790 resultados para signalisation cellulaire
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Le marquage protique par fluorescence est une mthode de choix permettant dtudier lvolution des protines depuis leur synthse cellulaire jusqu leur dgradation, en plus de rendre possible leur localisation ainsi que la visualisation des interactions entre protines. De cet intrt certain ont dcoul diffrentes techniques de marquage, dont celle prsentement dveloppe dans le groupe Keillor. Le principe de celle-ci repose sur la raction entre deux malimides ports par un fluorogne et une squence peptidique cible, laquelle contient deux rsidus cystines spars par une distance approprie. Suite cette double addition de thiols du peptide sur les malimides du fluorogne, la fluorescence latente de ce dernier est rgnre, menant au marquage covalent de la protine dintrt. Afin doptimiser la spcificit et la sensibilit de cette mthode de marquage, la synthse de nouveaux fluorognes et ltude de lefficacit de quench de la fluorescence par les malimides est prsentement en cours dans les laboratoires du groupe Keillor.
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La divison cellulaire asymtrique est un processus essentiel qui permet aux cellules souches de sauto-renouveller et de produire une cellule fille destine la diffrenciation. La ligne germinale de C. elegans, totipotente et immortelle, est une ligne de cellules souches qui contient des organites ribonucloprotiques appels granules P. Au cours du dveloppement ces derniers sont toujours localiss spcifiquement dans les cellules prcurseurs de la ligne germinals, suggrant quils sont des dterminants de la ligne germinale. De faon intressante, des granules ribonucloprotiques, comme les P bodies impliqus dans le contrle post-transcriptionnel, ont t observs chez tous les organismes. Nanmoins, la fonction prcise des granules P de C. elegans est inconnue. Rcemment, notre laboratoire a montr que NHL-2, un homologue de Mei-P26 de Drosophile, colocalise avec les granules P dans des embryons prcoces et joue un rle dans la division cellulaire asymtrique et dans la polarit cellulaire. Tous les granules P contiennent NHL- 2, ce qui nous a men poser lhypothse que NHL-2 rgule la biogense et la fonction des granules P. Nous avons test cette hypothse par imagerie et quantification de l'intensit de PGL-1, un composant essentiel des granules P, dans des embryons fixs. Nos rsultats montrent que dans des embryons mutants pour nhl-2 il y a une rduction du nombre de granules P, de l'intensit de fluorescence moyenne (IFM) et de l'intensit de fluorescence total (IFT) de PGL-1. Une analyse plus pousse a montr qu'il existe deux populations distinctes dembryons mutants pour nhl-2 : lune prsente une intensit de PGL-1 comparable celle dune population sauvage alors que le second groupe prsente une forte rduction des quantits de PGL-1 et est comparable des mutants pour pgl-1. Cette variabilit est aussi observe dans le phnotype de strilit de nhl-2 mutant des tempratures leves. Globalement, nos rsultats suggrent que la perte de fonction de NHL-2 perturbe la prolifration des cellules germinales ainsi que la formation et/ou la stabilit des granules P au cours des tapes prcoces du dveloppement des prcurseurs de la ligne germinals. Dautre part, ils suggrent que la fonction de NHL-2 pourrait tre partiellement redondants avec les autres rgulateurs de la stabilit des granules P. Mots-cls : Granules P, NHL-2, Cellules germinals.
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La Fibrose Kystique (FK) est une maladie dgnrative qui entraine une dgnration des poumons d au problme de clairance mucociliaire (CMC). Le volume de surface liquide (SL) couvrant les cellules pulmonaires est essentiel la clairance de mucus et au combat contre les infections. Les nuclotides extracellulaires jouent un rle important dans la CMC des voies ariennes, en modifiant le volume de la SL pulmonaire. Cependant, les mcanismes du relchement de lATP et de leurs dplacements travers la SL, restent inconnus. Des tudes ultrieures dmontrent que lexocytose dATP mcano-sensible et Ca2+-dpendant, dans les cellules A549, est amplifi par les actions synergtiques autocrine/paracrine des cellules avoisinantes. Nous avions comme but de confirmer la prsence de la boucle purinergique dans plusieurs modles de cellules pithliales et de dvelopper un systme nous permettant dobserver directement la SL. Nous avons dmontrs que la boucle purinergique est fonctionnelle dans les modles de cellules pithliales examins, mis appart les cellules Calu-3. Lutilisation de modulateur de la signalisation purinergique nous a permis dobserver que le relchement dATP ainsi que laugmentation du [Ca2+]i suivant un stress hypotonique, sont moduls par le biais de cette boucle purinergique et des rcepteurs P2Y. De plus, nous avons dvelopp un systme de microscopie qui permet dobserver les changements de volume de SL en temps rel. Notre systme permet de contrler la temprature et lhumidit de lenvironnement o se trouvent les cellules, reproduisant lenvironnement pulmonaire humain. Nous avons dmontr que notre systme peut identifier mme les petits changements de volume de SL.
