Expression et effets des WNTs sur l’expansion du cumulus et la maturation de l’ovocyte chez la vache

Les WNTs sont une famille de glycoprotéines qui, secrétées dans le milieu extracellulaire, jouent un rôle important dans l’embryogenèse. Chez l’adulte, leur dérégulation va entrainer diverses affections incluant des troubles du développement accompagnés ou non de malformations mais aussi des cancers. Au niveau de l’ovaire, le rôle des WNTs demeure peu défini même si des études chez l’humain et la souris prouvent l’implication de certains membres de cette famille dans le développement ovarien ainsi que dans les processus de maturation folliculaire et d’ovulation. Dans ce contexte, nous avons voulu évaluer l’expression de quelques membres de la famille des WNTs (-2, -2b, -4, -5a et -5b) durant l’expansion des cellules du cumulus et évaluer l’effet de certains d’entre eux sur le COC ainsi que la maturation de l’ovocyte chez la vache. Les COCs bovins étaient placés dans une solution de maturation in vitro pendant 0, 6, 12 et 22h et les niveaux d’ARNm mesurés par PCR en temps réel. L’abondance de l’ARNm pour WNT-2b était significativement plus élevée après 6h de maturation comparée aux COCs immatures (à 0h), alors que l’ARNm codant pour WNT-2, -4, -5a et -5b n’augmentait qu’en fin de culture. L’addition d’EGF provoquait l’expansion du COC et la progression de l’ovocyte vers la métaphase II (MII) comme nous l’espérions mais, à notre grande surprise, l’ajout de WNT-2b au milieu de maturation provoquait également l’expansion du COC (82% et 69% pour EGF et WNT-2b respectivement) et la progression de l’ovocyte vers le stade MII (62% et 56% EGF et WNT-2b respectivement). La combinaison d’EGF et WNT-2b n’a pas produit de meilleurs résultats. Notre étude met en lumière l’implication des WNTs dans la maturation du COC chez la vache. Leurs voies d’activation restent toutefois à déterminer.

Études génétiques moléculaires des gènes de la polarité planaire cellulaire dans les anomalies du tube neural chez l’Homme

Les anomalies du tube neural (ATN) sont des malformations congénitales parmi les plus fréquentes chez l’humain en touchant 1-2 nouveau-nés par 1000 naissances. Elles résultent d’un défaut de fermeture du tube neural pendant l’embryogenèse. Les formes les plus courantes d'ATN chez l'homme sont l'anencéphalie et le spina-bifida. Leur étiologie est complexe impliquant à la fois des facteurs environnementaux et des facteurs génétiques. Un dérèglement dans la signalisation Wnt, incluant la signalisation canonique Wnt/β-caténine et non-canonique de la polarité planaire cellulaire (PCP), peut causer respectivement le cancer ou les anomalies du tube neural (ATN). Les deux voies semblent s’antagoniser mutuellement. Dans cette étude, nous investiguons les rôles de Lrp6 et deANKRD6, entant qu’interrupteurs moléculaires entre les deux voies de signalisation Wnt, et CELSR1, en tant que membre de la PCP, chez la souris mutante Skax26m1Jus, générée par l’agent mutagène N-Ethyl-N-Nitrosuera, et dans une cohorte de patients humains ATN. Pour Lrp6, nous avons démontré que Skax26m1Jus représente un allèle hypermorphe de Lrp6 avec une augmentation de l’activité de la signalisation Wnt/canonique et une diminution de l’activité JNK induite par la voie PCP. Nous avons également montré que Lrp6Skax26m1Jus interagit génétiquement avec un mutant PCP (Vangl2Lp) où les doubles hétérozygotes ont montré une fréquence élevée d’ATN et des défauts dans la polarité des cellules ciliées de la cochlée. Particulièrement, notre étude démontre l'association des nouvelles et rares mutations faux-sens dans LRP6 avec les ATN humaines. Nous montrons que trois mutations de LRP6 causent une activité canonique réduite et non-canonique élevée. Pour ANKRD6, nous avons identifié quatre nouvelles et rares mutations faux-sens chez 0,8% des patients ATN et deux chez 1,3% des contrôles. Notamment, seulement deux, des six mutations validées (p.Pro548Leu et p.Arg632His) ont démontré un effet significatif sur l’activité de ANKRD6 selon un mode hypomorphique. Pour CELSR1, nous avons identifié une mutation non-sens dans l'exon 1 qui supprime la majeure partie de la protéine et une délétionde 12 pb. Cette perte de nucléotides ne change pas le cadre de lecture et élimine un motif putatif de phosphorylation par la PKC " SSR ". Nous avons également détecté un total de 13 nouveaux et rares variants faux-sens qui avaient été prédits comme étant pathogènes in silico. Nos données confirment le rôle inhibiteur de Lrp6 dans la signalisation PCP pendant la neurulation et indiquent aussi que les mutations faux-sens identifiées chez LRP6 et ANKRD6 pourraient affecter un équilibre réciproque et un antagonisme très sensible à un dosage précis entre les deux voies Wnt. Ces variants peuvent aussi agir comme facteurs prédisposants aux ATN. En outre, nos résultats impliquent aussi CELSR1 comme un facteur de risque pour les anomalies du tube neural ou l’agénésie caudale. Nos résultats fournissent des preuves supplémentaires que la voie de signalisation PCP a un rôle pathogène dans ces malformations congénitales et un outil important pour mieux comprendre leurs mécanismes moléculaires.

