Le CpG et le poly(I:C) agissent en synergie avec le trastuzumab contre le cancer du sein HER2+

Chez la souris, la thérapie anti-HER2 est dépendante de la présence de cellules T CD8+IFN-γ+ et des réponses IFN de type I. Ces IFN sont induits par les TLRs suite à la reconnaissance de signaux de danger, appelés PAMPs et DAMPs. Les TLR-3 et TLR-9 sont tous deux de bons inducteurs d’IFN de type I et sont également capable d’agir en synergie afin d’augmenter les niveaux d’IFN-γ, de TNF-α et d’IL-12. Notre hypothèse fut que la stimulation de ces deux TLRs mènerait à l’amélioration de l’activité anti-tumorale du trastuzumab via le recrutement et l’activation des cellules immunitaires. Nos buts furent de confirmer le potentiel thérapeutique de la combinaison de l’anticorps anti-HER2, de l’agoniste de TLR-3, le poly(I:C), et de l’agoniste de TLR-9, le CpG ODN. Des études in vivo et in vitro nous ont permis de découvrir une synergie entre ces agents qui résulte en une cytotoxicité ciblée plus efficace. De plus, cette thérapie s’avéra efficace chez des modèles CD8-dépendants et CD8-indépendents. Les souris purent rejeter leur tumeur et demeurer sains plusieurs semaines après l’arrêt des injections. Ces souris étaient également protégées lors d’un challenge, soulignant ainsi la présence d’une immunité mémoire. Nous avons aussi découvert que l’administration combine de trastuzumab des deux agonistes de TLRs mène à des réponses systémiques. Des études de déplétion confirmèrent que les cellules T CD8+ sont cruciales pour la protection à long terme des animaux, mais que les pDC sont moins impliquées que ce que l’on pourrait croire. Leur absence n’a que modestement affecté les effets de notre thérapie. À l’opposé, les cellules NK sont d’importants médiateurs des effets thérapeutiques. Des expériences d’ADCC ont révélé que le CpG ODN et poly(I:C) ont tous deux la capacité d’améliorer les fonctions des cellules NK, mais que la stimulation simultanée des TLR-3 et TLR-9 permet de maximiser les effets bénéfiques du trastuzumab. De la même manière, l’addition de CpG ODN et de poly(I:C) aux anticorps anti-HER2 a permis d’augmenter les réponses pro-inflammatoires, plus spécifiquement l’IFN-γ, le TNF-α, l’IP-10 et l’IL-12.

