Rôle de la topoisomérase I dans la stabilité du génome chez Escherichia coli

Les topoisomérases (topos) de type IA jouent un rôle primordial dans le maintien et l’organisation du génome. Cependant, les mécanismes par lesquels elles contrôlent cette stabilité génomique sont encore à approfondir. Chez E. coli, les deux principales topoisomérases de type IA sont la topo I (codée par le gène topA) et la topo III (codée par le gène topB). Il a déjà été montré que les cellules dépourvues des topos I et III formaient de très longs filaments dans lesquels les chromosomes ne sont pas bien séparés. Comme ces défauts de ségrégation des chromosomes sont corrigés par l’inactivation de la protéine RecA qui est responsable de la recombinaison homologue, il a été émis comme hypothèse que les topoisomérases de type IA avaient un rôle dans la résolution des intermédiaires de recombinaison afin de permettre la séparation des chromosomes. D’autre part, des études réalisées dans notre laboratoire démontrent que le rôle majeur de la topoisomérase I est d’empêcher la formation des R-loops durant la transcription, surtout au niveau des opérons rrn. Ces R-loops on été récemment identifiés comme des obstacles majeurs à l’avancement des fourches de réplication, ce qui peut provoquer une instabilité génomique. Nous avons des évidences génétiques montrant qu’il en serait de même chez nos mutants topA. Tout récemment, des études ont montré le rôle majeur de certaines hélicases dans le soutien aux fourches de réplication bloquées, mais aussi une aide afin de supprimer les R-loops. Chez E. coli, ces hélicases ont été identifiées et sont DinG, Rep et UvrD. Ces hélicases jouent un rôle dans la suppression de certains obstacles à la réplication. Le but de ce projet était de vérifier l’implication de ces hélicases chez le mutant topA en utilisant une approche génétique. Étonnamment, nos résultats montrent que la délétion de certains de ces gènes d’hélicases a pour effet de corriger plutôt que d’exacerber des phénotypes du mutants topA qui sont liés à la croissance et à la morphologie des nucléoides et des cellules. Ces résultats sont interprétés à la lumière de nouvelles fonctions attribuées aux topoisomérases de types IA dans la stabilité du génome.

Genetic studies on the role of type IA DNA topoisomerases in DNA metabolism and genome maintenance in Escherichia coli

