Réponse cellulaire pan-spécifique : analyse de la présentation d’antigènes conservés du virus de l’influenza

Les méthodes de vaccination actuelles contre l’influenza, axées sur la réponse à anticorps dirigée contre des antigènes hautement variables, nécessitent la production d’un vaccin pour chaque nouvelle souche. Le défi est maintenant de stimuler simultanément une réponse cellulaire pan-spécifique ciblant des antigènes conservés du virus, tel que la protéine de la matrice (M1) ou la nucléoprotéine (NP). Or, la présentation antigénique de ces protéines est peu définie chez l’humain. Nous avons analysé la présentation endogène par les complexes majeurs d’histocompatibilité de classes (CMH)-I et -II de M1 et de NP. Ainsi, les protéines M1 et NP ont été exprimées dans des cellules présentatrices d’antigènes (CPAs). Notamment, des épitopes de M1 et de NP endogènes peuvent être présentées par CMH-I et -II, ce qui résulte en une activation respectivement de lymphocytes T CD8+ et CD4+ précédemment isolés. Étant donné l’importance des lymphocytes T CD4+ dans la réponse cellulaire, nous avons cloné M1 ou NP en fusion avec des séquences de la protéine gp100 permettant la mobilisation vers les compartiments du CMH-II sans affecter la présentation par CMH-I. Des CPAs exprimant de façon endogène ces constructions modifiées ou sauvages ont ensuite été utilisées pour stimuler in vitro des lymphocytes T humains dont la qualité a été évaluée selon la production de cytokines et la présence de molécules de surface (ELISA ou marquage de cytokines intracellulaire). Nous avons observé une expansion de lymphocytes T CD8+ et CD4+ effecteurs spécifiques sécrétant diverses cytokines pro-inflammatoires (IFN-γ, TNF, MIP-1β) dans des proportions comparables avec une présentation par CMH-II basale ou améliorée. Cette qualité indépendante du niveau de présentation endogène par CMH-II de M1 et de NP des lymphocytes T CD4+ et CD8+ suggère que cette présentation est suffisante à court terme. En outre, la présentation endogène de M1 et NP a permis de stimuler des lymphocytes T spécifiques à des épitopes conservés du virus, tel qu’identifié à l’aide une méthode d’identification originale basée sur des segments d’ARNm, « mRNA PCR-based epitope chase (mPEC) ». Ensemble, ces nouvelles connaissances sur la présentation antigénique de M1 et de NP pourraient servir à établir de nouvelles stratégies vaccinales pan-spécifiques contre l’influenza.

Caractérisation de DKK1 comme antigène tumoral et manipulation des lymphocytes T CD8 : utilisation de la voie de Wnt en immunothérapie du cancer