The inflammatory role of angiogenic growth factors : a neutrophil perspective

De par sa présence dans tous les vaisseaux sanguins, l'endothélium joue un rôle clef dans le processus d’hémostase, tant par sa libération de facteurs anticoagulants que par ses changements protéiques qui permettent à l’organisme de déclencher la réparation tissulaire. La fonction anticoagulante de l’endothélium peut être mise en défaut en cas d’atteinte de son intégrité, entrainant la formation de thrombus, le rejet précoce de greffes ou encore l’induction de l’athérosclérose. L’intégrité de l’endothélium est donc capitale pour la prévention de nombreuses maladies cardiovasculaires. Chez l’adulte, les cellules endothéliales (CE), normalement quiescentes, sont rapidement activées en cas d’hypoxie ou d’inflammation, leur permettant ainsi d’amorcer le processus angiogénique comme suit: Tout d’abord, l’induction de l’hyperperméabilité vasculaire permet l’extravasation des protéines plasmatiques. Ensuite, la dégradation de la lame basale par des métalloprotéases permet aux CE de se détacher, de proliférer, de migrer et de s’organiser pour former l’ébauche du futur vaisseau. La dernière étape consiste en la maturation du vaisseau, c’est-à-dire son recouvrement par des cellules murales, telles que les cellules musculaires lisses et les péricytes. Ces processus sont régulés par de nombreux facteurs angiogéniques tels que les membres de la famille Notch, du vascular endothelial growth factor (VEGF), du fibroblast growth factor (FGF), des angiopoïétines, et des matrix metalloproteases (MMP). L’angiogenèse pathologique, soit une insuffisance ou un excès de vascularisation, est impliquée dans les blessures chroniques, les accidents cardiovasculaires, les pathologies coronariennes artérielles, les pathologies tumorales, l’arthrite rhumatoïde, la rétinopathie diabétique, l’athérosclérose, le psoriasis et l’asthme. Ces pathologies sont souvent issues d’une dérégulation de l’activité endothéliale, fréquemment observée conjointement à l’expression continue de molécules d’adhésion leucocytaires, à l’augmentation de la perméabilité vasculaire, et aux anomalies de la vasoréactivité. L’activation non-contrôlée de l’endothélium entraîne ainsi une inflammation chronique et la formation de structures vasculaires anarchiques. Les premiers leucocytes à répondre à l’appel inflammatoire sont les neutrophiles. Equippées d’une panoplie de produits antibactériens puissants mais aussi nocifs pour les tissus qui les entourent, ces cellules polylobées participent à chaque étape du processus inflammatoire, depuis l’induction de l’hyperperméabilité vasculaire jusqu’à la résolution. En effet, grâce à leurs récepteurs, les neutrophiles détectent et interprètent les signaux biochimiques présents dans la circulation et à la surface de l’endothélium, et libèrent aussi leurs propres médiateurs tels le VEGF, les MMP, et l’interleukine-8 (IL-8), dont les effets sont à la fois paracrines et autocrines. Existent-ils d’autres modulateurs typiques de la fonction endothéliale capables d’influencer le comportement des neutrophiles? En effet, notre laboratoire a démontré que chez l’humain, une stimulation directe aux angiopoïétines incitait les neutrophiles à adhérer aux CE, à migrer, à synthétiser et à relâcher l’IL-8, voire même à vivre plus longtemps. La présence du récepteur des angiopoïétines, Tie2, à la surface des neutrophiles laisse présager que la famille possèderait d’autres fonctions leucocytaires encore non-identifiées. Par ailleurs, dans un modèle classique de l’angiogenèse in vivo (matrigel), nous avons observé que sous l’effet du FGF1 et 2, les ébauches des nouveaux vaisseaux étaient parfois accompagnées d’une infiltration de cellules granulocytaires. Ainsi, en partant de ces observations, l’objectif de nos études (présentées ci-après) était d’approfondir nos connaissances sur la relation entre neutrophiles et facteurs angiogéniques, notamment les FGF et les angiopoïétines. Par tests in vitro, nous avons confirmé que les neutrophiles humains exprimaient plusieurs récepteurs du FGF (FGFR1-4) d’une façon hétérogène, et qu’ils migraient vers un gradient des ligands FGF1 et 2. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés aux voies de signalisation inflammatoires activées par les ligands FGF1, FGF2, Ang1 et Ang2. Grâce à une stratégie génique ciblant 84 gènes inflammatoires, nous avons identifié plusieurs cibles d’intérêt touchées par Ang1, dont certains membres de la famille de l’IL-1, alors qu’aucun des gènes testés n’avait changé de façon significative sous l’effet des FGF ou d’Ang2. Suite à des cinétiques approfondies, nous avons démontré qu’Ang1 stimulait la transcription de l’ARN messager de l’IL-1β, et augmentait simultanément la quantité de protéine immature (pro-IL-1β; inactive) et clivée (IL-1β « mature »; active). En parallèle, Ang1 augmentait la sécrétion de l’antagoniste naturel de l’IL-1β, l’IL-1RA, sans pour autant stimuler la relâche de l’IL-1β. A l’instar des endotoxines bactériennes dont les effets liés à l’IL-1 dépendaient de la kinase p38, ceux d’Ang1 découlaient presque entièrement des voies de signalisation du p42/44.

Réduction d'expansion volumique au cours de la gestation : conséquence sur la circulation utéro-placentaire.

La grossesse est caractérisée par une augmentation du volume circulant maternel et du débit sanguin afin de subvenir aux besoins croissants du foetus. En diminuant l'expansion volumique maternelle, nous avons développé un modèle de restriction de croissance intra-utérine (RCIU) chez la rate dans lequel on observe une diminution du diamètre des artères utérines arquées ainsi qu'une diminution de la réponse à l'angiotensine II. Nous avons émis l'hypothèse que comparativement aux rates normales, les vaisseaux utérins des rates RCIU présentent une dysfonction des mécanismes de relaxation dépendant de l'endothélium lors de la réponse à des agents vasoactifs. Notre objectif était de caractériser l'influence de l'endothélium sur la régulation de la réactivité des artères utérines radiales dans notre modèle RCIU. À l'aide d'un myographe pressurisé, des courbes de concentration-réponse à des agents vasoactifs (Phényléphrine (Pe), Carbachol (Cbc) et Nitroprussiate de sodium (SNP)) ont été effectuées, en présence ou en absence d'inhibiteurs des voies principales de la relaxation dépendante de l'endothélium (monoxyde d'azote (NO), prostacycline (PGI2) et facteurs hyperpolarisants dépendant de l'endothélium (EDHF)). Nous avons ainsi démontré que les artères utérines radiales des rates RCIU ont un diamètre plus petit que celles des rates contrôles. Une utilisation plus grande du NO dans la réponse dilatatrice au Cbc a été observée chez les rates RCIU. De plus, l'inhibition de la voie de l'EDHF par l'ajout de KCl aux inhibiteurs de la voie du NO (L-NAME) et des PGI2 (Ibuprofène) bloque presque complètement la relaxation au Cbc chez les deux groupes. En conclusion, dans les artères utérines radiales des deux groupes, il y a une participation importante de l'EDHF lors de la dilatation au Cbc. De plus, dans notre modèle RCIU, la voie du NO est activée, probablement afin de compenser la diminution du diamètre des artères et la réduction de la perfusion utérine.