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Le virus herps simplex de type 1 (HSV 1) affecte la majorit de la population mondiale. HSV 1 cause de multiples symptmes dltres dont les plus communs sont les lsions orofaciales usuellement appeles feux sauvages. Le virus peut aussi causer des effets plus srieux comme la ccit ou des troubles neurologiques. Le virus rside de faon permanente dans le corps de son hte. Malgr lexistence de nombreux traitements pour attnuer les symptmes causs par HSV 1, aucun mdicament ne peut liminer le virus. Dans le but damliorer les connaissances concernant le cycle viral de HSV 1, ce projet cible ltude du transport du virus dans la cellule hte. Ce projet aura permis la collecte dinformations concernant le modus operandi de HSV 1 pour sortir des compartiments cellulaires o il sjourne. Les diffrentes exprimentations ont permis de publier 3 articles dont un article qui a t choisi parmi les meilleurs papiers par les diteurs de Journal of Virology ainsi quun 4e article qui a t soumis. Premirement, un essai in vitro reproduisant la sortie de HSV 1 du noyau a t mis sur pied, via lisolation de noyaux issus de cellules infectes. Nous avons dmontr que tout comme dans les cellules entires, les capsides svadent des noyaux isols dans lessai in vitro en bourgeonnant avec la membrane nuclaire interne, puis en saccumulant sous forme de capsides enveloppes entre les deux membranes nuclaires pour finalement tre relches dans le cytoplasme exclusivement sous une forme non enveloppe. Ces observations appuient le modle de transport de d-enveloppement/r-enveloppement. Deuximement, dans le but didentifier des joueurs clefs viraux impliqus dans la sortie nuclaire du virus, les protines virales associes aux capsides relches par le noyau ont t examines. La morphologie multicouche du virus HSV 1 comprend un gnome dADN, une capside, le tgument et une enveloppe. Le tgument est un ensemble de protines virales qui sont ajoutes squentiellement sur la particule virale. La squence dajout des tguments de mme que les sites intracellulaires o a lieu la tgumentation sont lobjet dintenses recherches. Lessai in vitro a t utilis pour tudier cette tgumentation. Les donnes recueillies suggrent un processus squentiel qui implique lacquisition des protines UL36, UL37, ICP0, ICP8, UL41, UL42, US3 et possiblement ICP4 sur les capsides relches par le noyau. Troisimement, pour obtenir davantage dinformations concernant la sortie de HSV 1 des compartiments membranaires de la cellule hte, la sortie de HSV 1 du rseau trans golgien (TGN) a aussi t tudie. Ltude a rvl limplication de la protine kinase D cellulaire (PKD) dans le transport post-TGN de HSV 1. PKD est connue pour rguler le transport de petits cargos et son implication dans le transport de HSV 1 met en lumire lutilisation dune machinerie commune pour le transport des petits et gros cargos en aval du TGN. Le TGN nest donc pas seulement une station de triage, mais est aussi un point de rencontre pour diffrentes voies de transport intracellulaire. Tous ces rsultats contribuent une meilleure comprhension du processus complexe de maturation du virus HSV 1, ce qui pourrait mener au dveloppement de meilleurs traitements pour combattre le virus. Les donnes amasses concernant le virus HSV 1 pourraient aussi tre appliques dautres virus. En plus de leur pertinence dans le domaine de la virologie, les dcouvertes issues de ce projet apportent galement de nouveaux dtails au niveau du transport intracellulaire.
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Le cancer pithlial de lovaire est le plus ltal des cancers gyncologiques. Les tumeurs de lovaire se divisent en diffrentes classes refltant ltendue de la maladie. Les tumeurs faible potentiel de malignit prsentent une survie relative 5 ans de 90%, alors que pour les tumeurs invasives, la survie 5 ans chute drastiquement 35-40%. Au laboratoire, nous avons prcdemment identifi la protine Ran, un membre de la superfamille des GTPases Ras, comme marqueur fortement exprim dans les cancers pithliaux de lovaire de haut grade et de haut stade dont la surexpression est associe un mauvais pronostic. Ran est dj connue pour contribuer au transport nuclocytoplasmique et la progression du cycle cellulaire, mais son rle dans le cancer ovarien nest pas bien dfini. En utilisant une approche de shRNA inductibles la ttracycline base sur les lentivirus, nous avons montr que la diminution de lexpression de Ran dans des lignes cellulaires agressives du cancer de lovaire affecte drastiquement la prolifration cellulaire par linduction dune apoptose caspase-3 dpendante. Par un essai de tumeurs en xnogreffes, nous avons dmontr que la dpltion de Ran rsulte en une diminution de la tumorigense et que la formation ventuelle de tumeurs est associe une slection des cellules tumorales ayant la capacit de r-exprimer la protine Ran. Ces rsultats suggrent un rle critique pour Ran dans la survie et la tumorignicit des cellules du cancer ovarien, indiquant que Ran pourrait tre une cible thrapeutique intressante.