L’immunothérapie tumorale à médiation cellulaire est un traitement qui utilise le système immunitaire des patients afin d’induire une réponse des lymphocytes T CD8+ (T CD8+) contre la tumeur. Cette réponse est produite suite à la reconnaissance des antigènes par les T CD8+. Ces cibles sont appelées antigènes tumoraux (TAA) et définies comme des protéines exprimées par les cellules cancéreuses mais absentes des tissus normaux. Par une approche bio-informatique, notre laboratoire a identifié Dickkopf-1 (DKK1), une protéine inhibitrice de la voie de Wnt, comme un TAA potentiel. Une immunothérapie à médiation cellulaire efficace requiert l’identification de TAA candidats pertinents. Le traitement de patients par immunothérapie pourrait également être améliorées par l’augmentation de la puissance d’action anti-tumorale ainsi que la persistante des T CD8+ spécifiques aux TAA. Ce projet de doctorat se divise en deux parties : 1- La caractérisation de l’expression de DKK1 dans les cancers communs et la détermination de son immunogénicité afin de valider sa candidature comme TAA. 2- La reprogrammation des T CD8+, de patients atteints d’un cancer commun, vers un phénotype moins différentié afin d’augmenter leur potentiel anti-tumoral et leur persistance. Dans le premier objectif, nous avons caractérisé l’expression de DKK1 dans le cancer du sein et dans d’autres cancers communs. Le profil d’expression de DKK1 a été étudié par RT-PCR et par ELISA dans plusieurs lignées cellulaires de cancer et dans les tissus normaux. L’expression de DKK1 a aussi été étudiée dans des échantillons cliniques provenant de cancers du sein, du poumon et du rein. Trente pourcents (30%) des tumeurs provenant d’un cancer du sein exprimaient DKK1. La moitié des tumeurs DKK1(+) était triple négative, donc pas de récepteurs d’œstrogène et de progestérone et était Her-2/neu(-) (ces patientes ont des possibilités de traitements très restreintes). De plus, 50% des échantillons cliniques de tumeurs du poumon et 30% des tumeurs de rein exprimaient DKK1. Les observations effectuées dans le cancer du poumon ont été, par la suite, corroborées par d'autres groupes qui ont montré une corrélation entre l'expression de DKK1 et un mauvais pronostic. Après avoir confirmée l’expression de DKK1 dans les cancers communs, justifiant ainsi sa candidature comme TAA, nous avons évalué l’immunogénicité de DKK1. Pour ce faire, nous avons effectué des stimulations in vitro de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de patient(e)s atteint(e)s d’un cancer du sein ou du poumon avec des peptides dérivés de DKK1 pouvant être présentés par les complexes majeurs d’histocompatibilité (CMH) HLA-A*0201. Des clones de T CD8+ reconnaissant un peptide de DKK1 ont été identifiés et isolés. Par essai multiplex et cytométrie de flux intracellulaire, la polyfonctionnalité d’un ces clones T CD8+ spécifiques à DKK1 a été étudiée et a révélée un profil effecteur, renforçant ainsi la candidature de DKK1 comme TAA. Dans l’ensemble, les résultats obtenus dans cette première partie de thèse suggèrent une possible utilisation de DKK1 en immunothérapie contre les cancers communs, attribuable à son expression dans ces cancers et la possibilité de faire proliférer des T CD8+ effecteurs spécifiques à DKK1 à partir de sang de patients. Dans la seconde partie de cette thèse, je décrirai la manipulation in vitro des T CD8+ de patients atteints d’un cancer commun, afin d’augmenter la force et la durée de leurs fonctions anti-tumorales. Il a été démontré que des lymphocytes moins différentiés sont capables d’une réponse immunologique plus efficace et durable. Nous avons basé ce projet sur l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique de la GSK-3, pour activer de la voie de Wnt chez les T CD8+ et ainsi leur conférer un phénotype moins différentié, partageant des caractéristiques de la cellule naïve et de la cellule mémoire. Des cultures de T CD8+, spécifiques à des antigènes viraux, en présence de l’inhibiteur ont permis d’augmenter la sécrétion d’interféron (IFN)- et leur activité cytotoxique. Ces résultats indiquent un effet de l’activation de la voie de Wnt sur la fonction des T CD8+. Ces observations sont rapportées pour la première fois chez les T CD8+ humains et suggèrent une nouvelle stratégie, applicables à l’immunothérapie du cancer, afin de prolonger la persistance des cellules ainsi que leur activité anti-tumorale. En conclusion, ces travaux de recherche ont mené à la réalisation d’une étape très importante dans la validation de la candidature de DKK1 comme TAA pour les cancers communs, soit la démonstration de son expression dans ces cancers et son absence dans les tissus normaux dérivés d’organes importants. Ces travaux ont également mené à la démonstration de l’immunogénicité de DKK1, par l’identification d’un peptide de DKK1 reconnu par les T CD8+. De plus, l’étude de la polyfonctionnalité des T CD8+ spécifiques à DKK1 a révélée un profil effecteur favorable pour l’obtention d’une réponse anti-tumorale efficace. Ces découvertes pourraient servir à l’élaboration d’une stratégie d’immunothérapie à médiation cellulaire pour les cancers communs. Pour sa part, l’étude phénotypique et fonctionnelle de la modulation de la voie de Wnt dans les T CD8+ a donné lieu à l’observation d’un phénotype encore jamais rapporté chez l’humain, conférant aux T CD8+ un aspect moins différentié avec des caractéristiques propre à un phénotype mémoire. Ces résultats sont pertinents dans l’amélioration de l’immunothérapie du cancer, passant par l’augmentation de la persistance des lymphocytes. En résumé, les résultats présentés dans cette thèse de doctorat fournissent des évidences indéniables quant à la validation de DKK1 comme TAA pour une immunothérapie à médiation cellulaire des cancers communs. Ces résultats fournissent également des preuves quant à la pertinence de la reprogrammation des T CD8+ par l’activation de la voie de la voie de Wnt, afin de générer des lymphocytes médiateurs plus efficaces pour ce type de thérapie.