L’effet de la surexpression du récepteur de type 1 à l’angiotensine II sur les courants potassiques et calciques au niveau des oreillettes

Le système rénine-angiotensine est impliqué dans le remodelage structurel et électrique caractérisant la fibrillation auriculaire (FA). L’angiotensine II (ANG II) induit le développement de fibrose et d’hypertrophie au niveau des oreillettes, prédisposant à la FA. Or, les mécanismes électrophysiologiques par lesquels l’ANG II pourrait promouvoir la FA sont peu connus. L’objectif de ce projet de recherche est d’évaluer l’effet de l’ANG II sur les courants potassiques et calciques au niveau auriculaire indépendamment du remodelage structurel. Pour ce faire, nous avons utilisé la technique de patch-clamp avec un modèle de souris surexprimant le récepteur de type 1 à l’angiotensine II (AT1R) spécifiquement au niveau cardiaque. Pour distinguer les effets directs de la surexpression d’AT1R des effets induits par le remodelage cardiaque, nous avons étudié des souris âgées de 180 jours, qui présentent du remodelage structurel, et des souris âgées de 50 jours, qui n’en présentent pas. Des études précédentes sur ce modèle ont montré qu’au niveau des myocytes ventriculaires, l’ANG II réduit le courant potassique global (Ipeak) et rectifiant entrant (IK1) ainsi que le courant calcique de type L (ICaL). Ainsi, notre hypothèse est que l’ANG II modulera aussi ces courants au niveau auriculaire, pouvant ainsi augmenter l’hétérogénéité de repolarisation auriculaire et de ce fait le risque de développer et maintenir la FA. Nous avons observé une diminution significative de la densité d’IK1 dans l’oreillette gauche des souris transgéniques sans changement d’Ipeak. De plus, la densité d’ ICaL n’est pas réduite chez les souris transgéniques âgées de 50 jours. En conclusion, l’effet de l’ANG II sur les courants potassiques et calciques semble dépendre de la chambre cardiaque. En effet, nous savions que l’ANGII réduisait Ipeak, IK1 et ICaL au niveau ventriculaire, mais nos résultats ont montré qu’il ne les affectait pas directement au niveau des oreillettes. Ceci suggère des mécanismes de régulation impliquant des voies de signalisation distinctes selon les chambres cardiaques. Enfin, nos résultats montrant l’absence de l’influence directe de la surexpression d’AT1R sur les canaux K+ et Ca2+ au niveau des myocytes auriculaires renforcent l’importance d’approfondir nos connaissances sur les effets de l’angiotensine II sur le développement de la fibrose, sur le remodelage structurel et sur la conduction électrique cardiaque.

Feedback regulation of Gab2-dependent signaling by the Ras/MAPK pathway

La voie de signalisation des Récepteurs Tyrosine Kinase (RTK) occupe un rôle central dans la régulation de la croissance cellulaire, la prolifération, la différentiation et la motilité. Une régulation anormale des RTKs mène à plusieurs maladies humaines telles que le cancer du sein, la seconde cause de mortalité chez les femmes à cause de l’amplification et la mutation fréquente de la protéine tyrosine kinase HER2 (ERBB2). Grb2-associated binder (Gab) 2 est une protéine adaptatrice qui agit en aval de plusieurs RTKs, y compris HER2, pour réguler de multiples voies de signalisation. En réponse à la stimulation par de nombreux facteurs de croissances et cytokines, Gab2 est recruté à la membrane plasmique où il potentialise l’activation des voies de signalisation Ras/mitogen-activated protein kinase (MAPK) et PI3K (phosphatidylinositol-3-kinase)/Akt (protein kinase B). En plus d’occuper un rôle essentiel durant le développement du système hématopoïétique, Gab2 est souvent amplifié dans les cancers, notamment le cancer du sein et les mélanomes. Cependant, les mécanismes moléculaires qui régulent le fonctionnement de Gab2 sont peu connus. Il est établi que lors de l’activation des RTKs, Gab2 est phosphorylé au niveau de plusieurs résidus Tyrosine, menant à l’association de différentes protéines comme p85 et Shp2. En plus de la phosphorylation en Tyrosine, notre laboratoire ainsi que d’autres groupes de recherche avons identifié que Gab2 est aussi phosphorylé au niveau de résidus Ser/Thr suite à l’activation de la voie de signalisation MAPK. Cependant, la régulation des fonctions de Gab2 par ces modifications post-traductionnelles est encore peu connue. Dans le but de comprendre comment Gab2 est régulé par la voie de signalisation MAPK, nous avons utilisé différentes approches. Dans la première partie de ma thèse, nous avons déterminé un nouveau mécanisme démontrant que la voie de signalisation Ras/MAPK, par le biais des protéines kinases RSK (p90 ribosomal S6 kinase), phosphoryle Gab2. Ce phénomène se produit à la fois in vivo et in vitro au niveau de trois résidus Ser/Thr conservés. Des mutations au niveau de ces sites de phosphorylation entrainent le recrutement de Shp2 menant à l’augmentation de la motilité cellulaire, ce qui suggère que les protéines RSK restreignent les fonctions dépendantes de Gab2. Ce phénomène est le résultat de la participation de RSK dans la boucle de rétroaction négative de la voie de signalisation MAPK. Dans la seconde partie de ma thèse, nous avons démontré que les protéines ERK1/2 phosphorylent Gab2 au niveau de plusieurs résidus pS/T-P à la fois in vitro et in vivo, entrainant l’inhibition du recrutement de p85. De plus, nous avons établi pour la première fois que Gab2 interagit physiquement avec ERK1/2 dans des cellules lors de l’activation de la voie de signalisation MAPK. Par ailleurs, nous avons montré un nouveau domaine d’attache du module ERK1/2 sur Gab2. Des mutations sur les résidus essentiels de ce domaine d’attache n’entrainent pas seulement la dissociation de ERK1/2 avec Gab2, mais diminuent également la phosphorylation dépendante de ERK1/2 sur Gab2. Ainsi, nos données montrent que la voie de signalisation MAPK régule les fonctions de la protéine Gab2 par le biais des kinases RSK et ERK1/2. Cette thèse élabore par ailleurs un schéma complet des fonctions de Gab2 dépendantes de la voie de signalisation MAPK dans le développement de nombreux cancers.

