Monocouches peptidiques auto-assemblées et applications dans le domaine des biocapteurs de résonance de plasmon de surfaces

Ces travaux visent à étendre les applications de la résonance de plasmons de surface (SPR) L’objectif est d’offrir des outils diagnostics plus rapides, efficaces et simple d’utilisation pour diagnostiquer ou effectuer le suivi de conditions cliniques. Pour se faire, un nouveau type d’instrumentation SPR basé sur l’utilisation d’un prisme d’inversion (dove) a permis d’atteindre une limite de détection (LOD) de 10-6 unité d’indice de réfraction (RIU), une valeur comparable aux instruments commerciaux complexes tout en demeurant peu dispendieux, robuste et simple d’utilisation. Les travaux présentés dans cet ouvrage visent, dans un second temps, à réduire les interactions nonspécifiques (NSB) entre la surface des biocapteurs SPR et les composants de la matrice biologique complexe telles que: l’urine, le lysat cellulaire, le sérum et le sang. Ces dernières induisent des réponses empêchant l’utilisation de biocapteurs SPR en milieux complexes. Les acides aminés (AA) offrent une grande variété de propriétés physico-chimiques permettant la mise au point de monocouches auto-assemblées (SAM) aux propriétés diverses. Initialement, 19 des 20 acides aminés naturels ont été attachés à l’acide 3-mercaptopropionique (3-MPA) formant des SAMs peptidomimétiques. La quantité d’interactions nonspécifiques engendrées par ces différentes surfaces a été mesurée en exposant ces surfaces au sérum sanguin bovin complet variant de 400 ng/cm² jusqu’à 800 ng/cm². La détection à l’aide de ces surfaces de la β-lactamase (une enzyme responsable de la résistance aux antibiotiques au niveau μM) a démontré la possibilité d’employer ces surfaces pour bâtir des biocapteurs SPR. Des peptides de longueur allant de 2 à 5 résidus attachés à 3-MPA ont été synthétisés sur support solide. Cette étude a démontré que l’augmentation de la longueur des peptides formés d’AA résistants aux NBS accroit leur résistance jusqu’à 5 résidus. Le composé le plus performant de ce type (3-MPA-(Ser)5-OH) a permis d’atteindre 180 ng/cm². Cette valeur est similaire à celle des meilleures surfaces disponibles commercialement, notamment les surfaces de polyethylène glycol (PEG) à 100 ng/cm². Des surfaces de 3-MPA-(Ser)5-OH ont permis l’étalonnage de la β-lactamase et sa quantification directe dans un lysat cellulaire. La LOD pour ces biocapteurs est de 10 nM. Une troisième génération de surfaces peptidiques binaires a permis la réduction de la NSB jusqu’à un niveau de 23±10 ng/cm² une valeur comparable aux meilleures surfaces disponibles. Ces surfaces ont permis l’étalonnage d’un indicateur potentiel du cancer la metalloprotéinase-3 de matrice (MMP-3). Les surfaces formées de peptides binaires (3-MPA-H3D2-OH) ont permis la quantification directe de la MMP-3 dans le sérum sanguin complet. Une quatrième génération de surfaces peptidiques a permis de réduire davantage le niveau de NSB jusqu’à une valeur de 12 ± 11 ng/cm². Ces surfaces ont été modifiées en y attachant une terminaison de type acide nitriloacétique (NTA) afin d’y attacher des biomolécules marquées par six résidus histidines terminaux. Ces surfaces ont permis le développement d’une méthode rapide de balayage des ligands ciblant le « cluster of differenciation-36 » (CD36). L’étude d’électroformation des monocouches de peptide a permis de déterminer les conditions de formation optimales d’une couche de 3-MPA-HHHDD-OH permettant ainsi la formation de monocouches résistantes au NSB en moins de 6 minutes en appliquant un potentiel de formation de 200mV vs Ag/AgCl.

Preparation, characterization, and rheological properties of star-shaped poly(ethylene glycol) with a cholane core and study of its effect on red blood cell aggregation

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Cyanocobalamin is a Superoxide Scavenger and Neuroprotectant in Neuronal Cells

Les dommages au nerf optique (neuropathie optique) peuvent entraîner la perte permanente de la vision ou la cécité causée par la mort des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR). Nous avons identifié qu’une surproduction de l'anion superoxyde constitue un événement moléculaire critique précédant la mort cellulaire induite par des lésions. Récemment, Suarez-Moreira et al (JACS 131:15078, 2009) ont démontré que la vitamine B12 peut capter l’anion superoxyde aussi efficacement que l’enzyme superoxyde dismutase. La carence en vitamine B12 peut conduire à une neuropathie optique causée par des mécanismes inconnus. Nous avons étudié la relation entre la captation de superoxyde par la cyanocobalamine (forme de vitamine B12 la plus abondante) et ses propriétés neuroprotectrices dans les cellules neuronales. La cyanocobalamine aux concentrations de 10 μM et 100 μM a réduit le taux de production de superoxyde respectivement par 34% et 79% dans les essais sans-cellule. Dans les cellules RGC-5 traités avec la ménadione, les concentrations de cyanocobalamine supérieures à 10 nM ont diminué l’anion superoxyde à des valeurs similaires à celles traitées par PEG-SOD. La cyanocobalamine aux concentrations de 100 μM et 1 μM a réduit la mort des cellules RGC-5 exposées à la ménadione par 20% et 32%, respectivement. Chez les rats avec section du nerf optique unilatérale, une dose intravitréenne de 667 μM de cyanocobalamine a réduit le nombre de CGRs exposées au superoxyde. Cette dose a également augmenté le taux de survie des CGRs comparativement aux rats injectés avec la solution témoin. Ces données suggèrent que la vitamine B12 peut être un neuroprotecteur important, et sa carence nutritionnelle pourrait causer la mort de CGRs. La vitamine B12 pourrait aussi potentiellement être utilisée comme une thérapie pour ralentir la progression de la mort CGR chez les patients avec les neuropathies optiques caractérisés par une surproduction de superoxyde.