Exploration pathologique des souris transgéniques porteuses du gène VPU de VIH-1

L‟infection par le VIH-1, chez les patients, affecte principalement le système immunitaire et conduit à une destruction graduelle des lymphocytes T CD4 et, par conséquent, entraîne un état d‟immunodéficience. Cette immunodéficience permet l'établissement d‟infections opportunistes qui sont responsables de manifestations cliniques associées au Sida. Ces patients peuvent aussi développer des lymphomes, lésions du système nerveux central et une atteinte rénale. L'ampleur et la sévérité des conditions associées observées chez les patients infectés par le VIH-1 ne peuvent être imputées seulement au processus infectieux et à la déplétion des cellules T CD4+. Ceci suggère que les produits des gènes de régulation pourraient avoir des effets cytopathogènes. Cependant, les études sur la physiopathogenèse induite par le VIH ou ses différents gènes ont été difficiles à mener en raison de l'absence d'animaux de laboratoire infectés par ce virus. Ceux-ci auraient pu aider à disséquer le rôle des différents composants du génome viral et les mécanismes pathogénétiques impliqués. Pour pallier cette contrainte, nous avons produit le premier modèle de souris transgéniques pour le gène vpu. Vpu code pour une phosphoprotéine membranaire avec plusieurs fonctions connues. Elle participe au relargage des virions à la surface cellulaire, induit la dégradation des CD4, induit la régulation négative des CMH-1, augmente la susceptibilité à la mort cellulaire des lymphocytes T infectés par le VIH et favorise la réplication virale en empêchant les mécanismes antiviraux cellulaires. Dans ce travail, nous avons caractérisé pathologiquement un modèle de souris transgéniques porteuses du gène vpu du VIH-1. Nos résultats démontrent que l‟expression de vpu chez les souris transgéniques induit le développement spontané d‟une hyperplasie lymphoïde pansystémique, une splénomégalie avec une hyperplasie lymphoïde folliculaire évoluant en lésions prémalignes et malignes qui présentent certaines similarités avec la maladie de Castleman et une iv glomérulonéphrite mesangioproliférative qui rappelle certaines altérations de néphropathie associée au VIH chez les patients infectés. L‟ensemble des altérations démontre que les souris Tg/vpu développent une activation chronique et non spécifique du système immunitaire. Dans cette activation immunitaire, une dérégulation de l‟IL-6 et une hyperplasie du réseau de cellules métallophiliques pourraient être impliquées. D‟autres résultats obtenus sur les évaluations du fonctionnement du système immunitaire de la rate et du thymus mettent en évidence une susceptibilité augmentée des lymphocytes des tissus lymphoïdes aux effets apoptotiques de la dexaméthasone et des lipopolysaccharides et un retard dans le repeuplement par les cellules d‟organes lymphoïdes ainsi qu‟une réaction inflammatoire (Schwartzman) exacerbée et des anomalies dans la réaction d‟hypersensibilité retardée expérimentale. Ce modèle transgénique reproduit plusieurs anomalies rencontrées chez les patients infectés par le VIH et ouvre de nouvelles hypothèses sur la pathogenèse de l‟infection par le VIH.

Caractérisation de la voie d'activation des interférons de type I

Codirecteur de recherche: Dr Sylvain Meloche

Étude fonctionnelle et génétique d'une population de lymphocytes T CD4-CD8- impliquée dans la résistance au diabète auto-immun chez la souris