Rôle du métabolisme énergétique dans un contexte de vieillissement chez C. elegans

L’incidence constante des maladies liées à l’âge reflète un réel enjeu dans nos sociétés actuelles, principalement lorsqu’il est question des cas de cancers, d’accidents cérébraux et de maladies neurodégénératives. Ces désordres sont liés à l’augmentation de l’espérance de vie et à un vieillissement de la population. Les coûts, estimés en milliards de dollars, représentent des sommes de plus en plus importantes. Bien que les efforts déployés soient importants, aucun traitement n’a encore été trouvé. Les maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer, de Parkinson, d’Huntington ou la sclérose latérale amyotrophique (SLA), caractérisées par la dégénérescence d’un type neuronal spécifique à chaque pathologie, représentent un défi important. Les mécanismes de déclenchement de la pathologie sont encore nébuleux, de plus il est maintenant clair que certains de ces désordres impliquent de nombreux gènes impliqués dans diverses voies de signalisation induisant le dysfonctionnement de processus biologiques importants, tel que le métabolisme. Dans nos sociétés occidentales, une problématique, directement lié à notre style de vie s’ajoute. L’augmentation des quantités de sucre et de gras dans nos diètes a amené à un accroissement des cas de diabètes de type II, d’obésité et de maladies coronariennes. Néanmoins, le métabolisme du glucose, principale source énergétique du cerveau, est primordial à la survie de n’importe quel organisme. Lors de ces travaux, deux études effectuées à l’aide de l’organisme Caenorhabditis elegans ont porté sur un rôle protecteur du glucose dans un contexte de vieillissement pathologique et dans des conditions de stress cellulaire. Le vieillissement semble accéléré dans un environnement enrichi en glucose. Cependant, les sujets traités ont démontré une résistance importante à différents stress et aussi à la présence de protéines toxiques impliquées dans la SLA et la maladie de Huntington. Dans un deuxième temps, nous avons démontré que ces effets peuvent aussi être transmis à la génération suivante. Un environnement enrichi en glucose a pour bénéfice de permettre une meilleure résistance de la progéniture, sans pour autant transmettre les effets néfastes dû au vieillissement accéléré.

Mécanismes de résistance aux inhibiteurs de CCR5

Le travail décrit dans ce manuscrit vise à caractériser les voies de résistance aux inhibiteurs de CCR5. Lors d’une première étape, nous avons développé un test phénotypique clonal nous permettant d’une part d’identifier le tropisme viral et d’autre part de mesurer la résistance aux inhibiteurs des CCR5. Des virus à tropisme R5 ou X4 représentant aussi peu que 0,4% d’un mélange de populations virales sont détectables par ce test, démontrant ainsi sa sensibilité. De plus, grâce à son approche clonale, cette technique permet de différencier les virus à tropisme double de populations virales mixtes. Par la suite, nous avons étudié l’impact des mutations dans les régions variables de la protéine gp120 de l’enveloppe du virus VIH-1 sur la résistance aux inhibiteurs de CCR5. Pour ce faire, nous avons généré des virus résistants par passage des isolats CC1/85 et BAL, en présence de concentrations sous-inhibitrices de maraviroc (MVC) et vicriviroc (VCV). Après quelques passages du virus CC1/85 en présence de MVC, certaines sont apparues dans differentes régions de la gp120. Par la suite, nous avons sélectionné trois mutations dans les domaines variables de la gp 120, V169M en V2, L317W en V3 et I408T en V4 pour construire des virus contenant des mutations simples, doubles et triples afin d’évaluer la contribution des mutations individuelles ou combinées au phénotype de résistance. Nous avons déterminé la sensibilité de chaque mutant à MVC et VCV, le pourcentage d’infectivité et le tropisme viral par rapport au phénotype sauvage. Tous les mutants ont conservé le tropisme R5 et ont montré une diminution d’infectivité par rapport au contrôle. Nos résultats ont montré que les mutants qui portent des mutations en V4 (I408T) ont eu le plus d'impact sur la susceptibilité au MVC. Finalement, nous avons voulu évaluer l’activité antivirale d’un nouvel inhibiteur de CCR5, VCH-286 avec d’autres inhibiteurs de CCR5 tels que MVC et VVC ainsi que ses interactions avec des médicaments représentatifs de différentes classes d’antirétroviraux ARV employés en clinique pour traiter le HIV/SIDA., afin d’évaluer si ces médicaments pourraient être utilisés dans un même régime thérapeutique. Nous avons tout d’abord évalué indépendamment l’activité antivirale des trois inhibiteurs de CCR5 : VCH-286, MVC et VVC. Par la suite nous avons évalué les interactions de VCH-286 avec MVC et VVC. Finalement nous avons évalué les interactions de VCH-286 avec d’autres médicaments antirétroviraux. Ces études ont montré que VCH-286 est un inhibiteur puissant de CCR5 avec une activité antivirale in vitro de l’ordre du nanomolaire et des interactions médicamenteuses favorables avec la majorité des ARV tels que les inhibiteurs de transcriptase inverse, de protéase, d’intégrase, et de fusion employés en clinique pour traiter le VIH/SIDA et des interactions allant de synergie à l'antagonisme avec les inhibiteurs de CCR5. Nos résultats montrent que la plasticité de l’enveloppe virale du VIH-1 a des répercussions sur la résistance aux inhibiteurs de CCR5, le tropisme et la possible utilisation de ces molécules en combinaison avec d’autres molécules appartenant à la même classe.