Novel non phospholipid liposomes with high sterol content : development and characterization

Les liposomes sont des nanovecteurs polyvalents et prometteurs quant à leur utilisation dans plusieurs domaines. Il y a une décennie, un nouveau type de liposome constitué d’amphiphiles monoalkylés et de stérols est né fortuitement dans notre groupe. Ils sont nommés Stérosomes puisqu’ils contiennent une grande proportion de stérols, entre 50 et 70 mol %. Les objectifs de cette thèse sont de développer de nouvelles formulations de Stérosomes ayant des caractéristiques spécifiques et d’acquérir une compréhension plus profonde des règles physicochimiques qui dictent leur comportement de phase. Nous avons spécifiquement examiné le rôle de motifs moléculaires des stérols, de la charge interfaciale et de la capacité à former des liaisons H dans les interactions intermoléculaires menant à l’autoassemblage. Le comportement de phase a été caractérisé par calorimétrie différentielle à balayage (DSC), par spectroscopie infrarouge (IR) et par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire du deutérium (²H NMR). Premièrement, nous avons établi certaines corrélations entre la structure des stérols, leur tendance à former des bicouches fluides en présence d'amphiphile monoalkylé et la perméabilité des grandes vésicules unilamellaires (LUV) formées. La nature des stérols module les propriétés de mélange avec de l’acide palmitique (PA). Les stérols portant une chaîne volumineuse en position C17 sont moins aptes à induire des bicouches fluides que ceux qui ont une chaîne plus simple, comme celle du cholestérol. Un grand ordre de la chaîne alkyle de PA est un effet commun à tous les stérols investigués. Il a été démontré que la perméabilité des LUV peut être contrôlée en utilisant des stérols différents. Cependant, ces stérols n’ont aucun impact significatif sur la sensibilité des Stérosomes au pH. Afin de créer des liposomes qui sont sensibles au pH et qui ont une charge positive à la surface, des Stérosomes composés de stéarylamine et de cholestérol (Chol) ont été conçus et caractérisés. Il a été conclu que l’état de protonation de l’amine, dans ce travail, ou du groupe carboxylique, dans un travail précédent, confère une sensibilité au pH et détermine la charge à la surface du liposome. Les premiers Stérosomes complètement neutres ont été fabriqués en utilisant un réseau de fortes liaisons H intermoléculaires. Le groupe sulfoxyde est capable de former de fortes liaisons H avec le cholestérol et les molécules d’eau. Une bicouche fluide métastable a été obtenue, à la température de la pièce, à partir d'un mélange équimolaire d’octadécyl méthyl sulfoxyde (OMSO) et de Chol. Ce comportement distinct a permis d’extruder le mélange pour former des LUV à la température de la pièce. Après 30 h, le temps de vie de la phase métastable, des Stérosomes stables et imperméables existaient toujours sous une forme solide. Un diagramme de température-composition a été proposé afin de résumer le comportement de phase des mélanges d’OMSO/Chol. Finalement, nous avons élaboré des Stérosomes furtifs en incorporant du polyéthylène glycol (PEG) avec une ancre de cholestérol (PEG-Chol) à l’interface de Stérosomes de PA/Chol. Jusqu’à 20 mol % de PEG-Chol peut être introduit sans perturber la structure de la bicouche. La présence du PEG-Chol n’a aucun impact significatif sur la perméabilité de la LUV. L'encapsulation active de la doxorubicine, un médicament contre le cancer, a été réalisée malgré la faible perméabilité de ces LUV et la présence du PEG à l’interface. L’inclusion de PEG a modifié considérablement les propriétés de l’interface et a diminué la libération induite par la variation de pH observée avec des LUV nues de PA/Chol. Cette formulation inédite est potentiellement utile pour l’administration intraveineuse de médicaments.