Le diabète auto-immun résulte de la destruction des cellules bêta pancréatiques sécrétrices d’insuline par les lymphocytes T du système immunitaire. Il s’ensuit une déficience hormonale qui peut être comblée par des injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, toutefois il demeure à ce jour impossible de guérir les patients atteints de la maladie. De façon générale, un système immunitaire sain reconnaît une multitude d’antigènes différents et assure ainsi notre défense à l’égard de différents pathogènes ou encore de cellules tumorales. Il arrive cependant que, pour des raisons génétiques et/ou environnementales, les lymphocytes T puissent s’activer de façon aberrante suite à la reconnaissance d’antigènes provenant du soi. C’est ce bris de tolérance qui mène au développement de pathologies auto-immunes telles que le diabète auto-immun. Afin de limiter l’auto-immunité, des mécanismes de sélection stricts permettent d’éliminer la majorité des lymphocytes T présentant une forte affinité envers des antigènes du soi lors de leur développement dans le thymus. Certains de ces lymphocytes réussissent toutefois à échapper à l’apoptose et migrent en périphérie afin d’y circuler en quête d’un antigène spécifiquement reconnu. Il est alors primordial que des mécanismes périphériques assurent le maintien de la tolérance immunitaire en faisant obstacle à l’activation et à la prolifération des lymphocytes T auto-réactifs. L’une des avenues afin d’inhiber le développement de réponses immunitaires aberrantes est la génération de lymphocytes T régulateurs. Ces cellules, d’origine thymique ou périphérique, peuvent arborer différents phénotypes et agissent via de multiples mécanismes afin d’inactiver et/ou éliminer les cellules impliquées dans l’apparition de pathologies auto-immunes. L’utilisation de modèles murins transgéniques a permis la mise en évidence d’une population peu caractérisée de lymphocytes T au potentiel régulateur. En effet, la proportion de ces cellules T n’exprimant pas les corécepteurs CD4 et CD8 (double négatives, DN) a été inversement corrélée à la prédisposition à l’auto-immunité chez ces ii souris. L’objectif principal de cette thèse est de démontrer la fonction immuno-régulatrice des lymphocytes T DN, tout en investiguant les facteurs génétiques responsables du maintien de cette population cellulaire. Nous avons observé que les lymphocytes T DN exercent une activité cytotoxique à l’égard des lymphocytes B de façon spécifique à l’antigène, via la libération de granules cytolytiques contenant du granzyme B et de la perforine. Par ailleurs, nous avons établi qu’un unique transfert adoptif de ces cellules est suffisant afin d’inhiber le développement du diabète auto-immun chez des hôtes transgéniques prédisposés à la maladie. Le recours à des souris déficientes pour l’expression du gène CD47 a permis de constater que la voie de signalisation CD47-Sirp est essentielle dans le maintien de la proportion des lymphocytes T DN. De plus, le locus murin de prédisposition au diabète auto-immun Idd13, qui contient le gène Sirp, a été identifié pour son rôle dans la régulation de la proportion de ces cellules. Finalement, une analyse génétique a révélé que d’autres intervalles génétiques sont impliqués dans le contrôle de la population des lymphocytes T DN. Parmi ceux-ci, un locus situé en région proximale du chromosome 12 a été validé grâce à la création de souris congéniques. Grâce aux résultats présentés dans cette thèse, notre compréhension de la biologie ainsi que de la régulation des lymphocytes T DN est approfondie. Ces connaissances constituent un pas important vers la création de thérapies cellulaires novatrices permettant de prévenir et de guérir diverses pathologies auto-immunes.

Étude des fonctions immunomodulatrices des lymphocytes T « Doubles-Négatifs »

La réaction du greffon contre l’hôte (GvH) est responsable d’un grand taux de morbidité et de mortalité chez les patients recevant des greffes de cellules souches (GCSH) allogéniques. Dans ce contexte, les cellules T régulatrices sont largement étudiées et semblent avoir un grand potentiel d’utilisation dans le domaine de la thérapie cellulaire de la GvH. Parmi les populations cellulaires T régulatrices, les lymphocytes T CD4-CD8- TCRαβ+ « Doubles-Négatifs » (DN), qui ne représentent que 1-3% des lymphocytes T, ont été décrits. Ces cellules ont des propriétés inhibitrices de la réponse immunitaire qui s’avèrent spécifiques aux antigènes auxquels elles ont préalablement été exposées. La répression de la réponse immunitaire par les cellules T DN régulatrices semble être un mécanisme important impliqué dans l’induction de la tolérance aux allo-antigènes. De plus, ces cellules confèrent une tolérance immunitaire dans des modèles de greffes allogéniques et xénogéniques. En effet, ces cellules ont la capacité d’inhiber la réaction contre un allo-antigène auquel elles ont été exposées, sans inhiber la réaction contre un allo-antigène inconnu. Les cellules T DN ont été isolées et caractérisées chez l’homme où elles ont la capacité d’interagir avec des cellules présentatrices d’antigènes (APCs) par un contact cellulaire, comme chez la souris. Cependant, leur capacité immunomodulatrice reste inconnue chez l’humain. Notre objectif consistait donc principalement à étudier le rôle et le mécanisme d’action des cellules T DN régulatrices humaines in vitro, en étudiant leur capacité à inhiber une réaction lymphocytaire mixte (MLR). Nous avons montré que les cellules T DN stimulées par un allo-antigène donné inhibent des cellules syngéniques effectrices dirigées contre ce même alloantigène mais n’inhibent pas des cellules syngéniques effectrices dirigées contre un autre alloantigène, démontrant ainsi la spécificité aux antigènes de ces cellules. De plus, les T DN non stimulées par un allo-antigène n’ont pas de rôle inhibiteur. Cependant, durant cette inhibition, nous n’observons pas de modulation de l’expression des marqueurs d’activation et d’induction de l’apoptose. Afin d’étudier le mécanisme d’action des cellules T DN, nous avons mesuré l’expression intracellulaire de la granzyme B. Les résultats démontrent que les cellules T DN stimulées expriment un niveau significativement plus élevé de granzyme B que les cellules T DN non-stimulées par l’allo-antigène. Ceci suggère que l’immunosuppression induite par les cellules T DN stimulées pourrait passer par la voie granzyme B. Le mécanisme utilisé par ces cellules reste à être confirmé par nos futures expériences.