Mécanismes moléculaires régulant la pathologie dendritique dans la rétine adulte lésée in vivo

Les dendrites sont essentielles pour la réception et l’intégration des stimuli afférents dans les neurones. De plus en plus d’évidences d’une détérioration dendritique sont associées à une axonopathie dans les maladies neurodégénératives. Le glaucome dont la physiopathologie est caractérisée par une détérioration progressive et irréversible des cellules ganglionnaires de la rétine (CGRs) est la première cause de cécité irréversible dans le monde. Son évolution est associée à un amincissement graduel des axones et à l’atrophie des somas des CGRs. La majorité des études de neuroprotection des neuropathies rétiniennes visent la survie et la protection des somas et des axones. Des études récentes ont démontré des changements dendritiques associés à cette pathologie, toutefois les mécanismes moléculaires les régulant sont méconnus. L’hypothèse principale de ma thèse stipule qu’une lésion axonale entraîne des altérations précoces des structures dendritiques. L’identification de voies de signalisation régulant ces changements permettrait d’élaborer des stratégies de neuroprotection et de rétablir la fonction de ces neurones. Dans la première étude, nous avons examiné l’effet précoce d’une lésion axonale aigüe sur la morphologie dendritique des CGRs in vivo. En utilisant des souris transgéniques exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP) soumises à une axotomie, nous avons démontré un rétrécissement de l’arbre dendritique des CGRs et une diminution sélective de l’activité de mTOR avant le début de la mort des CGRs lésées. Aussi nous avons démontré une augmentation de l’expression de la protéine Regulated in development and DNA damage response 2 (REDD2), un régulateur négatif en amont de la protéine mTOR en réponse à la lésion du nerf optique in vivo. Nous avons démontré que la réactivation de mTOR par l’inhibition de l’expression de REDD2 préserve les arbres dendritiques des CGRs adultes. En effet, l’injection de petits ARN d’interférence contre la REDD2 (siREDD2) stimule l’activité de mTOR dans les CGRs lésées et augmente significativement la longueur et la surface dendritique totale. De plus, la rapamycine, un inhibiteur de mTOR, inhibe complètement l’effet du siREDD2 sur la croissance et l’élaboration des dendrites. L’analyse électrophysiologique des CGRs démontre une augmentation de l’excitabilité des CGRs lésées qui est restaurée en présence du siREDD2. Par ailleurs, des données récentes ont mis en évidence l’implication de la neuro-inflammation dans le glaucome, caractérisée par une augmentation de cytokines pro-inflammatoires dont principalement le facteur de nécrose tumorale (TNFα). Ainsi dans la deuxième étude nous avons examiné l’effet du TNF exogène sur la morphologie de l’arbre dendritique des CGRs et commencé l’étude des mécanismes moléculaires sous-jacents à ces changements. Nos résultats démontrent que l’injection de TNF recombinante dans le vitrée induit une rétraction dendritique précoce qui corrèle à une réduction de phospho-S6 suggérant l’implication de mTOR dans ces CGRs lésées. Ainsi, les études présentées dans cette thèse mettent en évidence un nouveau rôle de mTOR dans la stabilité et le maintien des dendrites de neurones rétiniennes adultes. Ces études ont aussi démontré l’effet précoce de stress direct ou indirect, c’est-à-dire l’axotomie et le TNFα respectivement sur la pathologie dendritique et sur leur effet sur la fonction neuronale.

Studies on lipid production of microalgae under mixotrophic growth, utilizing glycerol as a carbon source, combined with nitrogen starvation

Rampant increases in oil prices and detrimental effects of fossil fuels on the environment have been the main impetus for the development of environmentally friendly and sustainable energy sources. Amongst the many possibilities, microalgae have been proposed as a new alternative energy source to fossil fuels, as their growth is both sustainable and ecologically safe. By definition, microalgae are unicellular photosynthetic microorganisms containing chlorophyll a. These organisms are capable of producing large quantities of oils, surpassing that of traditional oil-seed crops, which can be transformed, through chemical processes, into biofuels such as biodiesel or bio-gasoline. Thus, recent research has gone into discovering high lipid producing algal strains, optimising growth media for increased lipid production and developing metabolic engineering to make microalgae a source of biofuel that is competitive to more traditional sources of biofuel and even to fossil fuel. In this context, the research reported here focused on using a mixotrophic growth mode as a way to increase lipid production for certain strains of microalgae. In addition, nitrogen starvation combined with mixotrophy was studied to analyse its effects on lipid production. Mixotrophy is the parallel usage of two trophic modes, in our case photoautotrophy and heterotrophy. Consequently, 12 algal strains were screened for mixotrophic growth, using glycerol as a carbon source. Glycerol is a waste product of the current biodiesel industry; it is a cheap and abundant carbon source present in many metabolic pathways. From this initial screening, several strains were chosen for subsequent experiments involving nitrogen starvation. Nitrogen starvation has been shown to induce lipid accumulation. The results obtained show that a mixotrophic growth mode, using glycerol as a carbon source, enhances lipid production for certain strains. Moreover, lipid enhancement was shown for nitrogen starvation combined with mixotrophic growth mode. This was dependant on time spent under nitrogen starvation and on initial concentrations of the nitrogen source.

Étude de l’immunité mucosale génitale chez des femmes béninoises hautement exposées au VIH-1 séronégatives (HESN) et séropositives.

