Le TGF-[BETA] comme marqueur d'adhérences abdominales dans un modèle expérimental de poulain nouveau-né

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Differential regulation of early response genes by fibroblast growth factor (FGF) 8 and FGF18 in bovine granulosa cells in vitro

Les « Facteurs de croissance des fibroblastes» (FGF) agissent comme des régulateurs locaux sur la qualité des follicules et sont connus pour promouvoir la prolifération des cellules de granulosa, réduire l’apoptose et la stéroïdogenèse. Parmi la sous-famille FGF8, FGF18 est une exception puisqu’il semblerait avoir une fonction pro-apoptotique alors que FGF8 n’a pas été jusqu’à présent rapporté comme altérant la viabilité des cellules de la granulosa. Ces deux ligands ont un mode d’activation similaire et il pourrait être proposé que toute la sous-famille FGF8 ait la même réponse. L’objectif de cette étude était de déterminer si FGF8 et FGF18 activaient la même réponse précoce de gènes dans des cultures de granulosa bovine. Pour répondre à cette question, nous avons cultivé des cellules de la granulosa dans du milieu de culture sans sérum pendant 5 jours. Le jour 5, les cellules ont été traitées avec FGF8 ou FGF18. Nous avons eu recours à une approche de « puce à ADN » afin d’identifier la réponse précoce de gènes induite par FGF8 et FGF18, et les données ont été confirmées par des PCRs en temps réel lors d’une expérience in vitro où les cellules de granulosa ont été traitées avec FGF8 et FGF18 pendant différents temps. L’analyse du puce à ADN a identifié 12 gènes surexprimés par FGF8, incluant SPRY2, NR4A1, XIRP1, BAMBI, EGR1, FOS et FOSL1. A l’inverse, FGF18 n’a régulé aucun gène de manière significative. Les analyses de PCR ont confirmé l’augmentation d’ARNm codant pour EGR1, EGR3, FOS, XIRP1, FOSL1, SPRY2, NR4A1 et BAMBI après 2 h de traitement. FGF18 a entrainé seulement une augmentation de l’expression de EGR1 après 2 h de traitement parmi tous les gènes testés. Ces résultats démontrent donc que FGF8 et FGF18, malgré leur similarité dans le mode d’activation de leurs récepteurs, agissent sur les cellules de la granulosa via différentes voies de signalisation. FGF8 et FGF18, sont donc tous les deux capables de stimuler l’expression de EGR1, mais les voies de signalisation induites par la suite divergent.

Caractérisation des processus moléculaires impliqués dans l’activation de la protéine IKKbeta par l'angiotensine II et son rôle dans la réponse phénotypique des CMLV.