A proteome-wide strategy reveals a novel mechanism of control of cell cycle progression through modulation of cyclin mRNA stability

La quantité de données générée dans le cadre d'étude à grande échelle du réseau d'interaction protéine-protéine dépasse notre capacité à les analyser et à comprendre leur sens; d'une part, par leur complexité et leur volume, et d'un autre part, par la qualité du jeu de donnée produit qui semble bondé de faux positifs et de faux négatifs. Cette dissertation décrit une nouvelle méthode de criblage des interactions physique entre protéines à haut débit chez Saccharomyces cerevisiae, la complémentation de fragments protéiques (PCA). Cette approche est accomplie dans des cellules intactes dans les conditions natives des protéines; sous leur promoteur endogène et dans le respect des contextes de modifications post-traductionnelles et de localisations subcellulaires. Une application biologique de cette méthode a permis de démontrer la capacité de ce système rapporteur à répondre aux questions d'adaptation cellulaire à des stress, comme la famine en nutriments et un traitement à une drogue. Dans le premier chapitre de cette dissertation, nous avons présenté un criblage des paires d'interactions entre les protéines résultant des quelques 6000 cadres de lecture de Saccharomyces cerevisiae. Nous avons identifié 2770 interactions entre 1124 protéines. Nous avons estimé la qualité de notre criblage en le comparant à d'autres banques d'interaction. Nous avons réalisé que la majorité de nos interactions sont nouvelles, alors que le chevauchement avec les données des autres méthodes est large. Nous avons pris cette opportunité pour caractériser les facteurs déterminants dans la détection d'une interaction par PCA. Nous avons remarqué que notre approche est sous une contrainte stérique provenant de la nécessité des fragments rapporteurs à pouvoir se rejoindre dans l'espace cellulaire afin de récupérer l'activité observable de la sonde d'interaction. L'intégration de nos résultats aux connaissances des dynamiques de régulations génétiques et des modifications protéiques nous dirigera vers une meilleure compréhension des processus cellulaires complexes orchestrés aux niveaux moléculaires et structuraux dans les cellules vivantes. Nous avons appliqué notre méthode aux réarrangements dynamiques opérant durant l'adaptation de la cellule à des stress, comme la famine en nutriments et le traitement à une drogue. Cette investigation fait le détail de notre second chapitre. Nous avons déterminé de cette manière que l'équilibre entre les formes phosphorylées et déphosphorylées de l'arginine méthyltransférase de Saccharomyces cerevisiae, Hmt1, régulait du même coup sont assemblage en hexamère et son activité enzymatique. L'activité d'Hmt1 a directement un impact dans la progression du cycle cellulaire durant un stress, stabilisant les transcrits de CLB2 et permettant la synthèse de Cln3p. Nous avons utilisé notre criblage afin de déterminer les régulateurs de la phosphorylation d'Hmt1 dans un contexte de traitement à la rapamycin, un inhibiteur de la kinase cible de la rapamycin (TOR). Nous avons identifié la sous-unité catalytique de la phosphatase PP2a, Pph22, activé par l'inhibition de la kinase TOR et la kinase Dbf2, activé durant l'entrée en mitose de la cellule, comme la phosphatase et la kinase responsable de la modification d'Hmt1 et de ses fonctions de régulations dans le cycle cellulaire. Cette approche peut être généralisée afin d'identifier et de lier mécanistiquement les gènes, incluant ceux n'ayant aucune fonction connue, à tout processus cellulaire, comme les mécanismes régulant l'ARNm.

Développement de tensioactifs à base d’acides biliaires pegylés pour des applications pharmaceutiques

Les acides biliaires sont reconnus comme des tensioactifs d’origine biologique potentiellement applicables dans le domaine pharmaceutique. Leurs structures en font une plateforme idéale pour l’obtention de nouvelles architectures polymères. Des composés synthétisés par polymérisation anionique de dérivés d’oxirane comme l’oxyde d’éthylène, offre des dérivés amphiphiles pegylés démontrant des propriétés d’agrégation intéressantes en vue d’une amélioration de la biocompatibilité et de la capacité d’encapsulation médicamenteuse. Une large gamme d’acides biliaires pegylés (BA(EGn)x) a été préparée avec comme objectif premier leurs applications dans la formulation de principes actifs problématiques. Pour cela, une caractérisation rigoureuse du comportement de ces dérivés (modulation de la longueur (2 < n < 19) et du nombre de bras (2 < x < 4) de PEG) en solution a été réalisée. Dans le but d’améliorer la biodisponibilité de principes actifs lipophiles (cas de l’itraconazole), des nanoémulsions spontanées, composées de BA(EGn)x et d’acide oléique, ont été développées. L’évaluation in vitro, de la toxicité (cellulaire), et de la capacité de solubilisation des systèmes BA(EGn)x, ainsi que les paramètres pharmacocinétiques in vivo (chez le rat), suggèrent une livraison contrôlée par nos systèmes auto-assemblés lors de l’administration orale et intraveineuse. Aussi, la synthèse de copolymères en blocs en étoile à base d’acide cholique pegylés a été effectuée par polymérisation anionique par addition d’un second bloc au caractère hydrophobe de poly(éther d’allyle et de glycidyle) (CA(EGn-b-AGEm)4). Selon le ratio de blocs hydrophiles-hydrophobes CA(EGn-b-AGEm)4, des réponses thermiques en solution (LCST) ont été observées par un point de trouble (Cp) entre 8 oC et 37 oC. Un mécanisme de formation d’agrégats en plusieurs étapes est suggéré. La thiolation des allyles des PAGE permet une fonctionnalisation terminale à haute densité, comparable aux dendrimères. Les caractérisations physico-chimiques des CA(EGn-b-AGEm-NH2)4 et CA(EGn-b-AGEm-COOH)4 indiquent la formation de structures auto-assemblées en solution, sensibles à la température ou au pH. Cette fonctionnalisation élargie le domaine d’application des dérivés d’acides biliaires pegylés en étoile vers la transfection d’ADN, la livraison de siRNA thérapeutiques ou encore à une sélectivité de livraison médicamenteux (ex. sensibilité au pH, greffage ligands).