Le surenroulement de l’ADN est important pour tous les processus cellulaires qui requièrent la séparation des brins de l’ADN. Il est régulé par l’activité enzymatique des topoisomérases. La gyrase (gyrA et gyrB) utilise l’ATP pour introduire des supertours négatifs dans l’ADN, alors que la topoisomérase I (topA) et la topoisomérase IV (parC et parE) les éliminent. Les cellules déficientes pour la topoisomérase I sont viables si elles ont des mutations compensatoires dans un des gènes codant pour une sous-unité de la gyrase. Ces mutations réduisent le niveau de surenroulement négatif du chromosome et permettent la croissance bactérienne. Une de ces mutations engendre la production d'une gyrase thermosensible. L’activité de surenroulement de la gyrase en absence de la topoisomérase I cause l’accumulation d’ADN hyper-surenroulé négativement à cause de la formation de R-loops. La surproduction de la RNase HI (rnhA), une enzyme qui dégrade l’ARN des R-loops, permet de prévenir l’accumulation d’un excès de surenroulement négatif. En absence de RNase HI, des R-loops sont aussi formés et peuvent être utilisés pour déclencher la réplication de l’ADN indépendamment du système normal oriC/DnaA, un phénomène connu sous le nom de « constitutive stable DNA replication » (cSDR). Pour mieux comprendre le lien entre la formation de R-loops et l’excès de surenroulement négatif, nous avons construit un mutant conditionnel topA rnhA gyrB(Ts) avec l’expression inductible de la RNase HI à partir d’un plasmide. Nous avons trouvé que l’ADN des cellules de ce mutant était excessivement relâché au lieu d'être hypersurenroulé négativement en conditions de pénurie de RNase HI. La relaxation de l’ADN a été montrée comme étant indépendante de l'activité de la topoisomérase IV. Les cellules du triple mutant topA rnhA gyrB(Ts) forment de très longs filaments remplis d’ADN, montrant ainsi un défaut de ségrégation des chromosomes. La surproduction de la topoisomérase III (topB), une enzyme qui peut effectuer la décaténation de l’ADN, a corrigé les problèmes de ségrégation sans toutefois restaurer le niveau de surenroulement de l’ADN. Nous avons constaté que des extraits protéiques du mutant topA rnhA gyrB(Ts) pouvaient inhiber l’activité de surenroulement négatif de la gyrase dans des extraits d’une souche sauvage, suggérant ainsi que la pénurie de RNase HI avait déclenché une réponse cellulaire d’inhibition de cette activité de la gyrase. De plus, des expériences in vivo et in vitro ont montré qu’en absence de RNase HI, l’activité ATP-dépendante de surenroulement négatif de la gyrase était inhibée, alors que l’activité ATP-indépendante de cette enzyme demeurait intacte. Des suppresseurs extragéniques du défaut de croissance du triple mutant topA rnhA gyrB(Ts) qui corrigent également les problèmes de surenroulement et de ségrégation des chromosomes ont pour la plupart été cartographiés dans des gènes impliqués dans la réplication de l’ADN, le métabolisme des R-loops, ou la formation de fimbriae. La deuxième partie de ce projet avait pour but de comprendre les rôles des topoisomérases de type IA (topoisomérase I et topoisomérase III) dans la ségrégation et la stabilité du génome de Escherichia coli. Pour étudier ces rôles, nous avons utilisé des approches de génétique combinées avec la cytométrie en flux, l’analyse de type Western blot et la microscopie. Nous avons constaté que le phénotype Par- et les défauts de ségrégation des chromosomes d’un mutant gyrB(Ts) avaient été corrigés en inactivant topA, mais uniquement en présence du gène topB. En outre, nous avons démontré que la surproduction de la topoisomérase III pouvait corriger le phénotype Par- du mutant gyrB(Ts) sans toutefois corriger les défauts de croissance de ce dernier. La surproduction de topoisomérase IV, enzyme responsable de la décaténation des chromosomes chez E. coli, ne pouvait pas remplacer la topoisomérase III. Nos résultats suggèrent que les topoisomérases de type IA jouent un rôle important dans la ségrégation des chromosomes lorsque la gyrase est inefficace. Pour étudier le rôle des topoisomérases de type IA dans la stabilité du génome, la troisième partie du projet, nous avons utilisé des approches génétiques combinées avec des tests de « spot » et la microscopie. Nous avons constaté que les cellules déficientes en topoisomérase I avaient des défauts de ségrégation de chromosomes et de croissance liés à un excès de surenroulement négatif, et que ces défauts pouvaient être corrigés en inactivant recQ, recA ou par la surproduction de la topoisomérase III. Le suppresseur extragénique oriC15::aph isolé dans la première partie du projet pouvait également corriger ces problèmes. Les cellules déficientes en topoisomérases de type IA formaient des très longs filaments remplis d’ADN d’apparence diffuse et réparti inégalement dans la cellule. Ces phénotypes pouvaient être partiellement corrigés par la surproduction de la RNase HI ou en inactivant recA, ou encore par des suppresseurs isolés dans la première partie du projet et impliques dans le cSDR (dnaT18::aph et rne59::aph). Donc, dans E. coli, les topoisomérases de type IA jouent un rôle dans la stabilité du génome en inhibant la réplication inappropriée à partir de oriC et de R-loops, et en empêchant les défauts de ségrégation liés à la recombinaison RecA-dépendante, par leur action avec RecQ. Les travaux rapportés ici révèlent que la réplication inappropriée et dérégulée est une source majeure de l’instabilité génomique. Empêcher la réplication inappropriée permet la ségrégation des chromosomes et le maintien d’un génome stable. La RNase HI et les topoisomérases de type IA jouent un rôle majeur dans la prévention de la réplication inappropriée. La RNase HI réalise cette tâche en modulant l’activité de surenroulement ATP-dependante de la gyrase, et en empêchant la réplication à partir des R-loops. Les topoisomérases de type IA assurent le maintien de la stabilité du génome en empêchant la réplication inappropriée à partir de oriC et des R-loops et en agissant avec RecQ pour résoudre des intermédiaires de recombinaison RecA-dépendants afin de permettre la ségrégation des chromosomes.

Elucidating the crosstalk between condensin subunits and its relevance in chromosome condensation