Interaction entre cellules gliales et neurones au niveau du système nerveux central : rôle dans la modulation synaptique et mécanismes d'activation des astrocytes par les récepteurs NMDA

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Importance of the HSP90 molecular chaperoning pathway for antibody diversification by determining AID stability

La protéine AID (déaminase induite par l’activation) joue un rôle central dans la réponse immunitaire adaptative. En désaminant des désoxycytidines en désoxyuridines au niveau des gènes immunoglobulines, elle initie l’hypermutation somatique (SHM), la conversion génique (iGC) et la commutation isotypique (CSR). Elle est essentielle à une réponse humorale efficace en contribuant à la maturation de l’affinité des anticorps et au changement de classe isotypique. Cependant, son activité mutagénique peut être oncogénique et causer une instabilité génomique propice au développement de cancers et de maladies autoimmunes. Il est donc critique de réguler AID, en particulier ses niveaux protéiques, pour générer une réponse immunitaire efficace tout en minimisant les risques de cancer et d’autoimmunité. Un élément de régulation est le fait qu’AID transite du cytoplasme vers le noyau mais reste majoritairement cytoplasmique à l’équilibre. AID est par ailleurs plus stable dans le cytoplasme que dans le noyau, ce qui contribue à réduire sa présence à proximité de l’ADN. Le but de cette thèse était d’identifier de nouveaux partenaires et déterminants d’AID régulant sa stabilité et ses fonctions biologiques. Dans un premier temps, nous avons identifié AID comme une nouvelle protéine cliente d’HSP90. Nous avons montré qu’HSP90 interagit avec AID dans le cytoplasme, ce qui empêche la poly-ubiquitination d’AID et sa dégradation par le protéasome. En conséquence, l’inhibition d’HSP90 résulte en une diminution significative des niveaux endogènes d’AID et corrèle avec une réduction proportionnelle de ses fonctions biologiques dans la diversification des anticorps mais aussi dans l’introduction de mutations aberrantes. Dans un second temps, nous avons montré que l’étape initiale dans la stabilisation d’AID par la voie de chaperonnage d’HSP90 dépend d’HSP40 et d’HSP70. En particulier, la protéine DnaJa1, qui fait partie de la famille des protéines HSP40s, limite la stabilisation d’AID dans le cytoplasme. La farnésylation de DnaJa1 est importante pour l’interaction entre DnaJa1 et AID et moduler les niveaux de DnaJa1 ou son état de farnésylation impacte à la fois les niveaux endogènes d’AID mais aussi la diversification des anticorps. Les souris DNAJA1-/- présentent une réponse immunitaire compromise en cas d’immunisation, qui est dûe à des niveaux réduits d’AID et un défaut de commutation de classe. Dans un troisième temps, nous avons montré que la protéine AID est intrinsèquement plus instable que sesprotéines paralogues APOBEC. Nous avons identifié l’acide aspartique en seconde position d’AID ainsi qu’un motif semblable au PEST comme des modulateurs de la stabilité d’AID. La modification de ces motifs augmente la stabilité d’AID et résulte en une diversification des anticorps plus efficace. En conclusion, l’instabilité intrinsèque d’AID est un élément de régulation de la diversification des anticorps. Cette instabilité est en partie compensée dans le cytoplasme par l’action protective de la voie de chaperonnage DnaJa1-HSP90. Par ailleurs, l’utilisation d’inhibiteurs d’HSP90 ou de farnésyltransférases pourrait être un outil intéressant pour la modulation indirecte des niveaux d’AID et le traitement de lymphomes/leucémies et de maladies auto-immunes causés par AID.