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La dissmination mtastatique est associe de faibles chances de survie dans les cas de mlanomes humains, comme pour dautres cancers. Le dveloppement de mtastases est un processus qui se fait en plusieurs tapes et ncessite la rorganisation du cytosquelette dactine pour permettre la migration et linvasion cellulaire. La protine Nck2 est un adaptateur protique principalement impliqu dans la rorganisation du cytosquelette. Une tude prliminaire ralise dans notre laboratoire avait rvl que les niveaux de la protine Nck2 et de son ARNm sont augments dans les lignes de mlanome mtastatiques en comparaison aux lignes primaires. Le but de la prsente recherche tait donc dtudier le rle de ladaptateur Nck2 dans la progression mtastatique. Les rsultats obtenus confirment que lexpression de Nck2 augmente de faon marque au cours de la progression mtastatique du mlanome humain. Cette tude rvle en plus que lexpression de hauts niveaux de Nck2 dans les cellules de mlanome primaire stimule la prolifration cellulaire et la migration, naffecte pas linvasion dune matrice de collagne de type I, mais semble affaiblir les contacts cellule-cellule et ladhsion au substrat. Une tude prliminaire effectue in vivo rvle que ces phnomnes se traduisent par une lgre augmentation de la tumorigense et de la croissance tumorale. Dans lensemble, les rsultats obtenus suggrent que Nck2 pourrait effectivement jouer un rle dans la progression mtastatique du mlanome en favorisant la prolifration des cellules tumorales et en facilitant leur dtachement de la tumeur primaire, les rendant plus aptes se disperser dans lorganisme et tablir des colonies mtastatiques. Au niveau molculaire, nous proposons que Nck2 est recrut dans les invadopodes pour favoriser la formation de complexes protiques qui stimulent linvasion. La mobilisation de Nck2 dans ces structures membranaires diminuerait sa disponibilit pour ltablissent dautres complexes protiques, entre autres dans les complexes dadhsion focaux (FAs) et dans les jonctions adhrentes, diminuant ainsi les contacts des cellules cancreuses avec la matrice extracellulaire et les cellules avoisinantes.
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Les tumeurs du cortex surrnalien sont varies et frquentes dans la population. Bien que des mutations aient t identifies dans certains syndromes familiaux, les causes gntiques menant la formation de tumeur du cortex surrnalien ne sont encore que peu connues. Un sous-type de ces tumeurs incluent les hyperplasies macronodulaires et sont pressenties comme la voie dentre de la tumorigense du cortex surrnalien. Lvnement gntique le plus frquemment observ dans ces tumeurs est lexpression aberrante dun ou plusieurs rcepteurs coupls aux protines G qui contrle la production de strodes ainsi que la prolifration cellulaire. Lvnement gntique menant lexpression aberrante de ces rcepteurs est encore inconnu. En utilisant le rcepteur au peptide insulinotropique dpendant du glucose (GIP) comme modle, cette tude se propose didentifier les mcanismes molculaires impliqus dans lexpression aberrante du rcepteur au GIP (GIPR) dans les tumeurs du cortex surrnalien. Une partie clinique de cette tude se penchera sur lidentification de nouveaux cas de tumeurs surrnaliennes exprimant le GIPR de faon aberrante. Les patients tudis seront soumis un protocole dinvestigation in vivo complet et les tumeurs prleves seront tudies extensivement in vitro par RT-PCR en temps rel, culture primaire des tumeurs, immunohistochimie et biopuces. Le lien entre le GIP et la physiologie normal sera galement tudie de cette faon. Une autre partie de ltude utilisera les nouvelles techniques dinvestigation grande chelle en identifiant le transcriptome de diffrents cas de tumeurs exprimant le GIPR de faon aberrante. Limportance fonctionnelle des gnes identifie par ces techniques sera confirme dans des modles cellulaires. Cette tude prsente pour la premire des cas de tumeurs productrices daldostrone prsentant des rponses aberrantes, auparavant confines aux tumeurs productrice de cortisol ou dandrognes surrnaliens. Le cas probant prsent avait une production daldostrone sensible au GIP, le GIPR tait surexprim au niveau de lARNm et un fort marquage a t identifi dans la tumeur spcifiquement. Dans les surrnales normales, cette tude dmontre que le GIP est impliqu dans le contrle de la production daldostrone. Ces rsultats ont t confirms in vitro. Finalement, le profilage grande chelle des niveaux dexpression de tous les gnes du gnome a permis disoler une liste de gnes spcifiquement lis la prsence du GIPR dans des hyperplasies du cortex surrnalien. Cette liste inclus la prilipine, une protine de stockage des lipides dans les adipocytes et la glande surrnale, dont lexpression est fortement rprime dans les cas GIP-dpendant. Des tudes dans un modle cellulaire dmontrent que la rpression de ce gne par siRNA est suffisante pour induire lexpression du rcepteur au GIP et que cette protine est implique dans la stimulation de la strodognse par le GIP. En alliant des mthodes dinvestigation in vivo de pointe des techniques in vitro avance, cette tude offre de nouveaux regards sur les liens entre le GIP et la physiologie de la glande surrnale, que ce soit dans des conditions normales ou pathologiques.