Introduction : Aujourd’hui, 35,3 millions de personnes vivent avec le virus de l’immunodéficience humaine (VIH)-1 dans le monde ; l’Afrique subsaharienne concentre 70% des nouvelles infections et les femmes en représentent plus de la moitié. Le mode de transmission du VIH le plus répandu est par voie mucosale génitale suite à des relations sexuelles. Le tractus génital féminin (TGF) possède un milieu immunitaire complexe qui doit contrer l’invasion par des pathogènes tout en maintenant la tolérance/contrôle de la flore normale vaginale étant sous la pression de procréation sous influence des hormones sexuelles. De plus, les mécanismes favorisant ou prévenant l’infection du TGF par le VIH ne sont pas précisément identifiés. Hypothèse : Le contexte inflammatoire mucosal génital et la résultante de dialogues intercellulaires tel qu’entre les cellules épithéliales génitales (CEG) et les cellules dendritiques myéloïdes (mDC), qui sont des premières à rencontrer le virus aux portes d’entrée mucosales, modulent l’activité des lymphocytes qui est déterminante dans le type de réponse immunitaire élaborée par l’hôte. Méthodologie : Des spécimens provenant d’une cohorte de travailleuses du sexe (TS) recrutées à Cotonou au Bénin en Afrique subsaharienne ont été analysés. Nous avons caractérisé le milieu mucosal génital féminin hautement exposé au VIH de TS séronégatives (highly exposed seronegative; HESN) en comparaison avec celui de TS séropositives. Brièvement, les liquides cervicaux-vaginaux ont été déterminés par des techniques de multiplexes/Luminex ou par ELISA et le milieu cellulaire a été décrit suite à des analyses de cytométrie en flux (phénotypage et tri cellulaire). Résultats : Nous avons observé la présence augmentée d’un facteur soluble antiviral, immunomodulateur et antiprolifératif sécrété dans le TGF des TS HESN qui est l’interféron (IFN)-α. La présence augmentée de cette cytokine suggère l’existence possible de connexions intercellulaires clés qui pourraient mener à une régulation homéostatique du compartiment immunitaire génital permettant de contrôler l’infection par le VIH-1. En étudiant l’expression de molécules impliquées dans les voies de signalisation associées à la production d’IFN-α dans les CEG et les cellules myéloïdes du TGF, nous avons pu mettre en évidence l’existence d’un microenvironnement présentant un profil «tolérogénique/régulateur» dans le TGF des TS HESN. Conclusion : Nos observations nous ont permis d’élucider certaines hypothèses sur un potentiel mécanisme d’immunité naturelle protecteur chez les TS HESN. De plus, nous sommes des premiers à décrire une population myéloïde présentant des caractéristiques de DC «tolérogéniques» de par leur expression d’interleukine (IL)-10, de human leukocyte antigen (HLA)-G et de immunoglobulin-like transcript (ILT)-4 dans le TGF de TS HESN. Cette étude aura des implications majeures dans le développement de stratégies d’interventions préventives afin de moduler des conditions inflammatoires préexistantes ainsi établissant une défense mucosale rapide et durable contre le VIH-1.

Molecular mechanisms underlying deficient neurogenesis in Alzheimer’s disease

La neurogenèse est présente, dans le cerveau adulte, dans la zone sous-ventriculaire (ZSV) encadrant les ventricules latéraux et dans le gyrus dentelé (GD) de l’hippocampe, permettant l’apprentissage, la mémoire et la fonction olfactive. Ces micro-environnements possèdent des signaux contrôlant l’auto-renouvellement des cellules souches neurales (CSN), leur prolifération, leur destin et leur différenciation. Or, lors du vieillissement, les capacités régénératives et homéostatiques et la neurogenèse déclinent. Les patients atteints de la maladie d’Alzheimer (MA), comme le modèle animal reproduisant cette maladie (3xTg-AD), montrent une accélération des phénotypes liés au vieillissement dont une diminution de la neurogenèse. Notre hypothèse est que la découverte des mécanismes affectant la neurogenèse, lors du vieillissement et de la MA, pourrait fournir de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir le déclin cognitif. Les études sur l’âge d’apparition et les mécanismes altérant la neurogenèse dans la MA sont contrastées et nous ont guidé vers deux études. L’examen des changements dans les étapes de la neurogenèse lors du vieillissement et du développement de la neuropathologie. Nous avons étudié la ZSV, les bulbes olfactifs et le GD de souris femelles de 11 et 18 mois, et l’apparition des deux pathologies associées à la MA : les plaques amyloïdes et les enchevêtrements neurofibrillaires. Nous avons découvert que les souris 3xTg-AD possèdent moins de cellules en prolifération, de progéniteurs et de neuroblastes, induisant une diminution de l’intégration de nouvelles cellules dans le GD et les bulbes olfactifs. Notons que le taux de neurogenèse chez ces souris de 11 mois est similaire à celui des souris de phénotype sauvage de 18 mois, indiquant une accélération des changements liés au vieillissement dans la MA. Dans la ZSV, nous avons aussi démontré une accumulation de gouttelettes lipidiques, suggérant des changements dans l’organisation et le métabolisme de la niche. Enfin, nous avons démontré que le déficit de la neurogenèse apparait lors des premières étapes de la MA, avant l’apparition des plaques amyloïdes et des enchevêtrements neurofibrillaires. A l’examen des mécanismes inhibant la neurogenèse lors de la MA, nous voyons que chez des souris de 5 mois, le déficit de la neurogenèse dans la ZSV et le GD est corrélé avec l’accumulation de lipides, qui coïncide avec l’apparition du déclin cognitif. Nous avons aussi découvert que dans le cerveau humain de patients atteints de la MA et dans les 3xTg-AD, des gouttelettes lipidiques s’accumulaient dans les cellules épendymaires, représentant le principal soutien des CSN de la niche. Ces lipides sont des triglycérides enrichis en acide oléique qui proviennent de la niche et pas d’une défaillance du système périphérique. De plus, l’infusion locale d’acide oléique chez des souris de phénotype sauvage permet de reproduire l’accumulation de triglycérides dans les cellules épendymaires, comme dans la MA. Ces gouttelettes induisent un dérèglement de la voie de signalisation Akt-FoxO3 dans les CSN, menant à l’inhibition de leur activation in vitro et in vivo. Ces résultats permettent une meilleure compréhension de la régulation de la neurogenèse par le métabolisme lipidique. Nous avons démontré un nouveau mécanisme par lequel l’accumulation des lipides dans la ZSV induit une inhibition des capacités de prolifération et de régénération des CSN lors de la MA. Les travaux futurs permettront de comprendre comment et pourquoi le métabolisme lipidique du cerveau est altéré dans la MA, ce qui pourrait offrir de nouvelles voies thérapeutiques pour la prévention et la régénération.

