Role of receptor and non-receptor protein tyrosine kinases in vasoactive peptide-induced signaling

L'endothéline-1 (ET-1) et l'angiotensine II (Ang II) jouent un rôle important dans le maintien de la pression artérielle et l'homéostasie vasculaire. Une activité accrue de ces peptides vasoactifs est présumée contribuer au développement de pathologies vasculaires, telles que l'hypertension, l'athérosclérose, l'hypertrophie et la resténose. Ceci est causé par une activation excessive de plusieurs voies de signalisation hypertrophiques et prolifératives, qui incluent des membres de la famille des Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK), ainsi que la famille phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) / protéine kinase B (PKB). Bien que l'activation de ces voies de signalisation soit bien élucidée, les éléments en amont responsables de l'activation des MAPK et de la PKB, induite par l'ET-1 et Ang II, demeurent mal compris. Durant les dernières années, le concept de la transactivation de récepteurs et/ou non-récepteurs protéines tyrosine kinases (PTK) dans le déclenchement des événements de signalisation induits par les peptides vasoactifs a gagné beaucoup de reconnaissance. Nous avons récemment démontré que la PTK Insulin-like Growth Factor type-1 Receptor (IGF-1R) joue un rôle dans la transduction des signaux induits par l‟H2O2, menant à la phosphorylation de la PKB. Étant donné que les peptides vasoactifs génèrent des espèces réactives d'oxygène, telles que l‟H2O2 lors de leur signalisation, nous avons examiné le rôle de d‟IGF-1R dans la phosphorylation de la PKB et les réponses hypertrophiques dans les cellules muscle lisse vasculaires (CMLV) induites par l'ET-1 et Ang II. AG-1024, un inhibiteur spécifique de l'IGF-1R, a atténué la phosphorylation de la PKB induite à la fois par l'ET-1 et Ang II. Le traitement des CMLVs avec l‟ET-1 et Ang II a également induit une phosphorylation des résidus tyrosine dans les sites d'autophosphorylation d'IGF-1R, celle-ci a été bloquée par l‟AG-1024. En outre, l‟ET-1 et l‟Ang II on tous les deux provoqué la phosphorylation de c-Src, une PTK non-récepteur, bloqué par PP-2, inhibiteur spécifique de la famille Src. La PP-2 a également inhibé la phosphorylation de PKB et d‟IGF-1R induite par l‟ET-1 et l‟Ang II. De plus, la synthèse de protéines ainsi que d‟ADN, marqueurs de la prolifération cellulaire et de l'hypertrophie, ont également été atténuée par l‟AG-1024 et le PP-2. Bien que ce travail démontre le rôle de c-Src dans la phosphorylation PKB induite par l'ET-1 et Ang II, son rôle dans l'activation des MAPK induit par l'ET-1 dans les CMLVs reste controversé. Par conséquent, nous avons examiné l'implication de c-Src dans l'activation de ERK 1/2, JNK et p38MAPK, par l'ET-1 et Ang II, ainsi que leur capacité à régulariser l'expression du facteur de transcription Early growth transcription factor-1 « Egr-1 ». ET-1 et Ang II ont induit la phosphorylation de ERK 1/2, JNK et p38 MAPK, et ont amplifié l'expression d'Egr-1 dans les CMLVs. Cette augmentation de la phosphorylation des MAPK a été diminuée par la PP-2, qui a aussi atténué l'expression d'Egr-1 induite par l'ET-1 et l'Ang II. Une preuve supplémentaire du rôle de c-Src dans ce processus a été obtenue en utilisant des fibroblastes embryonnaires de souris déficientes en c-Src (Src -/- MEF). L'expression d'Egr-1, ainsi que l'activation des trois MAPKs par l'ET-1 ont été atténuées dans les cellules Src -/- par rapport au MEF exprimant des taux normaux Src. En résumé, ces données suggèrent que l'IGF-1R et c-Src PTK jouent un rôle essentiel dans la régulation de la phosphorylation de PKB et des MAPK dans l‟expression d'Egr-1, ainsi que dans les réponses hypertrophiques et prolifératives induites par l'ET-1 et Ang II dans les CMLVs.

Caractérisation de nouveaux mécanismes transcriptionnels impliqués dans la biologie osseuse