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Le contrle de la longueur des tlomres est une tape critique rgissant le potentiel rplicatif des cellules eucaryotes. A cause du problme de fin de rplication, les chromosomes raccourcissent chaque cycle de division. Ce raccourcissement se produit dans des squences particulires appeles tlomres. La longueur des tlomres est en relation directe avec les capacits prolifratives des cellules et est responsable de la limite de division de Hayflick. Cependant, dans certains types cellulaires et dans plus de 90% des cancers, la longueur des tlomres va tre maintenue par une enzyme spcialise appele tlomrase. Encore aujourdhui, comprendre la biognse de la tlomrase et savoir comment elle est rgule reste un lment cl dans la lutte contre le cancer. Depuis la dcouverte de cette enzyme en 1985, de nombreux facteurs impliqus dans sa maturation ont t identifis. Cependant, comment ces facteurs sont intgrs dans le temps et dans lespace, afin de produire une forme active de la tlomrase, est une question reste sans rponse. Dans ce projet, nous avons utilis la levure Saccharomyces cerevisi comme modle dtude des voies de biognse et de trafic intracellulaire de lARN de la tlomrase, en condition endogne. La premire tape de mon travail fut didentifier les facteurs requis pour lassemblage et la localisation de la tlomrase aux tlomres en utilisant des techniques dHybridation In Situ en Fluorescence (FISH). Nous avons pu montrer que la composante ARN de la tlomrase fait la navette entre le noyau et le cytoplasme, en condition endogne, dans les cellules sauvages. Nos travaux suggrent que ce trafic sert de contrle qualit puisquun dfaut dassemblage de la tlomrase conduit son accumulation cytoplasmique et prvient donc sa localisation aux tlomres. De plus, nous avons identifi les voies dimport/export nuclaire de cet ARN. Dans une deuxime approche, nous avons russi dvelopper une mthode de dtection des particules tlomrasiques in vivo en utilisant le systme MS2-GFP. Notre iv tude montre que contrairement ce qui a t prcdemment dcrit, la tlomrase nest pas associe de faon stable aux tlomres au cours du cycle cellulaire. En fin de phase S, au moment de la rplication des tlomres, la tlomrase se regroupe en 1 3 foci dont certains colocalisent avec les foci tlomriques, suggrant que nous visualisons la tlomrase active aux tlomres in vivo. La dltion des gnes impliqus dans lactivation et le recrutement de la tlomrase aux tlomres entraine une forte baisse dans laccumulation des foci dARN au sein de la population cellulaire. Nos rsultats montrent donc pour la premire fois la localisation endogne de lARN TLC1 in situ et in vivo et propose une vue intgre de la biogense et du recrutement de la tlomrase aux tlomres.
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Linfection primaire au VZV et la ractivation du VZV latent sont frquemment observes la suite dune GMO ou dune GSCO, ce qui cause de srieuses complications chez le patient. Pour prvenir ces infections, une prophylaxie antivirale est administre systmatiquement chez tous les greffs de MO ou de SCO, alors quil nexiste aucun consensus sur la dure optimale dune telle prophylaxie. Pour rsoudre ce problme, notre objectif est de dvelopper et valider une mthode ELISpot-VZV-IFN- qui permettra de suivre la reconstitution de limmunit mdiation cellulaire anti-VZV chez les receveurs de GMO ou de GSCO et ainsi dterminer le moment opportun pour rduire ou interrompe la prophylaxie chez les receveurs de greffes de CSH. Dans un premier temps, des valeurs-seuil de la rponse mdiation cellulaire anti-VZV chez la population pdiatrique saine ont d tre gnres. la lumire de nos rsultats, un enfant avec un rsultat ELISpot-VZV-IFN- > 190.0 SFU/106 PBMC devrait tre protg contre une possible infection VZV. Pour valider cette tude, une tude prospective de la reconstitution immunitaire anti-VZV a t effectue chez 9 enfants greffs de MO ou de SCO. Nos rsultats prliminaires ont montr quil ny avait eu aucune reconstitution significative de limmunit mdiation cellulaire anti-VZV dans les 18 premiers mois post-transplantation chez 8 de ces 9 enfants. Les rsultats de ces expriences vont fournir dimportantes informations quant la reconstitution de limmunit anti-VZV la suite dune GMO ou dune GSCO et pourraient permettre lamlioration des soins apports aux receveurs de GMO ou de GSCO.