Le système rénine-angiotensine-aldostérone (SRAA) régule l’homéostasie de la contraction des artères. Or, suivant la liaison de l’angiotensine II (Ang II) à son récepteur AT1, le SRAA est également impliqué dans l’activation de voies de signalisation à l’origine de l’inflammation et de l’hypertrophie des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV), soit deux processus participant au remodelage vasculaire caractéristique de diverses maladies cardiovasculaires, telles l’hypertension et l’athérosclérose. Ces pathologies sont les premières causes de mortalité naturelle en Amérique et les traitements les ciblant ne sont pas optimaux puisqu’ils visent seulement quelques facteurs de risque qui leur sont associés. Ainsi, la détermination des effecteurs intracellulaires régulant ces voies délétères est nécessaire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. L’inflammation Ang II-dépendante dans les CMLV est attribuée au facteur de transcription nuclear factor-kappa B (NF-κB). Cependant, les processus moléculaires couplant le récepteur AT1 à son activation sont peu caractérisés. L’étude abordant cette question démontre in vitro que NF-κB est activé par la protéine IκB kinase β (IKKβ) dans les CMLV exposées à l’Ang II et que cette kinase est régulée par deux voies de signalisation indépendantes, mais complémentaires afin d’assurer son activation rigoureuse et soutenue. L’une des voies est précoce et dépend des seconds messagers ainsi que de deux nouveaux effecteurs sous-jacents au récepteur AT1, soit la E3 ligase TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6) et la IKK kinase transforming growth factor-beta-activated kinase 1 (TAK1) tandis que la seconde est tardive et résulte de la signalisation mitogen-activated protein kinase kinase 1/2 (MEK1/2) - extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) - ribosomal S6 kinase (RSK). L’inhibition conjointe de ces voies abroge complètement la réponse inflammatoire, ce qui indique qu’elles en sont la seule source. Ainsi, l’inhibition d’IKKβ pourrait suffire à contrer l’inflammation impliquée dans le remodelage vasculaire associé à une suractivation du SRAA. Une découverte des plus novatrices découle de cette étude, qui veut que la E3 ligase TRAF6 est un nouvel effecteur des récepteurs couplés aux protéines G et est à l’origine de la formation d’un nouveau type de second messager, soit des chaînes libres de poly-ubiquitines. Les mécanismes moléculaires à la base de l’hypertrophie Ang II-dépendante dans les CMLV sont également peu définis. Or, suivant la parution d’un article démontrant qu’IKKβ dans les cellules cancéreuses participe aux mécanismes d’initiation de la traduction en réponse au facteur de nécrose tumorale α (TNFα) via la phosphorylation de la protéine Tuberous sclerosis 1 (TSC1) et donc l’activation du complexe mammalian target of rapamycin (mTORC1), une hypothèse a été émise selon laquelle cette kinase serait impliquée dans la synthèse protéique Ang II-dépendante dans les CMLV. Les expériences effectuées in vitro dans des CMLV exposées à l’Ang II démontrent qu’IKKβ induit la phosphorylation de TSC1 ainsi que l’activation de mTORC1 et de ses substrats S6 kinase 1 (S6K1) et translational regulators eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein (4E-BP1), deux protéines impliquées directement dans l’hypertrophie. Par ailleurs, la synthèse protéique au niveau des CMLV exposées à l’Ang II est réduite de 75% suivant la diminution de l’expression d’IKKβ et suivant la surexpression d’un mutant de TSC1 dont le site consensus d’IKKβ a été modifié, faisant de cette kinase un médiateur majeur au niveau de ce processus. Ainsi, in vitro IKKβ en réponse à l’Ang II est en amont de deux processus impliqués dans un remodelage vasculaire à l’origine de maladies cardiovasculaires. De plus, plusieurs facteurs de risque de ces pathologies convergent à l’activation d’IKKβ, ce qui en fait une cible thérapeutique particulièrement attrayante. Qui plus est, l’administration d’un inhibiteur d’IKKβ à des rats diminue non seulement la synthèse protéique dépendante de l’Ang II au niveau de l’aorte et des artères mésentériques, mais également la synthèse de la protéine pro-inflammatoire VCAM-1 par les cellules composant l’aorte, ce qui confirme son envergure en tant que cible.

Early growth response protein 1 (Egr-1) expression by Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) involves MAPKs and PKB pathways

Un remodelage vasculaire anormal est à la base de la pathogenèse des maladies cardio-vasculaires (MCV) telles que l’athérosclérose et l’hypertension. Des dysfonctionnements au niveau de la migration, l’hypertrophie et la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sont des évènements cellulaires qui jouent un rôle primordial dans le remodelage vasculaire. L’insulin-like growth factor 1 (IGF-1), puissant facteur mitogène, contribue au développement des MCV, notamment via l’activation des protéines MAPK et PI3-K/PKB, composantes clés impliquées dans les voies de croissance cellulaire. Ces molécules sont également impliquées dans la modulation de l’expression de nombreux facteurs de transcription, incluant le facteur Egr-1. Egr-1 est régulé à la hausse dans différents types de maladies vasculaires impliquant les voies de signalisation de croissance et de stress oxydant qui par ailleurs peuvent être déclenchées par l’IGF-1. Cependant, la question d’une possible modulation de l’expression d’Egr-1 dans les CMLV demeure inabordée; plus spécifiquement, la caractérisation de la voie de signalisation reliant l’action d’IGF-1 à l’expression d’Egr-1 reste à établir. Dans cette optique, l’objectif de cette étude a été d’examiner l’implication de MAPK, PKB et des dérivés réactifs de l’oxygène (DRO) dans l’expression d’Egr-1 induite par l’IGF-1 dans les CMLV. L’IGF-1 a induit une augmentation marquée du niveau protéique de l’Egr-1 en fonction du temps et de la concentration utilisés. Cette augmentation a été inhibée en fonction des doses d’agents pharmacologiques qui ciblent les voies de signalisation de MAPK, PKB et DRO. De plus, l’expression du facteur de transcription, Egr-1, en réponse de l’IGF-1, a été atténuée suite à un blocage pharmacologique des processus cellulaires responsables de la synthèse d’ARN et de synthèse protéique. Pour conclure, on a démontré que l’IGF-1 stimule l’expression d’Egr-1 via les voies de signalisation, impliquant ERK1/2/JNK, PI3K/PKB. On a également proposé que les DRO jouent un rôle important dans ce processus. Dans l’ensemble, nous avons suggéré un nouveau mécanisme par lequel l’IGF-1 promeut la prolifération et l’hypertrophie cellulaire, processus à la base des anomalies vasculaires.