Assemblage oligomérique des récepteurs couplés aux protéines G avec les RAMPs

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent la plus grande classe de récepteurs membranaires impliqués dans la transmission des signaux extracellulaires. Traditionnellement, la transmission de la signalisation par les RCPGs implique l’activation d’une protéine G hétéro-trimérique qui pourra à son tour moduler l’activité de divers effecteurs intracellulaires. Ce schéma classique de signalisation s’est complexifié au fils des années et l’on sait maintenant qu’en plus d’interagir avec les protéines G, les RCPGs s’associent avec une panoplie d’autres protéines afin de transmettre adéquatement les signaux extracellulaires. En particulier, la découverte d’une famille de protéines transmembranaires modulant la fonction des RCPGs, baptisées protéines modifiant l’activité des récepteurs (« receptor activity-modifying proteins » ; RAMPs), a changé la façon de concevoir la signalisation par certains RCPGs. Dans le cas du récepteur similaire au récepteur de la calcitonine (« calcitonin-like receptor » ; CLR), l’association avec les RAMPs permet l’acheminement à la surface cellulaire du récepteur tout en modulant ses propriétés pharmacologiques. Lorsqu’il est associé avec RAMP1, le CLR fonctionne comme un récepteur du peptide relié au gène de la calcitonine (« calcitonin gene-related peptide » ; CGRP), alors qu’il devient un récepteur de l’adrénomedulline lorsqu’il interagit avec RAMP2 ou RAMP3. D’autre part, en plus d’interagir avec des protéines accessoires transmembranaires telles les RAMPs, les RCPGs peuvent aussi s’associer entre eux pour former des oligomères de récepteurs. Dans cette thèse, nous nous sommes penchés sur les interactions entre les RCPGs et les RAMPs, et plus particulièrement sur l’interrelation entre ce type d’association RCPG/RAMP et l’assemblage en oligomères de récepteurs, en utilisant le récepteur du CGRP comme modèle d’étude. Une première étude nous a tout d’abord permis de confirmer l’interaction entre le récepteur CLR et RAMP1, dans un contexte de cellules vivantes. Nous avons démontré que ce complexe CLR/RAMP1 active la protéine G et recrute la protéine de signalisation -arrestine suite à une stimulation par le CGRP. Ensuite, nous avons déterminé que même s’il doit obligatoirement former un hétéro-oligomère avec les RAMPs pour être actif, le CLR conserve malgré tout sa capacité à interagir avec d’autres RCPGs. En plus d’observer la présence d’homo-oligomère de CLR, nous avons constaté que tout comme les RCPGs, les RAMPs peuvent eux-aussi s’associer entre eux pour former des complexes oligomériques pouvant comprendre différents sous-types (RAMP1/RAMP2 et RAMP1/RAMP3). Cette observation de la présence d’homo-oligomères de CLR et de RAMP1, nous a amené à nous questionner sur la stœchiométrie d’interaction du complexe CLR/RAMP1. Dans une deuxième étude ayant pour but d’établir la composition moléculaire du récepteur CGRP1 in vivo, nous avons développé une nouvelle approche permettant l’étude de l’interaction entre trois protéines dans un contexte de cellules vivantes. Cette technique baptisée BRET/BiFC, est basée sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence entre un donneur luminescent, la Renilla luciférase, et un accepteur fluorescent, la protéine fluorescente jaune (YFP), reconstituée suite au ré-assemblage de ces deux fragments. En utilisant cette approche, nous avons pu déterminer que le récepteur CGRP1 est constitué d’un homo-oligomère de CLR interagissant avec un monomère de RAMP1. En démontrant un assemblage oligomérique asymétrique pour le récepteur CGRP1 à partir d’une nouvelle approche biophysique, nous croyons que les travaux présentés dans cette thèse ont contribué à élargir nos connaissances sur le fonctionnement de la grande famille des RCPGs, et seront utile à la poursuite des recherches sur les complexes protéiques impliqués dans la signalisation.

Innate immunity genes as determinants of resistance/susceptibility to human disease : studies in leukemia patients

La leucémie lymphoblastique aiguë des cellules Pré-B (B-ALL) reste le type de cancer le plus souvent diagnostiqué chez les enfants. Des études ont montré que des déterminants génétiques jouent un rôle important dans la susceptibilité/résistance au développement de ce cancer. À cet égard, les gènes Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor (KIR) sont d'une importance particulière. Ces gènes sont fortement polymorphiques et codent pour des récepteurs qui contrôlent l’activité fonctionnelle des cellules Natural Killer (NK). Notre hypothèse est que les gènes activateurs des KIR s’associent avec la résistance innée pour développer la B-ALL. Afin d'évaluer cette hypothèse, nous avons entrepris une étude de cas-contrôles chez des enfants canadiens-français dans laquelle nous avons utilisé l'ADN génomique de 100 patients atteints de B-ALL ainsi que l’ADN de 245 individus sains. La présence ou l'absence de chaque gène KIR a été détectée par PCR en utilisant des amorces de séquences spécifiques. Nous avons trouvé que la présence des gènes KIR activateurs est significativement diminuée chez les enfants leucémiques par rapport aux témoins. En outre, le nombre de ces gènes a aussi montré une association significative linéaire avec la résistance au développement d’une B-ALL. Cela suggère des effets additifs de ces gènes permettant de conférer une protection contre ce cancer. Ces résultats pourraient être utiles afin de déceler de façon précoce les enfants ayant un risque de développer cette leucémie. Enfin, des stratégies thérapeutiques basées sur les récepteurs KIR pourraient être envisagées et s'avérer utiles concernant le traitement de ce cancer chez les enfants.