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La prclampsie est la premire cause de mortalit et de morbidit prinatale et aucun traitement, mis part laccouchement, nest connu ce jour. Pour mieux comprendre cette maladie, nous avons utilis trois modles animaux. Dans un premier temps, nous avons voulu confirmer la prsence de prclampsie chez les souris dficientes en p57kip2, une protine implique dans le cycle cellulaire des trophoblastes. Contrairement au groupe japonais, lhypertension et la protinurie au cours de la gestation ne survenaient pas, malgr une perte de structure des trophoblastes dans le labyrinthe ainsi quune microcalcification au niveau de leurs placentas. Nous avons alors observ que la dite japonaise induisait elle seule une diminution de la croissance ftale, ainsi quune dysfonction endothliale chez ces souris. Nos rsultats dmontrent que ni les altrations placentaires, ni la gntique ne sont suffisantes pour induire les symptmes de la prclampsie dans ce modle, et que la dite peut avoir des effets dltres chez la souris gestante peu importe le gnotype. Ensuite, nous avons dmontr que les souris hypertendues surexprimant la rnine et langiotensinogne humaine dveloppent de la protinurie et une augmentation de la pression artrielle au cours de la gestation. Leurs placentas sont affects par de la ncrose et une perte de structure des trophoblastes du labyrinthe en plus de surexprimer le gne du rcepteur sFlt-1. Ces souris reprsentent le premier modle animal de prclampsie superpose de lhypertension chronique. Finalement, en utilisant des femelles normotendues surexprimant langiotensinogne humaine qui dveloppent les symptmes de la prclampsie lorsquelles sont accouples des mles qui surexpriment la rnine humaine, nous avons tabli que lentranement physique normalisait la hausse de pression ainsi que lapparition de protinurie en fin de gestation. Aussi, l'entranement amliorait la croissance ftale et placentaire ainsi que la rponse vasculaire indpendante de lendothlium, et ce, indpendamment du gnotype des souris. La prsence dune prolifration exagre et dsorganise des trophoblastes dans ce modle tait aussi normalise. Lentranement physique prvient donc lapparition des symptmes de la prclampsie dans ce modle. Mis ensemble, nos rsultats aideront mieux comprendre les mcanismes lorigine de la prclampsie et de sa prvention.
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Les R-loops gnrs durant la transcription sont impliqus dans de nombreuse fonctions incluant la rplication, la recombinaison et lexpression gnique tant chez les procaryotes que chez les eucaryotes. Plusieurs tudes ont montr quun excs de supertours ngatifs et des squences riches en bases G induisent la formation de R-loops. Jusqu maintenant, nos rsultats nous ont permis dtablir un lien direct entre les topoisomrases, le niveau de surenroulement et la formation de R-loops. Cependant, le rle physiologique des R-loops est encore largement inconnu. Dans le premier article, une tude dtaille du double mutant topA rnhA a montr quune dpltion de RNase HI induit une rponse cellulaire qui empche la gyrase dintroduire des supertours. Il sagit ici, de la plus forte vidence supportant les rles majeurs de la RNase HI dans la rgulation du surenroulement de lADN. Nos rsultats ont galement montr que les R-loops pouvaient inhiber lexpression gnique. Cependant, les mcanismes exacts sont encore mal connus. Laccumulation dARNs courts au dtriment dARNs pleine longueur peut tre cause soit par des blocages durant llongation de la transcription soit par la dgradation des ARNs pleine longueur. Dans le deuxime article, nous montrons que lhypersurenroulement ngatif peut mener la formation de R-loops non-spcifiques (indpendants de la squence nuclotidique). La prsence de ces derniers, engendre une dgradation massive des ARNs et ultimement la formation de protines tronques. En conclusion, ces tudes montrent lvidence dun lien troit entre la RNase HI, la formation des R-loops, la topologie de lADN et lexpression gnique. De plus, elles attestent de la prsence dun nouvel inhibiteur de gyrase ou dun mcanisme encore inconnu capable de rguler son activit. Cette surprenante dcouverte est lmentaire sachant que de nombreux antibiotiques ciblent la gyrase. Finalement, ces tudes pourront servir galement de base des recherches similaires chez les cellules eucaryotes.
