pectate lyases sont sécrétées par le tube pollinique dans le but de faciliter sa pénétration au travers du style.

Caractérisation de nouveaux mécanismes transcriptionnels impliqués dans la biologie osseuse

Le développement et l'homéostasie des os requièrent l'orchestration spatio-temporelle d'un grand nombre de signaux moléculaires. Ces signaux entraînent l'activation ou l'inhibition de différents facteurs de transcription, lesquels sont en mesure de contrôler la prolifération et la différenciation des ostéoblastes et des chondrocytes. L'intégrité de ces différents mécanismes se doit d'être maintenu tout au long de la vie. Ainsi, une anomalie dans l'un de ces mécanismes conduit à l'apparition de pathologies osseuses et métaboliques telles qu’une hypophosphatémie, l'ostéoporose ou l'ostéoarthrite (OA). Afin d'en apprendre davantage sur la biologie osseuse, le projet décrit dans cette thèse a pour objectif de caractériser de nouveaux mécanismes de régulation transcriptionnelle pour deux gènes importants dans le développement des os et le maintien de leur intégrité. Il s’agit du Paired-like Homeodomain Transcription Factor 1 (PITX1) et du Phosphate-regulating gene with homology to endopeptidase on the X chromosome (PHEX). Le premier mécanisme présenté dans cette thèse concerne la régulation transcriptionnelle du gène PITX1, un facteur de transcription à homéodomaine nécessaire, notamment, au développement des os des membres inférieurs et au maintien de l'intégrité du cartilage articulaire chez l'adulte. Ainsi, dans les chondrocytes articulaires, on note que l'expression de PITX1 est assurée par le recrutement du facteur de transcription E2F1 à deux éléments de réponse présents dans la région proximale du promoteur de PITX1. Aussi, dans les chondrocytes articulaires de patients souffrant d'OA, dans lesquels l'expression de PITX1 est fortement diminuée, un mécanisme de répression transcriptionnelle, lequel implique la protéine multifonctionnelle Prohibitin (PHB1), semble être activé. En effet, dans ces chondroytes, on note une forte accumulation nucléaire de PHB1 comparativement aux chondrocytes articulaires de sujets sains. Le second mécanisme présenté dans cette thèse concerne la répression transcriptionnelle de PHEX, la peptidase mutée dans le syndrome d'hypophosphatémie lié au chromosome X (X-Linked Hypophosphatemia, XLH), lequel se caractérise par une hypophosphatémie et une ostéomalacie. Le traitement d'ostéoblastes à la Parathyroid hormone-related protein (PTHrP) permet d’observer la répression de PHEX. Afin de caractériser le mécanisme responsable de cette répression, des expériences de gènes rapporteurs ont révélé la présence de deux éléments de réponse pour le répresseur transcriptionnel E4BP4 dans le promoteur de PHEX. La suppression de l'expression d'E4BP4 par l'utilisation d'ARN d'interférence a permis de valider que ce facteur de transcription est responsable de la répression de PHEX suite au traitement d'ostéoblastes à la PTHrP. En somme ces nouveaux mécanismes de régulation transcriptionnelle permettent de mieux comprendre la régulation de l'expression de PITX1 et de PHEX. Aussi, cette nouvelle implication de PHB1 dans la pathogenèse de l'OA offre de nouvelles possibilités de traitement et pourrait servir pour le diagnostic précoce de cette pathologie. Enfin, la caractérisation d'E4BP4 en tant que médiateur pour la répression de PHEX par la PTHrP suggère que ce répresseur transcriptionnel pourrait être impliqué dans le contrôle de la minéralisation des os et des niveaux de phosphate sanguin.

Role of CD4+ T cells in the regulation of the immune response against encapsulated Group B Streptococcus