Influence des facteurs immuno-modulateurs d'origine placentaire sur la différenciation et la maturation des cellules dendritiques plasmacytoïdes

Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont des cellules dendritiques spécialisées, aussi connues sous le nom de cellules productrices d’interféron-α (IFN-α). Les pDC jouent un rôle essentiel dans l’induction de la réponse immunitaire antivirale, en reconnaissant les antigènes viraux via les Toll-like receptors (TLR) 7 et 9. Toutefois, les pDC du sang de cordon sont incapables de produire de l’IFN-α en réponse à une stimulation du TLR9, mais leur maturation en cellules présentatrices d’antigènes est normale. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes intéressés aux effets des facteurs immuno-régulateurs sécrétés par le placenta sur la différenciation et la fonction des pDC. Nous avons analysé l’effet, seules ou en combinaison, de la progestérone (PG), de l'interleukine (IL)-10 et du tumor growth factor (TGF)-β sur la différenciation et la fonction des pDC. Nous démontrons qu’à des niveaux supra-physiologiques ces trois facteurs modulent la différenciation et la production d’IFN-α des pDC. À des niveaux observés dans le sang de cordon, ces facteurs ont peu d’impact sur les pDC lorsque utilisés individuellement. Toutefois lorsque utilisés en combinaison, ils diminuent la production d’IFN-α. Nous avons aussi démontré que la PG, l’IL-10 et le TGF-β n’induisent pas l’expression des micro-ARN 146a et 155 par les pDC. Finalement nous démontrons que les niveaux de ces molécules sont plus élevés dans le sang de cordon que dans le sang d’adulte. Nos résultats révèlent le rôle important des facteurs immuno-régulateurs sécrétés par le placenta sur la fonction des pDC et en conséquence, sur la réponse immunitaire fœtale et néonatale.

Le rôle du CD40 homodimère dans la réponse immunitaire

Le CD40 est une glycoprotéine transmembranaire de type I, appartenant à la famille des TNFRs, exprimée à la surface des cellules immunitaires, hématopoïétiques, vasculaires, épithéliales, et d’autres types de cellules, y compris les cellules tumorales. Le CD40 ne possédant pas de domaine kinase, pour induire un signal il interagit directement ou indirectement avec des protéines adaptatrices telles que les TRAFs et les JAKs. L’interaction du CD40 avec son principal ligand, le CD154, joue un rôle primordial dans la régulation de la réponse immunitaire et le maintien de l’homéostasie. L’activation du CD40 à la surface des cellules B augmente leur capacité de présentation d’antigène, en plus d’induire la prolifération, la commutation isotypique et l’apoptose. Les patients souffrant de mutations au niveau du gène codant pour le CD40 ou de son ligand sont immunosupprimés et sensibles à des infections opportunistes. Des études ont montré que le CD40 comme d’autres membres de la famille des TNFRs est capable de former des homodimères. Plus récemment, on a montré que la formation du CD40 homodimère est le résultat de son engagement sur les cellules B. En plus, cette homodimérisation du CD40 est importante pour la phosphorylation de l’Akt. L’interaction CD40/CD154 peut avoir un rôle direct dans l’immunothérapie par l’induction de l’apoptose de certaines cellules cancéreuses ou un rôle indirect en activant les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) afin d'augmenter l’efficacité de l’activation des cellules T cytotoxiques. Nos résultats montrent que l’induction de la mort cellulaire par le CD40 requiert la perméabilisation du lysosome, la libération de la cathepsine B, la présence de ROS et une interaction avec le TRAF6, cette mort cellulaire programmée est plus importante en présence de la forme monomérique du CD40, muté au niveau de la cystéine 238. Par ailleurs, l’homodimérisation du CD40 requerrait sa translocation vers les radeaux lipidiques et nécessiterait la présence des ROS. Cette homodimérisation du CD40 semble être importante pour l’activation des cellules B par le biais de l’induction de l’expression du CD23, CD69 et CD80. De plus, nos résultats montrent pour la première fois une implication du CD40 homodimère dans l’induction du CD23 par le biais du TLR4. Nos résultats soulignent l’importance du CD40 homodimère dans certaines voies de signalisation. Ainsi, ils mettent en évidence le rôle de la Cys-238 dans la coopération entre des récepteurs de la réponse immunitaire innée et adaptative. Toutes ces données permettraient une meilleure compréhension de certaines voies de signalisation impliquées dans plusieurs maladies auto-immunes et faisant objet de plusieurs essais thérapeutiques.