Effect of knockdown of Giα proteins using antisense oligodeoxynucleotides encapsulated in cationic liposomes on the development of hypertension in spontaneously hypertensive rats

L'hypertension artérielle est l'une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. La compréhension des mécanismes qui sont à la base du développement de l'hypertension offrira de nouvelles perspectives pour un meilleur contrôle de l'hypertension. Nous avons précédemment montré que le niveau des protéines Giα-2 et Giα-3 est augmenté chez les rats spontanément hypertendus (SHR) avant l'apparition de l'hypertension. Le traitement avec les inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’Angiotensine (IEC) est associé à une diminution de l’expression des protéines Gi. De plus, l'injection intrapertoneale de la toxine de la coqueluche inactive les deux protéines Giα et empêche le développement de l'hypertension chez les SHR. Cependant, la contribution spécifique des protéines Giα-2 et Giα-3 dans le développement de l'hypertension n'est pas encore connue. Dans la présente étude, l’Anti-sens oligodésoxynucléotide (AS-ODN) de Giα-2 et Giα-3 (1mg/Kg en poids corporel) encapsulé dans des liposomes cationiques PEG / DOTAP/ DOPE ont été administrés par voie intraveineuse aux SHR pré-hypertendus âgé de trois semaines et aux Wistar Kyoto (WKY) rats de même âge. Les contrôles des WKY et SHR non traités ont été injectés avec du PBS stérile, liposomes vides ou oligomères sens. La pression artérielle (PA) a été suivie chaque semaine en utilisant la technique manchon caudal. Les rats ont été sacrifiés à l'âge de six semaines et neuf semaines. Le coeur et l'aorte ont été utilisés pour étudier l'expression des protéines Gi. Le knockdown des protéines Giα-2 par l’injection de Giα-2-AS a empêché le développement de l'hypertension à l'âge de six semaines. Par la suite, la PA a commencé à augmenter rapidement et a atteint le niveau que l'on retrouve dans les groupes témoins à l'âge de neuf semaines. D'autre part, la PA du groupe traité avec le Giα-3-AS a commencé à augmenter à l'âge de quatre semaines. Dans le groupe des SHR-Giα-3-AS, la PA a augmenté à l’âgé de six semaines, mais moins que celle de SHR-CTL. Le coeur et l'aorte obtenues des SHR Giα-2-AS et Giα-3-AS à partir de l’âgé de six semaines ont eu une diminution significative de l’expression des protéines Giα-2 et Giα-3 respectivement. Dans le groupe des WKY Giα-2-AS et Giα-3-AS l'expression des protéines Giα-2 et Giα-3 respectivement a diminué malgré l'absence de changement dans la PA par rapport aux WKY CTL. À l'âge de neuf semaines, les SHR traités avec du Giα-2-AS et Giα-3-AS avaient la même PA et expression des protéines Gi que le SHR CTL. Ces résultats suggèrent que les deux protéines Giα-2 et Giα-3 sont impliqués dans le développement de l'hypertension chez les SHR, mais le knockdown de Giα-2 et pas de Giα-3 a empêché le développement de l'hypertension.

Développement de nouvelles formulations d’antifongiques et évaluation de l’activité sur Candida spp. et Aspergillus spp.