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Le transport et la localisation des ARN messagers permettent de rguler lexpression spatiale et temporelle de facteurs spcifiques impliqus dans la dtermination du destin cellulaire, la plasticit synaptique, la polarit cellulaire et la division asymtrique des cellules. Chez S.cerevisi, plus de trente transcrits sont transports activement vers le bourgeon cellulaire. Parmi ces transcrits, lARNm ASH1 (asymetric synthesis of HO) est localis lextrmit du bourgeon pendant lanaphase. Ce processus va entrainer une localisation asymtrique de la protine Ash1p, qui sera importe uniquement dans le noyau de la cellule fille, o elle entraine le changement de type sexuel. La localisation asymtrique de lARNm ASH1, et donc de Ash1p, implique la prsence de diffrents facteurs de localisation. Parmi ces facteurs, les protines She (She1p/Myo4p, She2p et She3p) et les rpresseurs traductionnels (Puf6p, Loc1p et Khd1p) participent ce mcanisme. La protine navette She2p est capable de lier lARNm ASH1 et va entrainer le ciblage de cet ARNm vers lextrmit du bourgeon en recrutant le complexe She3p-Myo4p. Des rpresseurs traductionnels rgulent la traduction de cet ARNm et vitent lexpression ectopique de la protine Ash1p pendant son transport. Alors que la fonction cytoplasmique de She2p sur la localisation des ARNm est connue, sa fonction nuclaire est encore inconnue. Nous avons montr que She2p contient une squence de localisation nuclaire non classique qui est essentielle son import nuclaire mdi par limportine (Srp1p). Lexclusion de She2p du noyau par mutation de son NLS empche la liaison de Loc1p et Puf6p sur lARNm ASH1, entrainant un dfaut de localisation de lARNm et de la protine. Pour tudier plus en dtail lassemblage de la machinerie de localisation des ARNm dans le noyau, nous avons utilis des techniques dimmunoprcipitation de chromatine afin de suivre le recrutement des facteurs de localisation et des rpresseurs traductionnels sur les ARNm naissants. Nous avons montr que She2p est recrut sur le gne ASH1 pendant sa transcription, via son interaction avec lARNm ASH1 naissant. Puf6p est galement recrut sur ASH1, mais dune manire dpendante de la prsence de She2p. De faon intressante, nous avons dtect une interaction entre She2p et la plus grande sous-unit de lARN polymrase II (Rpb1p). Cette interaction est dtecte avec la forme active en longation de lARN polymrase II. Nous avons galement dmontr que She2p interagit avec le complexe dlongation de la transcription Spt4p/Spt5p. Une dltion de SPT4 ou une mutation dans SPT5 (Ts spt5) temprature restrictive empche linteraction entre She2p et Rpb1p, et diminue le recrutement de She2p au gne ASH1, entrainant un dfaut de localisation de lARNm et un dfaut de localisation asymtrique de la protine Ash1p. De manire globale, nos rsultats montrent que les facteurs impliqus dans la localisation cytoplasmique des ARNm et dans leur contrle traductionnel sont recruts de faon co-transcriptionnelle sur les ARNm naissants via leur interaction avec la machinerie de transcription, suggrant un rle important de la machinerie transcriptionelle dans la localisation des ARNm.
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Le virus de limmunodficience humaine de type 1 (VIH-1), lagent tiologique du SIDA, est un rtrovirus complexe arborant plusieurs protines accessoires : Nef, Vif, Vpr, et Vpu. Celles-ci sont impliques dans la modulation de la rplication virale, dans lvasion immunitaire et dans la progression de la pathogense du SIDA. Dans ce contexte, il a t dmontr que la protine virale R (Vpr) induit un arrt de cycle cellulaire en phase G2. Le mcanisme par lequel Vpr exerce cette fonction est lactivation, ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related)-dpendante, du point de contrle de dommage lADN, mais les facteurs et mcanismes molculaires directement impliqus dans cette activit demeurent inconnus. Afin didentifier de nouveaux facteurs cellulaires interagissant avec Vpr, nous avons utilis une purification daffinit en tandem (TAP) pour isoler des complexes protiques natifs contenant Vpr. Nous avons dcouvert que Vpr sassociait avec CRL4A(VprBP), un complexe cellulaire dE3 ubiquitine ligase, comprenant les protines Cullin 4A, DDB1 (DNA damage-binding protein 1) et VprBP (Vpr-binding protein). Nos tudes ont mis en vidence que le recrutement de la E3 ligase par Vpr tait ncessaire mais non suffisant pour linduction de larrt de cycle cellulaire en G2, suggrant ainsi que des vnements additionnels seraient impliqus dans ce processus. cet gard, nous apportons des preuves directes que Vpr dtourne les fonctions de CRL4A(VprBP) pour induire la polyubiquitination de type K48 et la dgradation protosomale de protines cellulaires encore inconnues. Ces vnements dubiquitination induits par Vpr ont t dmontrs comme tant ncessaire lactivation dATR. Finalement, nous montrons que Vpr forme des foyers ancrs la chromatine co-localisant avec VprBP ainsi quavec des facteurs impliqus dans la rparation de lADN. La formation de ces foyers reprsente un vnement essentiel et prcoce dans linduction de larrt de cycle cellulaire en G2. Enfin, nous dmontrons que Vpr est capable de recruter CRL4A(VprBP) au niveau de la chromatine et nous apportons des preuves indiquant que le substrat inconnu cibl par Vpr est une protine associe la chromatine. Globalement, nos rsultats rvlent certains des mnanismes par lesquels Vpr induit des perturbations du cycle cellulaire. En outre, cette tude contribue notre comprhension de la modulation du systme ubiquitine-protasome par le VIH-1 et son implication fonctionnelle dans la manipulation de lenvironnement cellulaire de lhte.