Rôles des protéines d’échafaudage Gab dans la signalisation et l’angiogenèse médiées par le VEGF

La protéine d’échafaudage Gab1 amplifie la signalisation de plusieurs récepteurs à fonction tyrosine kinase (RTK). Entre autres, elle promeut la signalisation du VEGFR2, un RTK essentiel à la médiation de l’angiogenèse via le VEGF dans les cellules endothéliales. En réponse au VEGF, Gab1 est phosphorylé sur tyrosine, ce qui résulte en la formation d’un complexe de protéines de signalisation impliqué dans le remodelage du cytosquelette d’actine et la migration des cellules endothéliales. Gab1 est un modulateur essentiel de l’angiogenèse in vitro et in vivo. Toutefois, malgré l’importance de Gab1 dans les cellules endothéliales, les mécanismes moléculaires impliqués dans la médiation de ses fonctions, demeurent mal définis et la participation du second membre de la famille, Gab2, reste inconnue. Dans un premier temps, nous avons démontré que tout comme Gab1, Gab2 est phosphorylé sur tyrosine, qu’il s’associe de façon similaire avec des protéines de signalisation et qu’il médie la migration des cellules endothéliales en réponse au VEGF. Cependant, contrairement à Gab1, Gab2 n’interagit pas avec le VEGFR2 et n’est pas essentiel pour l’activation d’Akt et la promotion de la survie cellulaire. En fait, nous avons constaté que l’expression de Gab2 atténue l’expression de Gab1 et l’activation de la signalisation médiée par le VEGF. Ainsi, Gab2 semble agir plutôt comme un régulateur négatif des signaux pro-angiogéniques induits par Gab1. La migration cellulaire est une des étapes cruciales de l’angiogenèse. Nous avons démontré que Gab1 médie l’activation de la GTPase Rac1 via la formation et la localisation d’un complexe protéique incluant la GEF VAV2, la p120Caténine et la Cortactine aux lamellipodes des cellules endothéliales en réponse au VEGF. De plus, nous montrons que l’assemblage de ce complexe corrèle avec la capacité du VEGF à induire l’invasion des cellules endothéliales et le bourgeonnement de capillaires, deux phénomènes essentiels au processus angiogénique. La régulation des RhoGTPases est également régulée par des inactivateurs spécifiques les « Rho GTPases activating proteins », ou GAPs. Nous décrivons ici pour la première fois le rôle de la GAP CdGAP dans les cellules endothéliales et démontrons son importance dans la médiation de la signalisation du VEGF via la phosphorylation sur tyrosine de Gab1 et l’activation des RhoGTPases Rac1 et Cdc42. Ainsi, dù à son importance sur l’activation de voies de signalisation du VEGF, CdGAP représente un régulateur crucial de la promotion de diverses activités biologiques essentielles à l’angiogenèse telles que la migration cellulaire, et le bourgeonnement de capillaires in vitro et d’aortes de souris ex vivo. De plus, les embryons de souris CdGAP KO présentent des hémorragies et de l’œdème, et ces défauts vasculaires pourraient être responsables de la mortalité de 44% des souris CdGAP knock-out attendues. Nos études amènent donc une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires induits par le VEGF et démontrent l’implication centrale de Gab1 et des régulateurs des RhoGTPases dans la promotion de l’angiogenèse. Cette meilleure compréhension pourrait mener à l’identification de nouvelles cibles ou approches thérapeutiques afin d’améliorer le traitement des patients souffrant de maladies associées à une néovascularisation incontrôlée telles que le cancer.

Caractérisation des transcrits antisens chez les rétrovirus HTLV et étude comparative des fonctions des protéines traduites à partir de ces transcrits antisens

Le premier membre de la famille des rétrovirus humains HTLV (Virus T-lymphotropique Humain), HTLV-1, a été découvert en 1980 et l’on estime aujourd’hui à plus de 10 millions le nombre d’individus infectés à travers le monde. Après une période de latence d’environ 40 ans, 5% des individus infectés développent des leucémies, des lymphomes adultes de lymphocytes T (ATLL) ou encore une myélopathie associée à HTLV-1/ paraparésie spastique tropicale (HAM/TSP). L’apparition de la maladie serait en grande partie orchestrée par deux protéines virales, soit Tax et HTLV-1 bZIP factor (HBZ). L’expression du génome viral se fait à partir d’un transcrit sens de pleine longueur suite à un épissage alternatif, à l’exception du gène HBZ. HBZ est produite à partir d’un transcrit antisens initié dans la séquence terminale longue répétée (LTR)’3. Elle a été décrite comme étant capable de réguler négativement la transcription virale dépendante de Tax en se dimérisant avec des facteurs de transcription cellulaires tels que CREB-2 et certains membres de la famille Jun. HBZ a aussi un pouvoir prolifératif et bien que nous ne sachions toujours pas le mécanisme moléculaire menant à l’oncogenèse par HBZ, nous savons qu’elle module une multitude de voies de transduction de signaux, dont AP-1. Nous avons récemment mis en évidence un transcrit antisens nommé Antisense Protein of HTLV-2 (APH-2) chez HTLV-2 qui n’est associé qu’à une myélopathie apparentée au HAM/TSP. Ce n’est qu’en 2005 que HTLV-3 et HTLV-4 se sont rajoutés au groupe HTLV. Cependant, aucune corrélation avec le développement d’une quelconque maladie n’a été montrée jusqu’à ce jour. Le premier volet de ce projet de doctorat avait pour objectif de détecter et caractériser les transcrits antisens produits par HTLV-3 et HTLV-4 et d’étudier les protéines traduites à partir de ces transcrits pour ainsi évaluer leurs similitudes et/ou différences avec HBZ et APH-2. Nos études de localisation cellulaire réalisées par microscopie confocale ont montré que APH-3 et APH-4 sont des protéines nucléaires, se retrouvant sous la forme de granules et, dans le cas d’APH-3, partiellement cytoplasmique. Ces granules co-localisent en partie avec HBZ. Les analyses à l’aide d’un gène rapporteur luciférase contenant le LTR 5’ de HTLV-1 ont montré que APH-3 et APH-4 peuvent aussi inhiber la transactivation du LTR 5’ par Tax. Aussi, des études faisant appel au gène rapporteur précédé d’un promoteur de collagénase (site AP-1), ont montré que ces deux protéines, contrairement à HBZ, activent la transcription dépendante de tous les membres des facteurs de transcription de la famille Jun. De plus, les mutants ont montré que le motif fermeture éclair (LZ) atypique de ces protéines est impliqué dans cette régulation. En effet, APH-3 et APH-4 modulent la voie Jun-dépendante en se dimérisant via leur LZ atypique avec la famille Jun et semblent activer la voie par un mécanisme ne faisant pas par d’un domaine activateur autonome. Dans un deuxième volet, nous avions comme objectif d’approfondir nos connaissances sur la localisation nucléolaire de HBZ. Lors de nos analyses, nous avons identifié deux nouveaux partenaires d’interaction, B23 et la nucléoline, qui semblent être associés à sa localisation nucléolaire. En effet, ces interactions sont plus fortes suivant une délétion des domaines AD et bZIP de HBZ qui dans ce cas est localisée strictement au nucléole. De plus, bien que APH-3 et APH-4 puissent se localiser aux nucléoles, HBZ est la seule protéine traduite à partir d’un transcrit antisens pouvant interagir avec B23. Finalement, ces travaux ont clairement mis en évidence que HTLV-3 et HTLV-4 permettent la production de transcrits antisens comme chez d’autres rétrovirus. Les protéines traduites à partir de ces transcrits antisens jouent d’importants rôles dans la réplication rétrovirale mais semblent avoir des fonctions différentes de celles de HBZ au niveau de la régulation de la transcription de la voie Jun. HBZ semble aussi jouer un rôle unique dans le nucléole en ciblant les protéines nucléolaires de la cellule. Ces études démontrent que les protéines produites à partir de transcrits antisens chez les rétrovirus HTLV partagent plusieurs ressemblances, mais démontrent aussi des différences. Ainsi, les APH pourraient, en tant qu’outil comparatif, aider à mieux cibler les mécanismes moléculaires importants utilisés par HBZ pour induire la pathogénèse associée à une infection par HTLV.