Les travaux effectués dans le cadre de cette thèse de doctorat avaient pour but de mettre au point des nouvelles formulations d’antifongiques sous forme de nanoparticules polymériques (NP) en vue d’améliorer l’efficacité et la spécificité des traitements antifongiques sur des souches sensibles ou résistantes de Candida spp, d’Aspergillus spp et des souches de Candida albicans formant du biofilm. Dans la première partie de ce travail, nous avons synthétisé et caractérisé un polymère à base de polyester-co-polyéther branché avec du poly(éthylène glycol) (PEG-g-PLA). En plus d’être original et innovant, ce co-polymère a l’avantage d’être non-toxique et de posséder des caractéristiques de libération prolongée. Trois antifongiques couramment utilisés en clinique et présentant une biodisponibilité non optimale ont été choisis, soient deux azolés, le voriconazole (VRZ) et l’itraconazole (ITZ) et un polyène, l’amphotéricine B (AMB). Ces principes actifs (PA), en plus des problèmes d’administration, présentent aussi d’importants problèmes de toxicité. Des NP polymériques encapsulant ces PA ont été préparées par une technique d’émulsion huile-dans-l’eau (H/E) suivie d’évaporation de solvant. Une fois fabriquées, les NP ont été caractérisées et des particules de d’environ 200 nm de diamètre ont été obtenues. Les NP ont été conçues pour avoir une structure coeur/couronne avec un coeur constitué de polymère hydrophobe (PLA) et une couronne hydrophile de PEG. Une faible efficacité de chargement (1,3% m/m) a été obtenue pour la formulation VRZ encapsulé dans des NP (NP/VRZ). Toutefois, la formulation AMB encapsulée dans des NP (NP/AMB) a montré des taux de chargement satisfaisants (25,3% m/m). En effet, le caractère hydrophobe du PLA a assuré une bonne affinité avec les PA hydrophobes, particulièrement l’AMB qui est le plus hydrophobe des agents sélectionnés. Les études de libération contrôlée ont montré un relargage des PA sur plusieurs jours. La formulation NP/AMB a été testée sur un impacteur en cascade, un modèle in vitro de poumon et a permis de démontrer le potentiel de cette formulation à être administrée efficacement par voie pulmonaire. En effet, les résultats sur l’impacteur en cascade ont montré que la majorité de la formulation s’est retrouvée à l’étage de collecte correspondant au niveau bronchique, endroit où se situent majoritairement les infections fongiques pulmonaires. Dans la deuxième partie de ces travaux, nous avons testé les nouvelles formulations d’antifongiques sur des souches planctoniques de Candida spp., d’Aspergillus spp. et des souches de Candida albicans formant du biofilm selon les procédures standardisées du National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Les souches choisies ont démontré des résistances aux azolés et aux polyènes. Les études d’efficacité in vitro ont permis de prouver hors de tout doute que les nouvelles formulations offrent une efficacité nettement améliorée comparée à l’agent antifongique libre. Pour mettre en lumière si l’amélioration de l’efficacité antifongique était due à une internalisation des NP, nous avons évalué le comportement des NP avec les cellules de champignons. Nous avons procédé à des études qualitatives de microscopie de fluorescence sur des NP marquées avec de la rhodamine (Rh). Tel qu’attendu, les NP ont montré une localisation intracellulaire. Pour exclure la possibilité d’une simple adhésion des NP à la surface des levures, nous avons aussi confirmé leur internalisation en microscopie confocale de fluorescence. Il est important de noter que peu d’études à ce jour ont mis l’accent sur l’élaboration de nouvelles formulations d’antifongiques à base de polymères non toxiques destinées aux traitements des mycoses, donnant ainsi une grande valeur et originalité aux travaux effectués dans cette thèse. Les résultats probants obtenus ouvrent la voie vers une nouvelle approche pour contourner les problèmes de résistances fongiques, un problème de plus en plus important dans le domaine de l’infectiologie.

Étude de l’effet d'agents potentiellement perturbateurs de la structure des biofilms sur la diffusion des macromolécules dans les biofilms de Streptococcus mutans : cas de l’EDTA et de l’aspirine

Le but de ce travail de mémoire était d'explorer des moyens pour augmenter la perméabilité des biofilms de Streptococcus mutans aux macromolécules en utilisant des agents potentiellement perturbateurs de la structure des biofilms. L’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) ainsi que l’acide acétylsalicylique (aspirine) sont les agents perturbateurs choisis. Le changement de perméabilité des biofilms de S. mutans a été déterminé en mesurant les coefficients de diffusion globale du polyéthylène glycol (PEG) et de diffusion locale de dextrans. Les coefficients de diffusion globale ont été mesurés par spectroscopie infrarouge avec un échantillonnage par réflexion totale atténuée (ATR) alors que la spectroscopie par corrélation de fluorescence (SCF) a été utilisée pour la mesure des coefficients de diffusion locale. Les résultats ont démontré que l’incorporation de l’EDTA à une concentration de 7.5 (m/v) % dans la solution de diffusion permet d’améliorer les propriétés de transport du PEG dans les biofilms en augmentant sa pénétrabilité et son coefficient de diffusion globale. Par contre, aucune variation n’a été constatée dans la valeur du coefficient de diffusion locale de dextran fluorescent. Cette différence peut être expliquée, entre autres, par l'échelle des mesures et la nature différente des molécules diffusantes. L’aspirine n’a démontré aucun effet sur le transport du PEG à travers les biofilms de S. mutans. La pénétration accrue du PEG en présence de l’EDTA a été corrélée aux tests de viabilité des cellules bactériennes. En effet, la combinaison de la pénicilline G (PenG) avec l’EDTA 2 (m/v) % a eu comme effet l’augmentation du pouvoir biocide d’un facteur 3. De plus, les images de microscopie à épifluorescence et de microscopie confocale à balayage de laser ont démontré que les bactéries dans le cœur des microcolonies sont plus affectées par la PenG lorsque le milieu contient de l'EDTA. A la lumière des résultats obtenus, il s’avère que l’incorporation d'agents perturbateurs de la structure des biofilms est une option sérieuse à considérer dans l’éradication des biofilms microbiens. Plus d’études devront être effectuées afin d’investiguer l’effet d’autres molécules possédant les propriétés perturbatrices de la structure des biofilms sur la résistance de ces derniers aux agents antimicrobiens.