Le développement et l'homéostasie des os requièrent l'orchestration spatio-temporelle d'un grand nombre de signaux moléculaires. Ces signaux entraînent l'activation ou l'inhibition de différents facteurs de transcription, lesquels sont en mesure de contrôler la prolifération et la différenciation des ostéoblastes et des chondrocytes. L'intégrité de ces différents mécanismes se doit d'être maintenu tout au long de la vie. Ainsi, une anomalie dans l'un de ces mécanismes conduit à l'apparition de pathologies osseuses et métaboliques telles qu’une hypophosphatémie, l'ostéoporose ou l'ostéoarthrite (OA). Afin d'en apprendre davantage sur la biologie osseuse, le projet décrit dans cette thèse a pour objectif de caractériser de nouveaux mécanismes de régulation transcriptionnelle pour deux gènes importants dans le développement des os et le maintien de leur intégrité. Il s’agit du Paired-like Homeodomain Transcription Factor 1 (PITX1) et du Phosphate-regulating gene with homology to endopeptidase on the X chromosome (PHEX). Le premier mécanisme présenté dans cette thèse concerne la régulation transcriptionnelle du gène PITX1, un facteur de transcription à homéodomaine nécessaire, notamment, au développement des os des membres inférieurs et au maintien de l'intégrité du cartilage articulaire chez l'adulte. Ainsi, dans les chondrocytes articulaires, on note que l'expression de PITX1 est assurée par le recrutement du facteur de transcription E2F1 à deux éléments de réponse présents dans la région proximale du promoteur de PITX1. Aussi, dans les chondrocytes articulaires de patients souffrant d'OA, dans lesquels l'expression de PITX1 est fortement diminuée, un mécanisme de répression transcriptionnelle, lequel implique la protéine multifonctionnelle Prohibitin (PHB1), semble être activé. En effet, dans ces chondroytes, on note une forte accumulation nucléaire de PHB1 comparativement aux chondrocytes articulaires de sujets sains. Le second mécanisme présenté dans cette thèse concerne la répression transcriptionnelle de PHEX, la peptidase mutée dans le syndrome d'hypophosphatémie lié au chromosome X (X-Linked Hypophosphatemia, XLH), lequel se caractérise par une hypophosphatémie et une ostéomalacie. Le traitement d'ostéoblastes à la Parathyroid hormone-related protein (PTHrP) permet d’observer la répression de PHEX. Afin de caractériser le mécanisme responsable de cette répression, des expériences de gènes rapporteurs ont révélé la présence de deux éléments de réponse pour le répresseur transcriptionnel E4BP4 dans le promoteur de PHEX. La suppression de l'expression d'E4BP4 par l'utilisation d'ARN d'interférence a permis de valider que ce facteur de transcription est responsable de la répression de PHEX suite au traitement d'ostéoblastes à la PTHrP. En somme ces nouveaux mécanismes de régulation transcriptionnelle permettent de mieux comprendre la régulation de l'expression de PITX1 et de PHEX. Aussi, cette nouvelle implication de PHB1 dans la pathogenèse de l'OA offre de nouvelles possibilités de traitement et pourrait servir pour le diagnostic précoce de cette pathologie. Enfin, la caractérisation d'E4BP4 en tant que médiateur pour la répression de PHEX par la PTHrP suggère que ce répresseur transcriptionnel pourrait être impliqué dans le contrôle de la minéralisation des os et des niveaux de phosphate sanguin.

Caractérisation du motif acidique de la sous-unité p28 de l’IL-27 et étude des propriétés partagées entre cette protéine, le CNTF, CLC/CLF et l’interleukine-6

L’interleukine 6 (IL-6) est une cytokine qui joue un rôle essentiel dans l’inflammation. Son récepteur (IL-6R) est composé de la chaîne non signalétique IL-6Rα et de la chaîne transductrice du signal gp130, commune aux cytokines de la famille IL-6. La liaison de l’IL-6 à son récepteur permet l’activation de plusieurs voies de signalisation, notamment des voies Jak/STAT1 et préférentiellement Jak/STAT3. De façon complémentaire, nous avons démontré que l’IL-6 est capable d’activer la voie Jak/STAT5 dans les lymphocytes T CD4. L’activation de cette voie de signalisation pourrait être impliquée dans le rétrocontrôle des effets pro-inflammatoires de l’IL-6 sur les cellules T CD4. Le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) et la « cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor 1 » (CLC/CLF) sont deux cytokines de la famille de l’IL-6 qui signalent à travers un récepteur commun, le récepteur au CNTF (CNTFR), composé du CNTFRα, « leukaemia inhibitory factor receptor β » (LIFRβ) et gp130. Toutes deux exercent des actions au niveau du système immunitaire, or la chaîne CNTFRα de leur récepteur n’y est pas exprimée. Il a été montré que le CNTFR humain peut également activer un récepteur formé des sous-unités IL-6Rα, LIFRβ et gp130. Nous avons comparé les effets du CNTF et du CLC/CLF de souris sur des transfectants exprimant LIFRβ et gp130 et les chaines α connues de la famille IL-6 (IL-6Rα, IL-11Rβ et CNTFRα). Nos résultats indiquent que le CNTF de souris, comme le CNTF humain est capable d’activer un récepteur formé de l’IL-6Rα, LIFRβ et gp130. Toutefois cette propriété n’est pas partagée par CLC/CLF et le récepteur impliqué dans les effets de cette cytokine sur le système immunitaire reste donc à identifier. L’IL-27 appartient à la famille de l’IL-6 composée d’une sous-unité cytokinique, p28, associée à un récepteur soluble « l’Epstein-Barr virus-induced gene 3» (EBI3). La sous-unité p28 peut s’associer avec le récepteur soluble CLF pour former une cytokine capable d’activer les lymphocytes T. Dans le but de caractériser cette cytokine, nous avons montré que p28/CLF agit aussi sur les lymphocytes B et permet leur différenciation en plasmocytes. Le partage de l’IL-6R par l’IL-6 et p28/CLF semble être à l’origine de la similarité des effets de ces deux cytokines. De plus, nous avons observé des effets semblables à ceux de l’IL-6 suite à l’association de la sous-unité p28 seule avec la chaîne IL-6Rα. En effet, afin de mieux caractériser la cytokine p28/CLF, nous avons étudié les effets dus au recrutement de la chaîne IL-6Rα par la sous-unité p28. Les cytokines de la famille de l’IL-6 sont composées de quatre hélices α disposées de façon anti-parallèle deux à deux. La sous-unité p28 possède, au niveau d’une boucle reliant deux hélices α, un motif de plusieurs acides glutamiques consécutifs (motif polyE) qui n’est retrouvé dans aucune autre cytokine de cette famille. Nous avons démontré que ce motif est impliqué dans la liaison de cette sous-unité avec l’hydroxyapatite et l’os. Cette caractéristique de p28 pourrait permettre un ciblage de l’IL-27 (p28/EBI3) et de p28/CLF préférentiellement vers la niche endostéale des cellules souches et des cellules immunitaires.