Identification de composé sensibilisant préférentiellement les cellules exprimant les protéines E6 et E7 du VPH à l'irradiation

Le cancer du col utérin (CCU) est dans plus de 99% des cas provoqué par une infection avec le virus du papillome humain (VPH), dont le potentiel oncogénique réside dans l'expression des proto-oncogènes viraux E6/E7. Le potentiel carcinogénique de ces protéines virales réside essentiellement dans leurs actions sur les produits des gènes suppresseurs de tumeur p53 et RB. Les produits de ces gènes, p53 et Rb, font parti des voies de signalisation de réponse aux dommages de l'ADN cellulaire (RDA) et leur perte entraine une perte de fonctionnalité qui mène à une instabilité génomique. À long terme et en présence de d'autres facteurs ceux-ci mèneront au développement d'un cancer. Les protéines E6 et E7 sont constitutivement exprimées dans les cellules du CCU ainsi que dans les cellules de tout autre cancer induit par le VPH et seulement dans ces dernières. La prise en charge des cas avancés de ces cancers se fait principalement par radiothérapie et chimiothérapie concomitante. La chimio-radiothérapie utilisée en traitement est efficace mais résulte en un taux élevé de morbidité et un nombre important de patientes récidiveront. Nous proposons que l'exploitation de l'expression spécifique d’E6 et d’E7 dans les cellules du CCU permette d’envisager une stratégie de létalité synthétique afin d'amplifier l'effet létal de l'irradiation sur les cellules CCU. Ceci permettrait potentiellement d'augmenter l'efficacité du traitement et de diminuer les récidives, ainsi que la morbidité liée au traitement. En s'appuyant sur cette hypothèse, notre objectif est d’identifier des composés dont l'action seule ou couplée à l'irradiation provoquerait préférentiellement la mort des cellules exprimant les protéines E6 et E7 du VPH. Les cellules testées comprennent des cellules isogéniques humaines issues de kératinocytes normaux que nous avons modifiées séquentiellement pour obtenir les modifications associées aux cellules CCU (hTERT, E6 et E7), ainsi que les lignées de cellules de CCU HeLa et CaSki .Nous avons procédé à la mise au point et à la validation du protocole de criblage et des méthodes d’évaluation de la sensibilisation, qui se définit comme une perte de viabilité, un arrêt ou ralentissement de la croissance, par détection d’ATP ainsi que par coloration d’ADN génomique au DRAQ5. Suite à un criblage ciblé impliquant des inhibiteurs connus de la voie de réparation des dommages à l’ADN, nous avons identifié l’inhibiteur de mdm2, Nutlin-3, comme étant un composé sensibilisant et radio-sensibilisant préférentiellement les cellules exprimant E6 et E7 du VPH. La Nutlin-3 a été testée sur des cellules HEKn-hTERT-E6-E7, des cellules CaSki et HeLa. L’effet de sensibilisation et de radio-sensibilisation a été confirmé dans ces trois lignées. Tel que suggéré par son action sur mdmd2, la Nutlin-3 permet la stabilisation de p53 dans les cellules HEKn-hTERT-E6-E7 et CaSki et sa réactivation dans les lignées cellulaires HeLa et CaSki. Malgré cette stabilisation de p53, de façon surprenante, l’effet de la Nutlin-3 sur la sensibilisation et la radio-sensibilisation des cellules HeLa et CaSki semble indépendant de p53, tel qu’observé en utilisant des cellules HeLa-GSE et CaSki-GSE dont le p53 est déficient. In vivo la Nutlin-3a montre dans un essai préliminaire l’inhibition de la croissance tumorale des xénogreffes HeLa chez des souris RAG2γc. Ce résultat reste à confirmer avec un essai impliquant un nombre d’échantillons plus grand. À plus long terme, nous comptons étudier l’implication de mdm2 dans l’effet de sensibilisant de la Nutlin-3 dans les cellules CCUs, ainsi que les autres cibles pouvant être impliquées dans la création de cet effet sensibilisant observé.