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Le diabte maternel est un facteur de risque majeur pour le dveloppement de malformations congnitales. Dans le syndrome de lembryopathie diabtique, lexposition prolonge du ftus de hautes concentrations ambientes de glucose induit des dommages qui peuvent affecter plusieurs organes, dont les reins. Les malformations rnales sont la cause de prs de 40 pourcent des cas dinsuffisance rnale infantile. Lhyperglycmie constitue un environnement utrin adverse qui nuit la nphrogense et peut causer lagense, la dysplasie (aplasie) ou lhypoplasie rnale. Les mcanismes molculaires par lesquels les hautes concentrations ambientes de glucose mnent la dysmorphogense et aux malformations demeurent toutefois mal dfinis. Le diabte maternel prdispose aussi la progniture au dveloppement dautres problmes lge adulte, tels lhypertension, lobsit et le diabte de type 2. Ce phnomne appel programmation prinatale a suscit lintrt au cours des dernires dcennies, mais les mcanismes responsables demeurent mal compris. Mes tudes doctorales visaient lucider les mcanismes molculaires par lesquels le diabte maternel ou un environnement in utero hyperglycmique affecte la nphrogense et programme par la suite la progniture a dvelopper de lhypertension par des observations in vitro, ex vivo et in vivo. Nous avons utilis les cellules MK4, des cellules embryonnaires du msenchyme mtanphrique de souris, pour nos tudes in vitro et deux lignes de souris transgniques (Tg) pour nos tudes ex vivo et in vivo, soient les souris HoxB7-GFP-Tg et Nephrin-CFP-Tg. Les souris HoxB7-GFP-Tg expriment la protine fluorescente verte (GFP) dans le bourgeon urtrique (UB), sous le contrle du promoteur HoxB7. Les souris Nephrin-CFP expriment la protine fluorescente cyan (CFP) dans les glomrules, sous le contrle du promoteur nephrin spcifique aux podocytes. Nos tudes in vitro visaient dterminer si les hautes concentrations de glucose modulent lexpression du gne Pax2 dans les cellules MK4. Les cellules MK4 ont t traites pendant 24h avec du milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants ou inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK, PKC et NF-kB. Nos rsultats ont dmontr que le D-glucose lev (25mM) augmente la gnration des espces ractives de loxygne (ROS) dans les cellules MK4 et induit spcifiquement lexpression du gne Pax2. Des analogues du glucose tels le D-mannitol, L-glucose ou le 2-Deoxy-D-glucose ninduisent pas cette augmentation dans les cellules MK4. La stimulation de lexpression du gne Pax2 par le D-glucose dans les cellules MK4 peut tre bloque par des inhibiteurs des ROS et de NF-kB, mais pas par des inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK ou PKC. Ces rsultats indiquent que la stimulation de lexpression du gne Pax2 par les concentrations leves de glucose est due, au moins en partie, la gnration des ROS et lactivation de la voie de signalisation NF-kB, et non pas via les voies PKC, p38 MAPK et p44/42 MAPK. Nos tudes ex vivo sintressaient aux effets dun milieu hyperglycmique sur la morphogense de la ramification du bourgeon urtrique (UB). Des explants de reins embryonnaires (E12 E18) ont t prlevs par micro-dissection de femelles HoxB7-GFP gestantes. Les explants ont ensuite t cultivs dans un milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants, catalase ou inhibiteur de PI3K/AKT pour diverses dures. Nos rsultats ont dmontr que le D-glucose stimule la ramification du UB de manire spcifique, et ce via lexpression du gne Pax2. Cette augmentation de la ramification et de lexpression du gne Pax2 peut tre bloque par des inhibiteurs des ROS et de PI3K/AKT. Ces tudes ont dmontr que les hautes concentrations de glucose altrent la morphogense de la ramification du UB via lexpression de Pax2. Leffet stimulant du glucose semble seffectuer via la gnration des ROS et lactivation de la voie de signalisation Akt. Nos tudes in vivo visaient dterminer le rle fondamental du diabte maternel sur les dfauts de morphogense rnale chez la progniture. Dans notre modle animal, le diabte maternel est induit par le streptozotocin (STZ) chez des femelles HoxB7-GFP gestantes (E13). Les souriceaux ont t tudis diffrents ges (naissants et gs de une, deux ou trois semaines). Nous avons examin leurs morphologie rnale, nombre de nphrons, expression gnique et les vnements apoptotiques lors de cette tude court terme. La progniture des