Histone H2B-R95A mutant identifies the pheromone pathway that signals cell cycle arrest during rapamycin response

La rapamycine est un immunosuppresseur utilisé pour traiter plusieurs types de maladies dont le cancer du rein. Son fonctionnement par l’inhibition de la voie de Tor mène à des changements dans des processus physiologiques, incluant le cycle cellulaire. Chez Saccharomyces cerevisiae, la rapamycine conduit à une altération rapide et globale de l’expression génique, déclenchant un remodelage de la chromatine. Nous proposons que les modifications des histones peuvent jouer un rôle crucial dans le remodelage de la chromatine en réponse à la rapamycine. Notre objectif principal est d’identifier d’une banque de mutants d’histone les variantes qui vont échouer à répondre à la rapamycine dans une tentative de réaliser une caractérisation des modifications d’histone critiques pour la réponse à cette drogue. Ainsi, nous avons réalisé un criblage d’une banque de mutants d’histone et identifié plusieurs mutants d‘histone dont la résistance à la rapamycine a été altérée. Nous avons caractérisé une de ces variantes d’histone, à savoir H2B, qui porte une substitution de l’alanine en arginine en position 95 (H2B-R95A) et démontré que ce mutant est extrêmement résistant à la rapamycine, et non à d’autres drogues. Des immunoprécipitations ont démontré que H2B-R95A est défectueux pour former un complexe avec Spt16, un facteur essentiel pour la dissociation de H2A et H2B de la chromatine, permetant la réplication et la transcription par les ADN et ARN polymérases, respectivement. Des expériences de ChIP-Chip et de micropuce ont démontré que l’arginine 95 de H2B est requise pour recruter Spt16 afin de permettre l’expression d’une multitude de gènes, dont certains font partie de la voie des phéromones. Des évidences seront présentées pour la première fois démontrant que la rapamycine peut activer la voie des phéromones et qu’une défectuosité dans cette voie cause la résistante à cette drogue.

Nouvelles stratégies pour l’analyse des cyanotoxines par spectrométrie de masse

Les cyanobactéries ont une place très importante dans les écosystèmes aquatiques et un nombre important d’espèces considéré comme nuisible de par leur production de métabolites toxiques. Ces cyanotoxines possèdent des propriétés très variées et ont souvent été associées à des épisodes d’empoisonnement. L’augmentation des épisodes d’efflorescence d’origine cyanobactériennes et le potentiel qu’ils augmentent avec les changements climatiques a renchéri l’intérêt de l’étude des cyanobactéries et de leurs toxines. Considérant la complexité chimique des cyanotoxines, le développement de méthodes de détection simples, sensibles et rapides est toujours considéré comme étant un défi analytique. Considérant ces défis, le développement de nouvelles approches analytiques pour la détection de cyanotoxines dans l’eau et les poissons ayant été contaminés par des efflorescences cyanobactériennes nuisibles a été proposé. Une première approche consiste en l’utilisation d’une extraction sur phase solide en ligne couplée à une chromatographie liquide et à une détection en spectrométrie de masse en tandem (SPE-LC-MS/MS) permettant l’analyse de six analogues de microcystines (MC), de l’anatoxine (ANA-a) et de la cylindrospermopsine (CYN). La méthode permet une analyse simple et rapide et ainsi que la séparation chromatographique d’ANA-a et de son interférence isobare, la phénylalanine. Les limites de détection obtenues se trouvaient entre 0,01 et 0,02 μg L-1 et des concentrations retrouvées dans des eaux de lacs du Québec se trouvaient entre 0,024 et 36 μg L-1. Une deuxième méthode a permis l’analyse du b-N-méthylamino-L-alanine (BMAA), d’ANA-a, de CYN et de la saxitoxine (STX) dans les eaux de lac contaminés. L’analyse de deux isomères de conformation du BMAA a été effectuée afin d’améliorer la sélectivité de la détection. L’utilisation d’une SPE manuelle permet la purification et préconcentration des échantillons et une dérivatisation à base de chlorure de dansyle permet une chromatographie simplifiée. L’analyse effectuée par LC couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) et des limites de détections ont été obtenues entre 0,007 et 0,01 µg L-1. Des échantillons réels ont été analysés avec des concentrations entre 0,01 et 0,3 µg L-1 permettant ainsi la confirmation de la présence du BMAA dans les efflorescences de cyanobactéries au Québec. Un deuxième volet du projet consiste en l’utilisation d’une technologie d’introduction d’échantillon permettant des analyses ultra-rapides (< 15 secondes/échantillons) sans étape chromatographique, la désorption thermique à diode laser (LDTD) couplée à l’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et à la spectrométrie de masse (MS). Un premier projet consiste en l’analyse des MC totales par l’intermédiaire d’une oxydation de Lemieux permettant un bris de la molécule et obtenant une fraction commune aux multiples congénères existants des MC. Cette fraction, le MMPB, est analysée, après une extraction liquide-liquide, par LDTD-APCI-MS/MS. Une limite de détection de 0,2 µg L-1 a été obtenue et des concentrations entre 1 et 425 µg L-1 ont été trouvées dans des échantillons d’eau de lac contaminés du Québec. De plus, une analyse en parallèle avec des étalons pour divers congénères des MC a permis de suggérer la possible présence de congénères ou d’isomères non détectés. Un deuxième projet consiste en l’analyse directe d’ANA-a par LDTD-APCI-HRMS pour résoudre son interférence isobare, la phénylalanine, grâce à la détection à haute résolution. La LDTD n’offre pas de séparation chromatographique et l’utilisation de la HRMS permet de distinguer les signaux d’ANA-a de ceux de la phénylalanine. Une limite de détection de 0,2 µg L-1 a été obtenue et la méthode a été appliquée sur des échantillons réels d’eau avec un échantillon positif en ANA-a avec une concentration de 0,21 µg L-1. Finalement, à l’aide de la LDTD-APCI-HRMS, l’analyse des MC totales a été adaptée pour la chair de poisson afin de déterminer la fraction libre et liée des MC et comparer les résultats avec des analyses conventionnelles. L’utilisation d’une digestion par hydroxyde de sodium précédant l’oxydation de Lemieux suivi d’une purification par SPE a permis d’obtenir une limite de détection de 2,7 µg kg-1. Des échantillons de poissons contaminés ont été analysés, on a retrouvé des concentrations en MC totales de 2,9 et 13,2 µg kg-1 comparativement aux analyses usuelles qui avaient démontré un seul échantillon positif à 2 µg kg-1, indiquant la possible présence de MC non détectés en utilisant les méthodes conventionnelles.