Genetic association study of plasma creatine kinase levels in the Montreal Heart Institute Hospital Cohort

Il a déjà été démontré que les statines (ou inhibiteurs de la HMG-CoA réductase) sont efficaces pour réduire le LDL-cholestérol et elles se sont depuis établies comme étant le pilier dans le traitement de la dyslipidémie. Toutefois, environ 10 pourcent des utilisateurs de statines souffrent d'effets indésirables, généralement sous forme de myopathie qui est souvent accompagnée d’un taux élevé de la créatine kinase (CK) plasmatique. Il est fréquent que les patients doivent arrêter les statines à cause d’un taux de CK dépassant un seuil de référence. Nous avons examiné le taux de CK de près de 6000 participants de la biobanque de l’ICM, qui ont récemment été génotypés à l'aide de la micropuce d'ADN ExomChip d'Illumina. Des études antérieures ont démontré une association significative entre le taux de CK plasmatique et des polymorphismes génétiques et nous avons cherché à répliquer ces résultats par association génétique et à l'aide du test SKAT pour les polymorphismes rares. Nous avons répliqué les résultats dans le gène CKM (rs11559024, p=1.59x10-23) et le gène LILRB5 (rs12975366, p=1.44x10-26) dans le chromosome 19. Nous espérons que ces résultats seront éventuellement utilisés en clinique pour la prédiction des taux de référence de CK personnalisés selon le profil génétique des patients utilisateurs de statines.

Nanovecteurs pour cibler pseudomonas aeruginosa dans la fibrose kystique.

La production excessive de mucus visqueaux dans les poumons des patients atteints de la fibrose kystique (FK) gêne la diffusion des médicaments et entraîne des infections bactériennes. En effet, l’infection pulmonaire par Pseudomonas aeruginosa (PA) est la principale cause de mortalité. Les travaux effectués dans cette thèse avaient pour but de développer des nouvelles formulations de nanoparticules (NP) et de liposomes (LP) chargées avec des antibiotiques pour erradiquer le PA chez les patients atteints de KF. Tout d’abord, les polymères PEG-g-PLA et PLA-OH ont été synthétisés et caractérisés. Ensuite, l'efficacité d'encapsulation (EE) de la tobramycine, du sulfate de colistine et de la lévofloxacine (lévo) a été testée dans des NP de PEG-g-PLA et / ou PLA-OH. Les premiers essais d'optimisation ont montré que les NP chargées avec la lévo présentaient une augmentation de l’EE. La lévo reste alors le médicament de choix. Cependant, la meilleure charge de médicament obtenue était de 0,02% m/m. Pour cette raison, nous avons décidé d'évaluer l'encapsulation de la lévo dans les LP. En fait, des LP chargés de lévo ont présenté une EE d’environ 8% m/m. De plus, la taille et la charge de ces LP étaient appropriées pour la pénétration du vecteur dans le mucus. Le test de biofilm n'est pas reproductible, mais le test standard a montré que la souche mucoïde de PA était susceptible à la lévo. Ainsi, nous avons comparé les activités des LP fraîchement préparées (vides et chargés ) et de la lévo libre sous la forme planctonique de PA. Les résultats ont montré que des LP vides ne gênent pas la croissance bactérienne. Pour la souche mucoïde (Susceptible à la lévo) les LP chargés et le médicament libre ont présenté la même concentration minimale inhibitrice (CMI). Toutefois, les souches non mucoïdes (résistant à la lévo) ont présenté une CMI deux fois plus faible que celle pour le médicament libre. Finalement, les LP se sont avérés plus appropriés pour encapsuler des médicaments hydrophiles que les NP de PEG-g-PLA. En outre, les LP semblent améliorer le traitement contre la souche résistante de PA. Toutefois, des études complémentaires doivent être effectuées afin d'assurer la capacité des liposomes èa traiter la fibrose kystique.

Transfert et traitement de l’information visuomotrice dans le cerveau autiste : intégrité et hétérogénéité