mres diabtiques avait un plus faible poids, taille et poids des reins, et possdait des glomrules plus petits et moins de nphrons par rapport la progniture des mres contrles. La dysmorphogense rnale observe est peut-tre cause par laugmentation de lapoptose des cellules dans la rgion du glomrule. Nos rsultats ont montr que les souriceaux ns de mres diabtiques possdent plus de podocytes apoptotiques et plus de marquage contre la caspase-3 active dans leurs tubules rnaux que la progniture des mres contrles. Les souriceaux des mres diabtiques montrent une augmentation de lexpression des composants du systme rnine angiotensine (RAS) intrarnal comme langiotensinogne et la rnine, ainsi quune augmentation des isoformes p50 et p65 de NF-kB. Ces rsultats indiquent que le diabte maternel active le RAS intrarnal et induit lapoptose des glomrules, menant une altration de la morphogense rnale de la progniture. En conclusion, nos tudes ont permis de dmontrer que le glucose lev ou lenvironnement in utero diabtique altre la morphogense du UB, qui rsulte en un retard dans la nphrogense et produit des reins plus petits. Cet effet est d, au moins en partie, la gnration des ROS, lactivation du RAS intrarnal et la voie NF-kB. Nos tudes futures se concentreront sur les mcanismes par lesquels le diabte maternel induit la programmation prinatale de lhypertension chez la progniture adulte. Cette tude long terme porte sur trois types de prognitures : adultes ns de mres contrles, diabtiques ou diabtiques traites avec insuline pendant la gestation. Nous observerons la pression systolique, la morphologie rnale et lexpression de divers gnes et protines. Nous voulons de plus dterminer si la prsence dun systme antioxydant (catalase) peut protger la progniture des effets nfastes des ROS causs par lenvironnement in utero hyperglycmique. Les souris Catalase-Tg expriment la catalase spcifiquement dans les tubules proximaux et nous permettrons dexplorer notre hypothse sur le rle des ROS dans notre modle exprimental de diabte maternel.
Resumo:
Lapoptose est une forme de mort cellulaire essentielle au dveloppement et au maintien de lhomostase chez les animaux multicellulaires. La machinerie apoptotiq ue requiert la participation des caspases, des protases conserves dans lvolution et celle des organelles cytoplasmiques. Les lysosomes subissent des ruptures partielles, labilisation de la membrane lysosomale (LML), qui entranent lactivation des cathepsines dans le cytoplasme de cellules cancreuses humaines en apoptose induite par la camptothecin (CPT), incluant les histiocytes humains U-937. Ces modifications lysosomales se manifestent tt durant lactivation de lapoptose, concomitamment avec la permabilisation de la mitochondrie et lactivation des caspases. Une tude protomique quantitative et comparative a permis didentifier des changements prcoces dans lexpression/localisation de protines lysosomales de cellules U-937 en apoptose. Lors de deux expriences indpendantes, sur plus de 538 protines lysosomales identifies et quantifies grce au marquage isobarique iTRAQ et LC-ESIMS/ MS, 18 protines augmentent et 9 diminuent dans les lysosomes purifis de cellules en cours dapoptose comparativement aux cellules contrles. Les candidats valids par immuno-buvardage et microscopie confocale incluent le strol-4-alpha-carboxylate 3- dhydrognase, le prosaposin et la protine kinase C delta (PKC-d). Des expriences fonctionnelles ont dmontres que la translocation de PKC-d aux lysosomes est requise pour la LML puisque la rduction de son expression par ARN interfrents ou linhibition de son activit laide du rottlerin empche la LML lors de lapoptose induite par la CPT. La translocation de PKC-d aux lysosomes conduit la phosphorylation et lactivation de la sphingomyelinase acide lysosomale (ASM), et laccroissement subsquent du contenu en cramide (CER) la membrane lysosomale. Cette accumulation de CER endogne aux lysosomes est un vnement critique pour la LML induite par la CPT car linhibition de lactivit de PKC-d ou de ASM diminue la formation de CER et la LML.Ces rsultats rvlent un nouveau mcanisme par lequel la PKC-d active lASM qui conduit son tour laccumulation de CER la membrane lysosomale et dclenche la LML et lactivation de la voie lysosomale de lapoptose induite par la CPT. En somme, ce mcanisme confirme limportance du mtabolisme des sphingolipides dans lactivation de la voie lysosomale de lapoptose.