Le Streptocoque de groupe B (GBS) est un important agent d’infection invasive pouvant mener à la mort et demeure la cause principale de septicémie néonatale à ce jour. Neuf sérotypes ont été officiellement décrits basés sur la composition de la capsule polysaccharidique (CPS). Parmi ces sérotypes, le type III est considéré le plus virulent et fréquemment associé aux maladies invasives graves, telle que la méningite. Malgré que plusieurs recherches aient été effectuées au niveau des interactions entre GBS type III et les cellules du système immunitaire innées, aucune information n’est disponible sur la régulation de la réponse immunitaire adaptative dirigée contre ce dernier. Notamment, le rôle de cellules T CD4+ dans l’immuno-pathogenèse de l’infection causée par GBS n’a jamais été étudié. Dans cet étude, trois différents modèles murins d’infection ont été développé pour évaluer l’activation et la modulation des cellules T CD4+ répondantes au GBS de type III : ex vivo, in vivo, et in vitro. Les résultats d’infections ex vivo démontrent que les splénocytes totaux répondent à l’infection en produisant des cytokines de type-1 pro-inflammatoires. Une forte production d’IL-10 accompagne cette cascade inflammatoire, probablement dans l’effort de l’hôte de maintenir l’homéostasie. Les résultats démontrent aussi que les cellules T sont activement recrutées par les cellules répondantes du système inné en produisant des facteurs chimiotactiques, tels que CXCL9, CXCL10, et CCL3. Plus spécifiquement, les résultats obtenus à partir des cellules isolées T CD4+ provenant des infections ex vivo ou in vivo démontrent que ces cellules participent à la production d’IFN-γ et de TNF-α ainsi que d’IL-2, suggérant un profil d’activation Th1. Les cellules isolées T CD4+ n’étaient pas des contributeurs majeurs d’IL-10. Ceci indique que cette cytokine immuno-régulatrice est principalement produite par les cellules de l’immunité innée de la rate de souris infectées. Le profil Th1 des cellules T CD4+ a été confirmé en utilisant un modèle in vitro. Nos résultats démontrent aussi que la CPS de GBS a une role immuno-modulateur dans le développement de la réponse Th1. En résumé, cette étude adresse pour la première fois, la contribution des cellules T CD4+ dans la production d’IFN-γ lors d’une infection à GBS et donc, dans le développement d’une réponse de type Th1. Ces résultats renforcent d’avantage le rôle central de cette cytokine pour un control efficace des infections causées par ce pathogène.

La dynamique chromatinienne induite par le pic de LH dans les cellules de granulosa chez la souris

La régulation transcriptionnelle des gènes est un processus indispensable sans lequel la diversité phénotypique des cellules ainsi que l’adaptation à leur environnement serait inexistant. L’identification des éléments de régulation dans le génome est d’une importance capitale afin de comprendre les mécanismes gouvernant l’expression des gènes spécifiques à un type cellulaire donné. Ainsi, suite au pic de LH, le follicule ovarien entre dans un programme intensif de différentiation cellulaire, orchestré par des modifications majeures du profile transcriptionnel des cellules de granulosa, déclenchant ultimement l’ovulation et la lutéinisation, processus indispensables à la fertilité femelle. L’hypothèse supportée par cette étude stipule qu’une réorganisation de la structure chromatinienne survient aux régions régulatrices d’une panoplie de gènes dans les heures suivant le pic de LH et qu’en isolant et identifiant ces régions, il serait possible de retrouver des éléments essentiels aux processus d’ovulation et de lutéinisation. Ainsi, en utilisant un protocole standard de superovulation chez la souris, les éléments de régulation se modifiant 4h suivant l’administration de hCG ont été isolés et identifiés dans les cellules de granulosa en utilisant la méthode FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) combinée à un séquençage haut débit. Cette étude a démontré que suite au stimulus ovulatoire, les cellules de granulosa subissent une reprogrammation majeure des éléments de régulation, qui est corrélée avec une modification drastique de leurs fonctions biologiques. De plus, cette étude a mis en évidence une association majoritaire des éléments de régulation à des régions intergéniques distales et à des introns, indiquant que ces régions ont une importance capitale dans la régulation transcriptionnelle dans les cellules de granulosa. Cette étude a également permis d’identifier une panoplie de régulateurs transcriptionnels reconnus pour être essentiels à la fonction ovarienne, ainsi que leur sites de liaison dans le génome, démontrant que la méthode FAIRE est une méthode assez puissante pour permettre la prédiction d’événements moléculaires précis ayant un sens physiologique réel.

The role of ubiquitination and deubiquitination in the regulation of BRCA1 function during genotoxic stress