En plus de la triade de symptômes caractérisant l’autisme, ce trouble neurodévelopmental est associé à des particularités perceptives et motrices et, au niveau cérébral, par une connectivité atypique entre les différentes régions du cerveau. Au niveau anatomique, un des résultats les plus communs est la réduction du corps calleux. Toutefois, des effets directs de cette altération anatomique sur l’intégrité et l’efficacité du transfert interhémisphérique restent à être démontrés. Pour la présente thèse, trois différentes études investiguent différents aspects du traitement de l’information visuomotrice : le transfert interhémisphérique entre les régions bilatérales motrices et visuelles, la vitesse de traitement perceptif, et les habiletés motrices visuellement guidées. Dans la première étude, le paradigme visuomoteur de Poffenberger a été utilisé pour mesurer le temps de transfert interhémisphérique (TTIH). L’imagerie par résonnance magnétique fonctionnelle (IRMf) et structurale ainsi que l’imagerie de diffusion ont aussi été utilisées pour étudier les réseaux cérébraux impliqués dans la tâche de Poffenberger. Les autistes ont été comparés à un groupe d’individus à développement typique. La deuxième étude avait pour but d’investiguer la vitesse de traitement perceptif en autisme. Dans la troisième étude, deux tâches motrices (Purdue et Annett) ont été utilisées pour examiner la nature et l’importance des déficits moteurs. La tâche de Purdue inclut deux conditions bimanuelles utilisées comme indice additionnel d’intégration interhémisphérique. Dans les études 2 et 3, le groupe d’autistes a aussi été comparé à un groupe d’individus Asperger afin de voir si, et comment, les deux sous-groupes peuvent être distingués en ce qui concerne le traitement visuel et les déficits moteurs. Aucune différence entre les groupes n’a été observée en termes de TTIH. Les résultats de l’étude IRMf révèlent des différences d’activations corticales en lien avec la tâche de Poffenberger. Dans les groupes d’autistes et de typiques, l’efficacité de la communication interhémisphérique était associée à différentes portions du corps calleux (frontales/motrices chez les typiques, postérieures/visuelles chez les autistes). De façon globale, les résultats de cette étude démontrent un patron atypique de transfert interhémisphérique de l’information visuomotrice en autisme, reflétant un rôle plus important des mécanismes visuels dans le comportement sensorimoteur possiblement en lien avec une réorganisation cérébrale. Les résultats des études comportementales 2 et 3 indiquent que les autistes excellent dans la tâche mesurant la vitesse de traitement perceptif alors que les Asperger accomplissent la tâche à des niveaux similaires à ceux des typiques. La nature des déficits moteurs diffère aussi entre les deux sous-groupes; la dextérité et la coordination bimanuelle est affectée chez les individus Asperger mais pas chez les autistes, qui eux sont plus atteints au niveau de la rapidité unimanuelle. Les sous-groupes d’autistes et de syndrome d’Asperger sont caractérisés par des profils cognitifs différents dont les particularités perceptives et motrices font partie intégrante.

Development of a Phase Separation Strategy in Macrocyclization Reactions

La réaction de macrocyclisation est une transformation fondamentale en chimie organique de synthèse. Le principal défi associcé à la formation de macrocycles est la compétition inhérente avec la réaction d’oligomérisation qui mène à la formation de sousproduits indésirables. De plus, l’utilisation de conditions de dilutions élevées qui sont nécessaires afin d’obtenir une cyclisation “sélective”, sont souvent décourageantes pour les applications à l’échelle industrielle. Malgré cet intérêt pour les macrocycles, la recherche visant à développer des stratégies environnementalement bénignes, qui permettent d’utiliser des concentrations normales pour leur synthèse, sont encore rares. Cette thèse décrit le développement d’une nouvelle approche générale visant à améliorer l’efficacité des réactions de macrocyclisation en utilisant le contrôle des effets de dilution. Une stratégie de “séparation de phase” qui permet de réaliser des réactions à des concentrations plus élevées a été developpée. Elle se base sur un mélange de solvant aggrégé contrôlé par les propriétés du poly(éthylène glycol) (PEG). Des études de tension de surface, spectroscopie UV et tagging chimique ont été réalisées afin d’élucider le mécanisme de “séparation de phase”. Il est proposé que celui-ci fonctionne par diffusion lente du substrat organique vers la phase ou le catalyseur est actif. La nature du polymère co-solvant joue donc un rôle crutial dans le contrôle de l’aggrégation et de la catalyse La stratégie de “séparation de phase” a initiallement été étudiée en utilisant le couplage oxidatif d’alcynes de type Glaser-Hay co-catalysé par un complexe de cuivre et de nickel puis a été transposée à la chimie en flux continu. Elle fut ensuite appliquée à la cycloaddition d’alcynes et d’azotures catalysée par un complexe de cuivre en “batch” ainsi qu’en flux continu.

Nanostructure des particules polymériques : aspects physiques, chimiques et biologiques