Biology and characterisation of polyalanine as an emerging pathological marker

Dix-huit maladies humaines graves ont jusqu'ici été associées avec des expansions de trinucléotides répétés (TNR) codant soit pour des polyalanines (codées par des codons GCN répétés) soit pour des polyglutamines (codées par des codons CAG répétés) dans des protéines spécifiques. Parmi eux, la dystrophie musculaire oculopharyngée (DMOP), l’Ataxie spinocérébelleuse de type 3 (SCA3) et la maladie de Huntington (MH) sont des troubles à transmission autosomale dominante et à apparition tardive, caractérisés par la présence d'inclusions intranucléaires (IIN). Nous avons déjà identifié la mutation responsable de la DMOP comme étant une petite expansion (2 à 7 répétitions supplémentaires) du codon GCG répété du gène PABPN1. En outre, nous-mêmes ainsi que d’autres chercheurs avons identifié la présence d’événements de décalage du cadre de lecture ribosomique de -1 au niveau des codons répétés CAG des gènes ATXN3 (SCA3) et HTT (MH), entraînant ainsi la traduction de codons répétés hybrides CAG/GCA et la production d'un peptide contenant des polyalanines. Or, les données observées dans la DMOP suggèrent que la toxicité induite par les polyalanines est très sensible à leur quantité et leur longueur. Pour valider notre hypothèse de décalage du cadre de lecture dans le gène ATXN3 dans des modèles animaux, nous avons essayé de reproduire nos constatations chez la drosophile et dans des neurones de mammifères. Nos résultats montrent que l'expression transgénique de codons répétés CAG élargis dans l’ADNc de ATXN3 conduit aux événements de décalage du cadre de lecture -1, et que ces événements sont néfastes. À l'inverse, l'expression transgénique de codons répétés CAA (codant pour les polyglutamines) élargis dans l’ADNc de ATXN3 ne conduit pas aux événements de décalage du cadre de lecture -1, et n’est pas toxique. Par ailleurs, l’ARNm des codons répétés CAG élargis dans ATXN3 ne contribue pas à la toxicité observée dans nos modèles. Ces observations indiquent que l’expansion de polyglutamines dans nos modèles drosophile et de neurones de mammifères pour SCA3 ne suffit pas au développement d'un phénotype. Par conséquent, nous proposons que le décalage du cadre de lecture ribosomique -1 contribue à la toxicité associée aux répétitions CAG dans le gène ATXN3. Pour étudier le décalage du cadre de lecture -1 dans les maladies à expansion de trinucléotides CAG en général, nous avons voulu créer un anticorps capable de détecter le produit présentant ce décalage. Nous rapportons ici la caractérisation d’un anticorps polyclonal qui reconnaît sélectivement les expansions pathologiques de polyalanines dans la protéine PABPN1 impliquée dans la DMOP. En outre, notre anticorps détecte également la présence de protéines contenant des alanines dans les inclusions intranucléaires (IIN) des échantillons de patients SCA3 et MD.

New insights into small molecules inhibitors and protein-protein interactions of VirB8 : a critical conserved component of the type IV secretion system.