ADN subit une série de transformations structurelles complexes au cours de la division cellulaire, ce qui entraîne dans son compactage chromosomes mitotiques par un processus appelé la condensation des chromosomes. Le complexe de condensine pentamérique est fortement impliqué comme un effecteur majeur de ce phénomène. Il s'agit d'un complexe protéine de sous-unités multiples avec deux sous-unités catalytiques [SMC- Structural Maintenance of Chromosomes] et de trois sous-unités de régulation, hautement conservés de la levure à l'homme. Le complexe de condensine dans Saccharomyces cerevisiae est constitué de deux sous-unités de SMC [Smc2 et Smc4] et trois protéines non réglementaires [Brn1, Ycs4, Ycg1]. Malgré son importance, le mécanisme d'action de condensine reste largement inconnu. Par conséquent, l'objectif de cette recherche est de comprendre le mécanisme d'action de condensine et comment elle est affectée par l'interaction entre ses sous-unités réglementaires et non-réglementaires. Cette thèse identifie quatre morphologies dépendants du cycle cellulaire distincts du locus d'ADNr. Cette transformation du phénotype ADNr de G1 à la mitose dépend condensine. Afin de déterminer le rôle de l'interaction entre les sous-unités catalytiques et réglementaires de condensine dans la régulation du complexe condensine, nous avons identifié six résidus positifs sur l'extrémité C-terminale de BRN1 qui affectent la formation du complexe condensine, l'activité de la condensation et l'interaction avec tubuline, ce qui suggère que ces résidus ont un rôle dans la régulation de condensine. Ensemble, nos résultats suggèrent un modèle de règlement du condensine par l'interaction entre les sous-unités de condensine.

In vitro effect of deoxynivalenol (DON) mycotoxin on porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication.

Deoxynivalenol (DON) is a mycotoxin produced by Fusarium spp. Among monogastric farm animals, swine are the most susceptible to DON as it markedly reduces feed intake and decreases weight gain. DON has also been shown to increase susceptibility to viral infections; therefore the objective of this study was to investigate in vitro impact of DON on porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Permissive cells were infected or not with PRRSV and were treated with increasing concentrations of DON. Cell survival and mortality were evaluated by determining the number of viable cells with a tetrazolium compound and by measuring lactate dehydrogenase (LDH) release, respectively. Virus titration and antiviral cytokines mRNA expression were evaluated by quantitative PCR. DON significantly affected the survival of noninfected cells in a dose dependent manner. However, DON concentrations between 140 and 280 significantly increased the survival of cells infected with PRRSV. These concentrations significantly decreased PRRSV replication by inducing a pro-inflammatory cytokines environment and an early activation of apoptosis, which in turn seem to interrupt viral replication. For the first time, this study showed that DON had significant effects on the survival of PRRSV infected cells and on virus replication, in a dose dependent manner.

Identification of a new cell line permissive to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection and replication which is phenotypically distinct from MARC-145 cell line

Background Airborne transmitted pathogens, such as porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), need to interact with host cells of the respiratory tract in order to be able to enter and disseminate in the host organism. Pulmonary alveolar macrophages (PAM) and MA104 derived monkey kidney MARC-145 cells are known to be permissive to PRRSV infection and replication and are the most studied cells in the literature. More recently, new cell lines developed to study PRRSV have been genetically modified to make them permissive to the virus. The SJPL cell line origin was initially reported to be epithelial cells of the respiratory tract of swine. Thus, the goal of this study was to determine if SJPL cells could support PRRSV infection and replication in vitro. Results The SJPL cell growth was significantly slower than MARC-145 cell growth. The SJPL cells were found to express the CD151 protein but not the CD163 and neither the sialoadhesin PRRSV receptors. During the course of the present study, the SJPL cells have been reported to be of monkey origin. Nevertheless, SJPL cells were found to be permissive to PRRSV infection and replication even if the development of the cytopathic effect was delayed compared to PRRSV-infected MARC-145 cells. Following PRRSV replication, the amount of infectious viral particles produced in SJPL and MARC-145 infected cells was similar. The SJPL cells allowed the replication of several PRRSV North American strains and were almost efficient as MARC-145 cells for virus isolation. Interestingly, PRRSV is 8 to 16 times more sensitive to IFNα antiviral effect in SJPL cell in comparison to that in MARC-145 cells. PRRSV induced an increase in IFNβ mRNA and no up regulation of IFNα mRNA in both infected cell types. In addition, PRRSV induced an up regulation of IFNγ and TNF-α mRNAs only in infected MARC-145 cells. Conclusions In conclusion, the SJPL cells are permissive to PRRSV. In addition, they are phenotypically different from MARC-145 cells and are an additional tool that could be used to study PRRSV pathogenesis mechanisms in vitro.

Potential use of a recombinant replication-defective adenovirus vector carrying the C-terminal portion of the P97 adhesin protein as a vaccine against Mycoplasma hyopneumoniae in swine.