BRCA1 est un suppresseur de tumeur majeur jouant un rôle dans la transcription, la réparation de l’ADN et le maintien de la stabilité génomique. En effet, des mutations dans le gène BRCA1 augmentent considerablement le risque de cancers du sein et de l’ovaire. BRCA1 a été en majorité caractérisé pour son rôle dans la réparation de l’ADN par la voie de recombinaison homologue (HR) en présence de bris double brins, par example, induits par l’irradiation gamma (IR). Cependant, la fonction de BRCA1 dans d’autres voies de réparation de l’ADN, comme la réparation par excision de nucléotides (NER) ou par excision de base (BER), demeurent toutefois obscures. Il est donc important de comprendre la régulation de BRCA1 en présence d’agents génotoxiques comme le méthyle méthanesulfonate (MMS) ou l’UV, qui promouvoient le BER et le NER respectivement. Nos observations suggèrent que BRCA1 est dégradée par le protéasome après traitement avec le MMS ou les UV, et non avec l’IR. Par ailleurs, cette dégradation semble compromettre le recrutement de Rad51, suggérant que la voie de HR est inhibée. Nos résultats suggèrent que la HR est inhibée afin d’éviter l’activation simultanée de multiples voies de réparation. Nous avons aussi observé que la dégradation BRCA1 est réversible et que la restauration des niveaux de BRCA1 coïncide avec le recrutement de Rad51 aux sites de dommages. Cela suggère que la HR est réactivée tardivement par les bris double brins générés suite à l’effondrement des fourches de réplication. Ayant observé que BRCA1 est hautement régulé par l’ubiquitination et est ciblé par le protéasome pour dégradation, nous avons émis une hypothèse que BRCA1 est régulé par des déubiquitinases. Cela amène à caractériser plus en profondeur par un criblage en déplétant les déubiquitinases individuellement par RNAi et en observant leur effet sur le recrutement de BRCA1 et des protéines reliées à cette voie. Un criblage préliminaire nous a permi d’identifié candidats potentiels tel que BAP1, CXORF53, DUB3, OTUB1 et USP36.

Rôle de l’axe CD40L/CD40 dans les cellules endothéliales progénitrices

Les cellules endothéliales progénitrices («Endothelial Progenitor Cells», EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui possèdent un potentiel considérable dans la réparation et la régénération vasculaire. Dans le contexte des maladies cardiovasculaires, la compréhension du rôle des EPCs dans la régulation de la thrombogenèse et la réparation endothéliale est pertinente et nécessaire pour comprendre leur potentiel thérapeutique. Nous avons rapporté que les EPCs interagissent avec les plaquettes via la P-sélectine et inhibent l’adhésion, l’activation et l’agrégation des plaquettes ainsi que la formation de thrombus. Plus récemment, nous avons démontré que les EPCs expriment le récepteur inflammatoire CD40 et il est bien connu que les plaquettes constituent la source principale de la forme soluble de son agoniste le CD40L («soluble CD40 Ligand», sCD40L). Ainsi, nous avons émis l’hypothèse principale que l’axe CD40L/CD40 dans les EPCs influence leurs fonctions anti-thrombotique et pro-angiogénique. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons réussi à générer des «early» et «late» EPCs à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique («Peripheral Blood Mononuclear Cells», PBMCs) en culture. Nous avons mis en évidence l’existence de l’axe CD40L/CD40 dans ces EPCs en démontrant l’expression des protéines adaptatrices, nommées les facteurs associés au récepteur du facteur de nécrose tumorale («TNF Receptor Associated Factors», TRAFs). Dans une première étude, nous avons investigué l’effet du sCD40L sur la fonction des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. En effet, nous avons démontré que le sCD40L renverse leur effet inhibiteur sur l’agrégation plaquettaire, et ce sans avoir un effet significatif sur la sécrétion de prostacycline (PGI2) et d’oxyde nitrique («Nitric Oxide», NO) par ces cellules. De plus, aucun effet du sCD40L n’a été noté sur l’apoptose et la viabilité de ces cellules. Par contre, nous avons noté une augmentation importante du stress oxydatif dans les «early» EPCs suite à leur stimulation avec le sCD40L. L’inhibition du stress oxydatif renverse l’effet du sCD40L sur les «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. Ces résultats pourraient expliquer, en partie, la fonction réduite des EPCs chez les individus présentant des niveaux élevés de sCD40L en circulation. Dans une deuxième étude, nous avons étudié l’effet de sCD40L dans la fonction des «early» EPCs en relation avec l’angiogenèse. Nous avons identifié, dans un premier temps,les métalloprotéinases de la matrice («Matrix Metalloproteinases», MMPs) qui sont sécrétées par ces cellules. Nous avons trouvé que les «early» EPCs relâchent principalement la MMP-9 et que cette relâche est augmentée par le sCD40L. Le sCD40L induit aussi la phosphorylation de la p38 MAPK qui contribue à augmenter la sécrétion de MMP-9. Des études fonctionnelles ont démontré que le prétraitement des «early» EPCs au sCD40L potentialise la réparation endothéliale des HUVECs. En conclusion, l’ensemble de nos travaux, dans le cadre de ce projet de doctorat, nous a permis d’élucider les mécanismes responsables de l’action du sCD40L sur les effets inhibiteur et angiogénique des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire et l’angiogenèse, respectivement. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur le rôle des EPCs et pourront constituer la base pour des études futures permettant de corréler les niveaux élevés du sCD40L circulant et l’incidence des maladies cardiovasculaires, particulièrement l’athérothrombose.