The role of the nuclear receptor Nr5a2 in ovulation in mice

Le récepteur nucléaire Nr5a2 est exprimé dans l’ovaire, plus spécifiquement dans les cellules de granulosa et lutéales. Une déplétion conditionnelle de Nr5a2 dans les cellules de granulosa au stade de follicule primaire par croisement de souris Nr5a2-flox et Amhr2-Cre (Nr5a2f/fAmhr2Cre/+) génère des problèmes au niveau de l’expansion du cumulus, de l’ovulation et de la lutéinisation. Ainsi, nous estimons que Nr5a2 régule les connexions intercellulaires dans le follicule ovarien via la connexine 43 (Cx43), une protéine de jonction impliquée dans l’expansion du cumulus. Le premier objectif de l’étude était de déterminer si l’absence d’expansion du cumulus chez les souris Amhr2Cre-cKO est liée à l’absence de communication intercellulaire adéquate entre les cellules de granulosa et de cumulus dans les follicules préovulatoires. À cette fin, des ovaires de souris immatures Amhr2Cre-cKO et non transgéniques ont été prélevés (n=3) après un traitement de superstimulation utilisant les gonadotropines eCG suivie de hCG afin d’induire l’ovulation. Nous avons ainsi démontré, par RT-PCR, une sous-expression de Cx43 avant et au moment du stimulus ovulatoire (0 h et 2 h) chez le groupe Amhr2Cre-cKO (P<0.01), ce qui pourrait mener à un problème dans l’acquisition de la compétence développementale de l’oocyte. D’un autre côté, au moment de l’ovulation (12 h), l’ARNm de Cx43 est surexprimé dans le groupe Amhr2Cre-cKO, ce qui pourrait prévenir les cellules du cumulus de se détacher l’une de l’autre. Nous avons ainsi conclu que Cx43 est un gène sous le contrôle de Nr5a2 et qu’une régulation erronée de ce gène est une cause possible du problème d’expansion du cumulus chez les souris Amhr2Cre-cKO. Afin d’examiner le rôle de Nr5a2 dans l’ovulation et la lutéinisation à différents stades de la maturation folliculaire, nous suggérons que Nr5a2 module la séquence temporelle des événements menant à l’ovulation. En croisant des souris Nr5a2-flox et Cyp19-Cre (Nr5a2f/fCyp19Cre/+), l’expression de Nr5a2 a été interrompue dans les cellules de granulosa des follicules antraux et préovulatoires. Aucune portée n’a été obtenue de ces souris (n=4) durant un essai d’accouplement de 6 mois. Chez les souris Cyp19Cre-cKO on remarque la présence de structures s’apparentant à des cellules de type lutéales et les femelles âgées d’un an présentent des kystes folliculaires hémorragiques et une hypertrophie de l’épithélium en surface de l’ovaire. Les deux modèles transgéniques démontrent donc une absence de l’expansion du cumulus et de l’ovulation. En conclusion, Nr5a2 semble réguler différemment la folliculogenèse et l’ovulation dans les cellules de granulosa des follicules primaires et antraux.