MARCH1 : new insights in the activation of B cells

L’implication des cellules B dans le développement de l’auto-immunité ne cesse d’être illustrée par de récentes publications. Les cellules présentent des peptides du soi aux cellules T auto-réactives ce qui mène à la production de cytokines pro-inflammatoires et d’anticorps auto-réactifs. Dans le présent document, nous explorons la présentation antigénique et la modification post-traductionnelle du complexe majeur d’histocompatibilité II (CMH-II). MARCH1 est une E3 ubiquitine ligase qui cible le CMH-II et le relocalise le complexe vers les endosomes de recyclage. Ainsi, MARCH1 est un inhibiteur de la présentation d’antigènes exogènes. Ici, nous démontrons que MARCH1 est exprimé seulement dans la sous-population des cellules B folliculaires et que cette expression est perdue lors de l’entrée dans les centres germinatifs. Nous proposons que MARCH1 établie une barrière de formation de centres germinatifs. Nous démontrons le lien entre MARCH1 et la hausse de CMH-II à la surface des cellules B à la suite d’un traitement à l’IL-10. De plus, nous avons testé plusieurs stimuli activateurs des cellules B et démontrons que MARCH1 est régulé à la baisse dans tous les cas. De plus, nous mettons en valeurs le rôle de la voie canonique d’activation de NF-κB dans cette régulation de MARCH1. Finalement, nous avons développé un système de lentivirus exprimant MARCH1 qui nous permet de forcer l’expression de MARCH1 dans des cellules réfractaires à la transfection. Nous discutons de l’implication de cette régulation du CMH-II par MARCH1 dans le développement de maladies auto-immunes.

Évaluation de la capacité de l'estradiol à inhiber l'activation pro-inflammatoire des cellules endothéliales vasculaires induite par la protéine C-réactive

De nombreuses études ont contribué à dévoiler les mécanismes à la base de l’athérosclérose. Cette maladie est médiée par un important déséquilibre homéostatique, qui entraine une inflammation vasculaire contribuant à sa progression. Plusieurs équipes de recherche ont axé leurs investigations sur l’étude d’importants biomarqueurs inflammatoires telle que la protéine C-réactive (CRP). Considérée comme facteur de risque de maladies cardiovasculaires, cette dernière participe aussi aux différents stades du développement de l’athérosclérose. Notre étude révèle pour la toute première fois un processus d’auto-induction de l’expression de la CRP régit par les CE vasculaires. Ce mécanisme représente une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour la prévention de l’athérosclérose. L’estrogène (E2) est une hormone féminine qui possède un rôle athéroprotecteur via entre autres, la modulation de la réponse inflammatoire. Ainsi, nous avons cherché à déterminer si elle avait un effet bénéfique sur le profil athérogénique de la CRP exprimée par les cellules endothéliales (CE). En effet, nos travaux ont démontré que l’E2 a la capacité de moduler le rétrocontrôle positif de l’expression de la CRP, contribuant à diminuer également le profil inflammatoire de cette dernière. De plus, nous avons établi que l’E2 restitue une importante voie pro-angiogénique impliquant la réponse migratoire des CE au VEGF, en contrant l’effet d’inhibition de la CRP. Cette nouvelle découverte nous a permis d’éclaircir un important mécanisme de guérison vasculaire de cette hormone dans un contexte inflammatoire. Ainsi, ces données contribuent à mieux comprendre la production endogène de la CRP par les CE vasculaires et l’activité cardioprotectrice de l’E2.