Les nanotechnologies appliquées aux sciences pharmaceutiques ont pour but d’améliorer l’administration de molécules actives par l’intermédiaire de transporteurs nanométriques. Parmi les différents types de véhicules proposés pour atteindre ce but, on retrouve les nanoparticules polymériques (NP) constituées de copolymères “en bloc”. Ces copolymères permettent à la fois l’encapsulation de molécules actives et confèrent à la particule certaines propriétés de surface (dont l’hydrophilicité) nécessaires à ses interactions avec les milieux biologiques. L’architecture retenue pour ces copolymères est une structure constituée le plus fréquemment de blocs hydrophiles de poly(éthylène glycol) (PEG) associés de façon linéaire à des blocs hydrophobes de type polyesters. Le PEG est le polymère de choix pour conférer une couronne hydrophile aux NPs et son l’efficacité est directement liée à son organisation et sa densité de surface. Néanmoins, malgré les succès limités en clinique de ces copolymères linéaires, peu de travaux se sont attardés à explorer les effets sur la structure des NPs d’architectures alternatives, tels que les copolymères en peigne ou en brosse. Durant ce travail, plusieurs stratégies ont été mises au point pour la synthèse de copolymères en peigne, possédant un squelette polymérique polyesters-co-éther et des chaines de PEG liées sur les groupes pendants disponibles (groupement hydroxyle ou alcyne). Dans la première partie de ce travail, des réactions d’estérification par acylation et de couplage sur des groupes pendants alcool ont permis le greffage de chaîne de PEG. Cette méthode génère des copolymères en peigne (PEG-g-PLA) possédant de 5 à 50% en poids de PEG, en faisant varier le nombre de chaînes branchées sur un squelette de poly(lactique) (PLA). Les propriétés structurales des NPs produites ont été étudiées par DLS, mesure de charge et MET. Une transition critique se situant autour de 15% de PEG (poids/poids) est observée avec un changement de morphologie, d’une particule solide à une particule molle (“nanoagrégat polymére”). La méthode de greffage ainsi que l’addition probable de chaine de PEG en bout de chaîne principale semblent également avoir un rôle dans les changements observés. L’organisation des chaînes de PEG-g-PLA à la surface a été étudiée par RMN et XPS, méthodes permettant de quantifier la densité de surface en chaînes de PEG. Ainsi deux propriétés clés que sont la résistance à l’agrégation en conditions saline ainsi que la résistance à la liaison aux protéines (étudiée par isothermes d’adsorption et microcalorimétrie) ont été reliées à la densité de surface de PEG et à l’architecture des polymères. Dans une seconde partie de ce travail, le greffage des chaînes de PEG a été réalisé de façon directe par cyclo-adition catalysée par le cuivre de mPEG-N3 sur les groupes pendants alcyne. Cette nouvelle stratégie a été pensée dans le but de comprendre la contribution possible des chaines de PEG greffées à l’extrémité de la chaine de PLA. Cette librairie de PEG-g-PLA, en plus d’être composée de PEG-g-PLA avec différentes densités de greffage, comporte des PEG-g-PLA avec des PEG de différent poids moléculaire (750, 2000 et 5000). Les chaines de PEG sont seulement greffées sur les groupes pendants. Les NPs ont été produites par différentes méthodes de nanoprécipitation, incluant la nanoprécipitation « flash » et une méthode en microfluidique. Plusieurs variables de formulation telles que la concentration du polymère et la vitesse de mélange ont été étudiées afin d’observer leur effet sur les caractéristiques structurales et de surface des NPs. Les tailles et les potentiels de charges sont peu affectés par le contenu en PEG (% poids/poids) et la longueur des chaînes de PEG. Les images de MET montrent des objets sphériques solides et l'on n’observe pas d’objets de type agrégat polymériques, malgré des contenus en PEG comparable à la première bibliothèque de polymère. Une explication possible est l’absence sur ces copolymères en peigne de chaine de PEG greffée en bout de la chaîne principale. Comme attendu, les tailles diminuent avec la concentration du polymère dans la phase organique et avec la diminution du temps de mélange des deux phases, pour les différentes méthodes de préparation. Finalement, la densité de surface des chaînes de PEG a été quantifiée par RMN du proton et XPS et ne dépendent pas de la méthode de préparation. Dans la troisième partie de ce travail, nous avons étudié le rôle de l’architecture du polymère sur les propriétés d’encapsulation et de libération de la curcumine. La curcumine a été choisie comme modèle dans le but de développer une plateforme de livraison de molécules actives pour traiter les maladies du système nerveux central impliquant le stress oxydatif. Les NPs chargées en curcumine, montrent la même transition de taille et de morphologie lorsque le contenu en PEG dépasse 15% (poids/poids). Le taux de chargement en molécule active, l’efficacité de changement et les cinétiques de libérations ainsi que les coefficients de diffusion de la curcumine montrent une dépendance à l’architecture des polymères. Les NPs ne présentent pas de toxicité et n’induisent pas de stress oxydatif lorsque testés in vitro sur une lignée cellulaire neuronale. En revanche, les NPs chargées en curcumine préviennent le stress oxydatif induit dans ces cellules neuronales. La magnitude de cet effet est reliée à l’architecture du polymère et à l’organisation de la NP. En résumé, ce travail a permis de mettre en évidence quelques propriétés intéressantes des copolymères en peigne et la relation intime entre l’architecture des polymères et les propriétés physico-chimiques des NPs. De plus les résultats obtenus permettent de proposer de nouvelles approches pour le design des nanotransporteurs polymériques de molécules actives.

Effect of polymer architecture on Curcumin 1 encapsulation and release from PEGylated polymer nanoparticles: toward a drug delivery nano-platform to the CNS

We developed a nanoparticles (NPs) library from poly(ethylene glycol)–poly lactic acid comb-like polymers with variable amount of PEG. Curcumin was encapsulated in the NPs with a view to develop a delivery platform to treat diseases involving oxidative stress affecting the CNS. We observed a sharp decrease in size between 15 and 20% w/w of PEG which corresponds to a transition from a large solid particle structure to a “micelle-like” or “polymer nano-aggregate” structure. Drug loading, loading efficacy and release kinetics were determined. The diffusion coefficients of curcumin in NPs were determined using a mathematical modeling. The higher diffusion was observed for solid particles compared to “polymer nano-aggregate” particles. NPs did not present any significant toxicity when tested in vitro on a neuronal cell line. Moreover, the ability of NPs carrying curcumin to prevent oxidative stress was evidenced and linked to polymer architecture and NPs organization. Our study showed the intimate relationship between the polymer architecture and the biophysical properties of the resulting NPs and sheds light on new approaches to design efficient NP-based drug carriers.