Role of receptor and non-receptor protein tyrosine kinases in vasoactive peptide-induced signaling

L'endothéline-1 (ET-1) et l'angiotensine II (Ang II) jouent un rôle important dans le maintien de la pression artérielle et l'homéostasie vasculaire. Une activité accrue de ces peptides vasoactifs est présumée contribuer au développement de pathologies vasculaires, telles que l'hypertension, l'athérosclérose, l'hypertrophie et la resténose. Ceci est causé par une activation excessive de plusieurs voies de signalisation hypertrophiques et prolifératives, qui incluent des membres de la famille des Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK), ainsi que la famille phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) / protéine kinase B (PKB). Bien que l'activation de ces voies de signalisation soit bien élucidée, les éléments en amont responsables de l'activation des MAPK et de la PKB, induite par l'ET-1 et Ang II, demeurent mal compris. Durant les dernières années, le concept de la transactivation de récepteurs et/ou non-récepteurs protéines tyrosine kinases (PTK) dans le déclenchement des événements de signalisation induits par les peptides vasoactifs a gagné beaucoup de reconnaissance. Nous avons récemment démontré que la PTK Insulin-like Growth Factor type-1 Receptor (IGF-1R) joue un rôle dans la transduction des signaux induits par l‟H2O2, menant à la phosphorylation de la PKB. Étant donné que les peptides vasoactifs génèrent des espèces réactives d'oxygène, telles que l‟H2O2 lors de leur signalisation, nous avons examiné le rôle de d‟IGF-1R dans la phosphorylation de la PKB et les réponses hypertrophiques dans les cellules muscle lisse vasculaires (CMLV) induites par l'ET-1 et Ang II. AG-1024, un inhibiteur spécifique de l'IGF-1R, a atténué la phosphorylation de la PKB induite à la fois par l'ET-1 et Ang II. Le traitement des CMLVs avec l‟ET-1 et Ang II a également induit une phosphorylation des résidus tyrosine dans les sites d'autophosphorylation d'IGF-1R, celle-ci a été bloquée par l‟AG-1024. En outre, l‟ET-1 et l‟Ang II on tous les deux provoqué la phosphorylation de c-Src, une PTK non-récepteur, bloqué par PP-2, inhibiteur spécifique de la famille Src. La PP-2 a également inhibé la phosphorylation de PKB et d‟IGF-1R induite par l‟ET-1 et l‟Ang II. De plus, la synthèse de protéines ainsi que d‟ADN, marqueurs de la prolifération cellulaire et de l'hypertrophie, ont également été atténuée par l‟AG-1024 et le PP-2. Bien que ce travail démontre le rôle de c-Src dans la phosphorylation PKB induite par l'ET-1 et Ang II, son rôle dans l'activation des MAPK induit par l'ET-1 dans les CMLVs reste controversé. Par conséquent, nous avons examiné l'implication de c-Src dans l'activation de ERK 1/2, JNK et p38MAPK, par l'ET-1 et Ang II, ainsi que leur capacité à régulariser l'expression du facteur de transcription Early growth transcription factor-1 « Egr-1 ». ET-1 et Ang II ont induit la phosphorylation de ERK 1/2, JNK et p38 MAPK, et ont amplifié l'expression d'Egr-1 dans les CMLVs. Cette augmentation de la phosphorylation des MAPK a été diminuée par la PP-2, qui a aussi atténué l'expression d'Egr-1 induite par l'ET-1 et l'Ang II. Une preuve supplémentaire du rôle de c-Src dans ce processus a été obtenue en utilisant des fibroblastes embryonnaires de souris déficientes en c-Src (Src -/- MEF). L'expression d'Egr-1, ainsi que l'activation des trois MAPKs par l'ET-1 ont été atténuées dans les cellules Src -/- par rapport au MEF exprimant des taux normaux Src. En résumé, ces données suggèrent que l'IGF-1R et c-Src PTK jouent un rôle essentiel dans la régulation de la phosphorylation de PKB et des MAPK dans l‟expression d'Egr-1, ainsi que dans les réponses hypertrophiques et prolifératives induites par l'ET-1 et Ang II dans les CMLVs.