Étude de l'activation des basophiles par le système tachykinergique

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Rôle de PP2A dans l'activation constitutive de MEK1/2 de cellules MDCK transformées par le virus du sarcome de Moloney

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Role of the protein tyrosine phosphatase DEP-1 in Src activation and the mediation of biological cell functions of endothelial and breast cancer cells

L’implication des protéines tyrosines phosphatases (PTPs) dans la régulation de la signalisation et la médiation des fonctions cellulaires a été bien établie dans les dernières années. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels les PTPs régulent les processus fondamentaux tels que l’angiogenèse demeurent méconnus. Il a été rapporté que l’expression de la PTP DEP-1 (Density-enhanced phosphatase 1) augmente avec la densité cellulaire et corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2. Cette déphosphorylation contribue à l’inhibition de contact dans les cellules endothéliales à confluence et diminue l’activité du VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement ses résidus catalytiques Y1054/1059. De plus, la plupart des voies de signalisation en aval du VEGFR2 sont diminuées sauf la voie Src-Gab1-AKT. DEP-1 déphosphoryle la Y529 de Src et contribue à la promotion de la survie dans les cellules endothéliales. L’objectif de cette thèse est de mieux définir le rôle de DEP-1 dans la régulation de l’activité de Src et les réponses biologiques dans les cellules endothéliales. Nous avons identifié les résidus Y1311 et Y1320 dans la queue C-terminale de DEP-1 comme sites majeurs de phosphorylation en réponse au VEGF. La phosphorylation de ces résidus est requise pour l’activation de Src et médie le remodelage des jonctions cellules-cellules dépendantes de Src. Ce remodelage induit la perméabilité, l’invasion et la formation de capillaires en réponse au VEGF. Nos résultats démontrent que la phosphorylation de DEP-1 sur résidu tyrosine est requise pour diriger la spécificité de DEP-1 vers son substrat Src. Les travaux révèlent pour la première fois un rôle positif de DEP-1 sur l’induction du programme angiogénique des cellules endothéliales. En plus de la phosphorylation sur tyrosine, DEP-1 est constitutivement phosphorylé sur la thréonine 1318 situé à proximité de la Y1320 en C-terminal. Cette localisation de la T1318 suggère que ce résidu pourrait être impliqué dans la régulation de la Y1320. En effet, nous avons observé que la T1318 de DEP-1 est phosphorylée potentiellement par CK2, et que cette phosphorylation régule la phosphorylation de DEP-1 sur tyrosine et sa capacité de lier et d’activer Src. En accord avec ces résultats, nos travaux révèlent que la surexpression du mutant DEP-1 T1318A diminue le remodelage des jonctions cellules-cellules et par conséquent la perméabilité. Nos résultats suggèrent donc que la T1318 de DEP-1 constitue un nouveau mécanisme de contrôle de la phosphorylation sur tyrosine et que ceci résulte en l’activation de Src et l’induction des fonctions biologiques des cellules endothéliales en réponse au VEGF. Suite à ces travaux dans les cellules endothéliales qui démontrent un rôle positif de DEP-1 dans la médiation des réponses angiogéniques, nous avons voulu approfondir nos connaissances sur l’implication potentielle de DEP-1 dans les cellules cancéreuses où l’activité de Src est requise pour la progression tumorale. Malgré le rôle connu de DEP-1 comme suppresseur tumoral dans différents types de cancer, nous avons émis l’hypothèse que DEP-1 pourrait promouvoir les fonctions biologiques dépendantes de Src telles que la migration et l’invasion dans les cellules cancéreuses. Ainsi, nous avons observé que l’expression de DEP-1 est plus élevée dans les lignées basales de cancer du sein qui sont plus invasives comparativement aux lignées luminales peu invasives. Dans les lignées basales, DEP-1 active Src, médie la motilité cellulaire dépendante de Src et régule la localisation des protéines impliquées dans l’organisation du cytosquelette. L’analyse d’un micro-étalage de tissu a révélé que l’expression de DEP-1 est associée avec une réduction tendencielle de survie des patients. Nos résultats proposent donc, un rôle de promoteur tumoral pour DEP-1 dans la progression du cancer du sein. Les travaux présentés dans cette thèse démontrent pour la première fois que DEP-1 peut agir comme promoteur des réponses angiogéniques et du phénotype pro-invasif des lignées basales du cancer du sein probablement du à sa capacité d’activer Src. Nos résultats suggèrent ainsi que l’expression de DEP-1 pourrait contribuer à la progression tumorale et la formation de métastases. Ces découvertes laissent donc entrevoir que DEP-1 représente une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour contrer l’angiogenèse et le développement du cancer.