Les systèmes bactériens de sécrétion de type IV (T4SS) sont constitués d’un ensemble de 8 à 12 protéines conservées. Ces dernières sont utilisées lors de la translocation de protéines, la translocation de complexes ADN-protéines mais aussi pour le transport de ces derniers au travers de la membrane cellulaire. Les T4SS, en tant que facteurs de virulence pour beaucoup de pathogènes comme Brucella suis, sont donc d’excellents modèles cibles pour le développement de médicaments d’antivirulence. Ces médicaments, en privant le pathogène de son facteur essentiel de virulence : le T4SS, constituent une alternative ou encore une amélioration des traitements antibiotiques utilisés actuellement. VirB8, un facteur d’assemblage conservé dans le T4SS, forme des dimères qui sont importants pour la fonction des T4SS dans ces pathogènes. De par ses interactions multiples, VirB8 est un excellent modèle pour l’analyse des facteurs d’assemblage mais aussi en tant que cible de médicaments qui empêcheraient son interaction avec d’autres protéines et qui, in fine, désarmeraient les bactéries en les privant de leur fonctions essentielles de virulence. À ce jour, nous savons qu’il existe un équilibre monomère-dimère et un processus d’homodimerization de VirB8 dont l’importance est vitale pour la fonctionnement biologique des T4SSs. En se basant sur des essais quantitatifs d’interaction, nous avons identifié (i) des sites potentiels d’interaction avec d’autres protéines VirB du T4SS mais aussi (ii) isolé des petites molécules inhibitrices afin de tester la fonction protéique de VirB8. Afin de déterminer les acides aminés importants pour l’hétérodimérization de VirB8 avec VirB10, nous avons effectué des expériences de mutagenèse aléatoire, de phage display et d’arrimage moléculaire in silico. Ces expériences ont démontré l’importance de trois acides aminés localisés sur le feuillet β : R160, S162, T164 et I165. Ces derniers seraient importants pour l’association de VirB8 avec VirB10 étant donné que leur mutagenèse entraine une diminution de la formation du complexe VirB8-VirB10. L’objectif actuel de notre projet de recherche est de pouvoir mieux comprendre mais aussi d’évaluer le rôle de VirB8 dans l’assemblage du T4SS. Grace à un méthode de criblage adaptée à partir de la structure de VirB8, nous avons pu identifié une petite molécule inhibitrice BAR-068, qui aurait un rôle prometteur dans l’inhibition du T4SS. Nous avons utilisé la spectroscopie par fluorescence, l’essai à deux hybrides, le cross-linking et la cristallographie afin de déterminer le mécanisme d'interaction existant entre VirB8 et BAR-068. Ces travaux pourraient permettre de nombreuses avancées, notamment en termes de compréhension des mécanismes d’inhibition du T4SS. Notre objectif ultime est de pouvoir caractériser la séquence d’évènements essentiels à l’assemblage et au fonctionnement du T4SS. De manière globale, notre projet de recherche permettrait de révéler les grands principes d’assemblage des protéines membranaires, les processus de sécrétion de protéines chez les bactéries mais aussi de proposer une nouvelle stratégie lors du développement de drogues antimicrobiennes.

Implication du domaine intracellulaire du précurseur de la protéine amyloïde dans la modulation de la plasticité synaptique

Alzheimer's disease is the most common type of dementia in the elderly; it is characterized by early deficits in learning and memory formation and ultimately leads to a generalised loss of higher cognitive functions. While amyloid beta (Aβ) and tau are traditionally associated with the development of Alzheimer disease, recent studies suggest that other factors, like the intracellular domain (APP-ICD) of the amyloid precursor protein (APP), could play a role. In this study, we investigated whether APP-ICD could affect synaptic transmission and synaptic plasticity in the hippocampus, which is involved in learning and memory processes. Our results indicated that overexpression of APP-ICD in hippocampal CA1 neurons leads to a decrease in evoked AMPA-receptor and NMDA-receptor dependent synaptic transmission. Our study demonstrated that this effect is specific for APP-ICD since its closest homologue APLP2-ICD did not reproduce this effect. In addition, APP-ICD blocks the induction of long term potentiation (LTP) and leads to increased of expression and facilitated induction of long term depression (LTD), while APLP2-ICD shows neither of these effects. Our study showed that this difference observed in synaptic transmission and plasticity between the two intracellular domains resides in the difference of one alanine in the APP-ICD versus a proline in the APLP2-ICD. Exchanging this critical amino-acid through point-mutation, we observed that APP(PAV)-ICD had no longer an effect on synaptic plasticity. We also demonstrated that APLP2(AAV)-ICD mimic the effect of APP-ICD in regards of facilitated LTD. Next we showed that the full length APP-APLP2-APP (APP with a substitution of the Aβ component for its homologous APLP2 part) had no effect on synaptic transmission or synaptic plasticity when compared to the APP-ICD. However, by activating caspase cleavage prior to induction of LTD or LTP, we observed an LTD facilitation and a block of LTP with APP-APLP2-APP, effects that were not seen with the full length APLP2 protein. APP is phosphorylated at threonine 668 (Thr668), which is localized directly after the aforementioned critical alanine and the caspase cleavage site in APP-APLP2-APP. Mutating this Thr668 for an alanine abolishes the effects on LTD and restores LTP induction. Finally, we showed that the facilitation of LTD with APP-APLP2-APP involves ryanodine receptor dependent calcium release from intracellular stores. Taken together, we propose the emergence of a new APP intracellular domain, which plays a critical role in the regulation of synaptic plasticity and by extension, could play a role in the development of memory loss in Alzheimer’s disease.