Angiopoietine-like 2 : un facteur circulant pro-oxydant et pro-inflammatoire qui contribue au développement de l’athérosclérose

L’athérosclérose est une maladie vasculaire inflammatoire chronique qui se développe progressivement au cours de la vie. Les mécanismes impliqués sont complexes et la recherche de nouveaux candidats impliqués dans l'athérogénèse est toujours d'actualité. L’Angiopoietine-like 2 (Angptl2) est une protéine relativement peu connue, aux propriétés pro-angiogéniques et pro-inflammatoires, qui appartient par homologie à la grande famille des angiopoietines, mais dont le récepteur n'est pas encore clairement identifié. Les situations pathologiques dans lesquelles l’Angptl2 jouerait un rôle crucial sont diverses, mais sa contribution moléculaire dans le développement de l’athérosclérose est inconnue. Par differential display, nous avons initialement identifié l'Angptl2 comme étant surexprimée dans des cellules endothéliales sénescentes, isolées et cultivées à partir d'artères mammaires internes de patients athérosclérotiques ayant subi un pontage coronarien. Cette découverte a été la à base de mon projet, et mes objectifs ont été 1) de déterminer l'implication de l’Angptl2 vasculaire en présence de facteurs de risques tels que le tabagisme et la dyslipidémie, 2) de produire et de purifier une protéine recombinante fonctionnelle de l’Angptl2 afin d'identifier in vitro de nouvelles propriétés cellulaires de l'Angptl2 et 3) d'étudier in vivo le potentiel pro-athérogénique de l'Angptl2 recombinante dans un modèle murin de dyslipidémie sévère. Nous avons montré que l’Angptl2 est sécrétée préférentiellement dans des conditions pro-oxydantes et pro-inflammatoires, avec une augmentation de son expression endothéliale de l’ordre de 6 fois chez des patients coronariens fumeurs atteints de maladie pulmonaire obstructive chronique. Suite à ces résultats, nous avons émis l’hypothèse que l’Angptl2, en plus de ses fonctions pro-inflammatoires connues, possède des propriétés pro-oxydantes. Nous avons démontré que l’Angptl2 recombinante stimule en effet la production de radicaux libres dans des HUVEC en culture, via l’inhibition partielle de la voie cytoprotectrice antioxydante Nrf2/HO-1 et potentiellement via l'activation de kinase intracellulaire de type p38. A l'aide de souris dyslipidémiques LDLr-/-; hApoB-100+/+, nous avons démontré que le niveau d’Angptl2 plasmatique, vasculaire et dans les plaques athéromateuses, augmente parallèlement avec le développement de l’athérosclérose. De plus, une stimulation avec l’Angptl2 recombinante engendre chez ces souris une réponse inflammatoire évaluée par l’expression endothéliale de cytokines et de molécules d'adhésion et par l’infiltration de leucocytes sur l’endothélium vasculaire. Finalement, l’administration intraveineuse de la protéine recombinante d’Angptl2 pendant quatre semaines à des souris LDLr-/-; hApoB-100+/+ augmente de 10 fois l'expansion de la plaque athérosclérotique et double leur taux de cholestérol circulant. Nous avons aussi montré que chez des patients athérosclérotiques, l'Angptl2 plasmatique est 6 fois plus élevée que chez des sujets sains du même âge. Nos études semblent donc définir l’Angptl2 comme un facteur contribuant directement au développement de l'athérosclérose en favorisant la sénescence, l’inflammation et l’oxydation des cellules endothéliales. Ces propriétés pourraient globalement définir l'Angptl2, non seulement comme un nouveau biomarqueur circulant de l’athérosclérose, mais également comme l'un de ses promoteurs.