Study on the activation of the biceps brachii compartments in normal subjects

Les prothèses myoélectriques modernes peuvent être dotées de plusieurs degrés de liberté ce qui nécessite plusieurs signaux musculaires pour en exploiter pleinement les capacités. Pour obtenir plus de signaux, il nous a semblé prometteur d'expérimenter si les 6 compartiments du biceps brachial pouvaient être mis sous tension de façon volontaire et obtenir ainsi 6 signaux de contrôle au lieu d'un seul comme actuellement. Des expériences ont donc été réalisées avec 10 sujets normaux. Des matrices d'électrodes ont été placées en surface au-dessus du chef court et long du biceps pour recueillir les signaux électromyographiques (EMG) générés par le muscle lors de contractions effectuées alors que les sujets étaient soit assis, le coude droit fléchi ~ 100 ° ou debout avec le bras droit tendu à l'horizontale dans le plan coronal (sur le côté). Dans ces deux positions, la main était soit en supination, soit en position neutre, soit en pronation. L'amplitude des signaux captés au-dessus du chef court du muscle a été comparée à ceux obtenus à partir du chef long. Pour visualiser la forme du biceps sous les électrodes l'imagerie ultrasonore a été utilisée. En fonction de la tâche à accomplir, l'activité EMG a était plus importante soit dans un chef ou dans l'autre. Le fait de pouvoir activer préférentiellement l'un des 2 chefs du biceps, même si ce n'est pas encore de façon complètement indépendante, suggère que l'utilisation sélective des compartiments pourrait être une avenue possible pour faciliter le contrôle des prothèses myoélectriques du membre supérieur.

Antigen and superantigen presentation as defined by the MHCII-accessory proteins and associated-peptides

MHCII molecules expose a weave of antigens, which send survival or activation signals to T lymphocytes. The ongoing process of peptide binding to the MHC class II groove implicates three accessory molecules: the invariant chain, DM and DO. The invariant chain folds and directs the MHCII molecules to the endosomal pathway. Then, DM exchanges the CLIP peptide, which is a remnant of the degraded invariant chain, for peptides of better affinity. Expressed in highly specialized antigen presenting cells, DO competes with MHCII molecules for DM binding and favors the presentation of receptor-internalized antigens. Altogether, these molecules exhibit potential immunomodulatory properties that can be exploited to increase the potency of peptide vaccines. DO requires DM for maturation and to exit the ER. Interestingly, it is possible to monitor this interaction through a conformation change on DOβ that is recognized by the Mags.DO5 monoclonal antibody. Using Mags.DO5, we showed that DM stabilizes the interactions between the DO α1 and β1 chains and that DM influences DO folding in the ER. Thus, the Mags.DO5+ conformation correlates with DO egress from the ER. To further evaluate this conformation change, directed evolution was applied to DO. Of the 41 unique mutants obtained, 25% were localized at the DM-DO binding interface and 12% are at the solvent-exposed β1 domain, which is thought to be the Mags.DO5 epitope. In addition, I used the library to test the ability of HLA-DO to inhibit HLA-DM and sorted for the amount of CLIP. Interestingly, most of the mutants showed a decrease inhibitory effect, supporting the notion that the intrinsic instability of DO is a required for its function. Finally, these results support the model in which DO competes against classical MHCII molecules by sequestering DM chaperone’s function. MHCII molecules are also characterized by their ability to present superantigens, a group of bacterial or viral toxins that coerces MHCII-TCR binding in a less promiscuous fashion than what is observed in a canonical setting. While the mechanism of how bacterial superantigens form trimeric complexes with TCR and MHCII is well understood, the mouse mammary tumor virus superantigens (vSAG) are poorly defined. In the absence of a crystal structure, I chose a functional approach to examine the relation between vSAG, MHCII and TCR with the goal of uncovering the overall trimolecular architecture. I showed that TCR concomitantly binds both the MHCII α chain and the vSAG and that TCR-MHCII docking is almost canonical when coerced by vSAGs. Because many peptides may be tolerated in the MHCII groove, the pressure exerted by vSAG seems to tweak conventional TCR-MHCII interactions. Furthermore, my results demonstrate that vSAG binding to MHCII molecules is conformation-dependent and abrogated by the CLIP amino-terminal residues extending outside the peptide-binding groove. In addition, they also suggest that vSAGs cross-link adjacent MHCIIs and activate T cells via a TGXY motif.