Mycoplasma hyopneumoniae causes severe economic losses to the swine industry worldwide and the prevention of its related disease, enzootic porcine pneumonia, remains a challenge. The P97 adhesin protein of M. hyopneumoniae should be a good candidate for the development of a subunit vaccine because antibodies produced against P97 could prevent the adhesion of the pathogen to the respiratory epithelial cells in vitro. In the present study, a P97 recombinant replication-defective adenovirus (rAdP97c) subunit vaccine efficiency was evaluated in pigs. The rAdP97c vaccine was found to induce both strong P97 specific humoral and cellular immune responses. The rAdP97c vaccinated pigs developed a lower amount of macroscopic lung lesions (18.5 ± 9.6%) compared to the unvaccinated and challenged animals (45.8 ± 11.5%). rAdP97c vaccine reduced significantly the severity of inflammatory response and the amount of M. hyopneumoniae in the respiratory tract. Furthermore, the average daily weight gain was slightly improved in the rAdP97c vaccinated pigs (0.672 ± 0.068 kg/day) compared to the unvaccinated and challenged animals (0.568 ± 0.104 kg/day). A bacterin-based commercial vaccine (Suvaxyn® MH-one) was more efficient to induce a protective immune response than rAdP97c even if it did not evoke a P97 specific immune response. These results suggest that immunodominant antigens other than P97 adhesin are also important in the induction of a protective immune response and should be taken into account in the future development of M. hyopneumoniae subunit vaccines.

Actinobacillus pleuropneumoniae induces SJPL cell cycle arrest in G2/M-phase and inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication

Background: Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is one of the most important pathogens in the swine industry and causes important economic losses. No effective antiviral drugs against it are commercially available. We recently reported that the culture supernatant of Actinobacillus pleuropneumoniae, the porcine pleuropneumonia causative agent, has an antiviral activity in vitro against PRRSV in SJPL cells. Objectives of this study were (i) to identify the mechanism behind the antiviral activity displayed by A. pleuropneumoniae and (ii) to characterize the active molecules present in the bacterial culture supernatant. Methods: Antibody microarray analysis was used in order to point out cellular pathways modulated by the A. pleuropneumoniae supernatant. Subsequent, flow cytometry analysis and cell cycle inhibitors were used to confirm antibody microarray data and to link them to the antiviral activity of the A. pleuropneumoniae supernatant. Finally, A. pleuropneumoniae supernatant characterization was partially achieved using mass spectrometry. Results: Using antibody microarray, we observed modulations in G2/M-phase cell cycle regulation pathway when SJPL cells were treated with A. pleuropneumoniae culture supernatant. These modulations were confirmed by a cell cycle arrest at the G2/M-phase when cells were treated with the A. pleuropneumoniae culture supernatant. Furthermore, two G2/M-phase cell cycle inhibitors demonstrated the ability to inhibit PRRSV infection, indicating a potential key role for PRRSV infection. Finally, mass spectrometry lead to identify two molecules (m/z 515.2 and m/z 663.6) present only in the culture supernatant. Conclusions: We demonstrated for the first time that A. pleuropneumoniae is able to disrupt SJPL cell cycle resulting in inhibitory activity against PRRSV. Furthermore, two putative molecules were identified from the culture supernatant. This study highlighted the cell cycle importance for PRRSV and will allow the development of new prophylactic or therapeutic approaches against PRRSV.

Transient high level mammalian reovirus replication in a bat epithelial cell line occurs without cytopathic effect

Mammalian reoviruses exhibit a large host range and infected cells are generally killed; however, most studies examined only a few cell types and host species, and are probably not representative of all possible interactions between virus and host cell. Many questions thus remain concerning the nature of cellular factors that affect viral replication and cell death. In the present work, it was observed that replication of the classical mammalian reovirus serotype 3 Dearing in a bat epithelial cell line, Tb1.Lu, does not result in cell lysis and is rapidly reduced to very low levels. Prior uncoating of virions by chymotrypsin treatment, to generate infectious subviral particles, increased the initial level of infection but without any significant effect on further viral replication or cell survival. Infected cells remain resistant to virus reinfection and secrete an antiviral factor, most likely interferon, that is protective against the unrelated encephalomyocarditis virus. Although, the transformed status of a cell is believed to promote reovirus replication and viral “oncolysis”, resistant Tb1.Lu cells exhibit a classical phenotype of transformed cells by forming colonies in semisolid soft agar medium. Further transduction of Tb.Lu cells with a constitutively-active Ras oncogene does not seem cell growth or reovirus effect on these cells. Infected Tb1.Lu cells can produce low-level of infectious virus for a long time without any apparent effect, although these cells are resistant to reinfection. The results suggest that Tb1.Lu cells can mount an unusual antiviral response. Specific properties of bat cells may thus be in part responsible for the ability of the animals to act as reservoirs for viruses in general and for novel reoviruses in particular. Their peculiar resistance to cell lysis also makes Tb1.Lu cells an attractive model to study the cellular and viral factors that determine the ability of reovirus to replicate and destroy infected cells.