Caractérisation du gène de l'enzyme de conversion de l'angiotensine-2 dans le rein diabétique et implication dans le développement de la néphropathie diabétique et de l'hypertension

De nombreuses études ont bien démontré que l’activation du système rénine-angiotensine (RAS) joue un rôle important dans le développement de l’hypertension et de la néphropathie diabétique (DN). La découverte de l’enzyme de conversion de l’angiotensine-2 (ACE2) et l’identification du récepteur MAS, spécifique pour l’angiotensine 1-7 (Ang 1-7), ont permis d’identifier deux nouveaux membres du RAS. L’axe ACE2/Ang 1-7/MAS contrebalance les effets de l’axe ACE/Ang II/AT1. Plusieurs évidences impliquent la contribution du RAS intrarénal dans la DN. Des études réalisées dans notre laboratoire avec des souris transgéniques surexprimant l’angiotensinogène de rat dans les cellules de leurs tubules proximaux rénaux (RPTCs) ont permis de démontrer l’importance du RAS intrarénal dans l’induction de l’hypertension et les dommages rénaux. Nous avons également observé que l’expression rénale de l’ACE2 et les niveaux urinaires d’ANG 1-7 sont plus faibles chez les souris Akita (diabète de type 1) et qu’un traitement avec des bloqueurs du RAS permet de normaliser l’expression de l’ACE2 et de prévenir le développement de l’hypertension dans le modèle des souris Akita. Dans un milieu diabétique, à la fois la glycémie et l’angiotensine II (Ang II) peuvent induire la génération des espèces réactives de l’oxygène (ROS), contribuant ainsi aux dommages rénaux. Afin d’explorer la relation entre les ROS, ACE2 et la DN, nous avons créé des souris Akita transgéniques surexprimant la catalase (Cat) dans les RPTCs, en croisant des souris Akita diabétique de type 1 à notre modèle de souris transgéniques surexprimant la Cat de rat dans les RPTCs. Dans une seconde étude, des souris Akita ont été traitées avec l’Ang 1-7 ou une combinaison d’Ang 1-7 et de son antagoniste, A779, afin d’étudier la relation entre l’action de l’Ang 1-7, l’hypertension systolique (sHTN), le stress oxydatif, les dommages rénaux, ACE2 et l’expression du récepteur Mas. Nos résultats ont montré que la surexpression de Cat atténue le stress oxydatif rénal; prévient l’hypertension, améliore le taux de filtration glomérulaire, l’albuminurie, l’hypertrophie rénale, la fibrose tubulo-interstitielle et l’apoptose tubulaire; et supprime l’expression des gènes profibrotiques et proapoptotiques dans les RPTCs des souris Akita Cat-Tg lorsque comparées aux souris Akita. De plus, la surexpression de Cat dans les RPTC des souris Akita normalise l’expression rénale de l’ACE2 et les niveaux urinaires d’Ang 1-7. D’autre part, l’administration d’Ang 1-7 prévient l’hypertension systémique, normalise le ratio albumine/créatinine urinaire et atténue l’hyperfiltration glomérulaire des souris Akita, sans affecter la glycémie sanguine. De plus, le traitement avec l’Ang 1-7 atténue aussi le stress oxydatif et l’expression de la NADPH oxydase, Agt, ACE, TGF-β1 (transforming growth factor-β1) et collagène IV, tout en augmentant l’expression de l’ACE2 et du récepteur Mas dans les reins des souris Akita. Ces effets sont renversés par la co-admininstration d’A779. Ces résultats démontrent que la surexpression de Cat prévient l’hypertension et la progression de la néphropathie, en plus de mettre en lumière l’importance du stress oxydatif intrarénal et l’expression de l’ACE2 comme facteurs contribuant à l’hypertension et les dommages rénaux observés dans le diabète. En outre, nos données suggèrent que l’Ang 1-7 joue un rôle protecteur dans l’hypertension et les dommages aux RPTC dans le diabète, principalement en réduisant les voies de signalisations du stress oxydatif dans les reins et en normalisant l’expression de l’ACE2 et du récepteur Mas. Nos résultats indiquent aussi que l’Ang 1-7 pourrait agir comme un agent thérapeutique potentiel dans le traitement de l’hypertension systémique et les dommages rénaux observés dans le diabète. En conséquence, l’Ang 1-7 est responsable du rôle protecteur de l’ACE2 dans l’hypertension et la DN.