ARF1 contrôle la migration des cellules hautement invasives du cancer du sein via Rac1

Dans un contexte où la forte prévalence du cancer du sein chez les femmes demeure depuis plusieurs années un enjeu de société majeur, les nouvelles stratégies visant à réduire la mortalité associée à cette maladie sont le sujet de nombreuses recherches scientifiques. Les facteurs d’ADP-ribosylation sont des petites protéines G monomériques importantes pour la réorganisation du cytosquelette d’actine, le remodelage des lipides membranaires et la formation de vésicules. Notre laboratoire a précédemment montré qu’ARF1 est surexprimée dans les cellules hautement invasives du cancer du sein et contribue à leur phénotype migratoire accru. Dans le cadre de ce mémoire, nous avons défini le rôle de cette GTPase dans la migration de telles lignées cellulaires. Pour ce faire, nous avons étudié le rôle d’ARF1 dans l’activation de Rac1, un membre de la famille des GTPases Rho connu pour son implication dans la formation de lamellipodes ainsi que dans la migration cellulaire. Globalement, nous avons déterminé que l’activation d’ARF1 permet l’activation subséquente de Rac1 ainsi que de la voie de signalisation nécessaire au processus de migration. Par une approche d’interférence à l’ARN dans les cellules MDA-MB-231, nous avons d’abord montré la contribution essentielle de Rac1 la migration dépendante d’ARF1. Puis, de façon à établir le mécanisme derrière cette régulation, nous avons montré que l’inhibition de l’expression endogène d’ARF1 altère l’activation de Rac1 dépendante de l’EGF. Nous avons ensuite examiné les conséquences d’une telle inhibition sur les partenaires d’interaction de Rac1. Nous avons découvert qu’ARF1 et Rac1 forment un complexe constitutif, puis qu’ARF1est nécessaire à l’association de Rac1 à IRSp53, une protéine importante dans la formation de lamellipodes. La translocation dépendante de l’EGF du complexe Rac1/IRSp53 à la membrane plasmique est également sous le contrôle d’ARF1. En conclusion, cette étude fournit un nouveau mécanisme par lequel ARF1 régule la migration cellulaire et identifie cette GTPase en tant que cible pharmacologique prometteuse pour freiner le développement des métastases chez les patients atteints du cancer du sein.

Reconnaissance émotionnelle faciale et psychopathie : un protocole exploratoire à l’aide de personnages virtuels animés

La présente recherche est constituée de deux études. Dans l’étude 1, il s’agit d’améliorer la validité écologique des travaux sur la reconnaissance émotionnelle faciale (REF) en procédant à la validation de stimuli qui permettront d’étudier cette question en réalité virtuelle. L’étude 2 vise à documenter la relation entre le niveau de psychopathie et la performance à une tâche de REF au sein d’un échantillon de la population générale. Pour ce faire, nous avons créé des personnages virtuels animés de différentes origines ethniques exprimant les six émotions fondamentales à différents niveaux d’intensité. Les stimuli, sous forme statique et dynamique, ont été évalués par des étudiants universitaires. Les résultats de l’étude 1 indiquent que les stimuli virtuels, en plus de comporter plusieurs traits distinctifs, constituent un ensemble valide pour étudier la REF. L’étude 2 a permis de constater qu’un score plus élevé à l’échelle de psychopathie, spécifiquement à la facette de l’affect plat, est associé à une plus grande sensibilité aux expressions émotionnelles, particulièrement pour la tristesse. Inversement, un niveau élevé de tendances criminelles est, pour sa part, associé à une certaine insensibilité générale et à un déficit spécifique pour le dégoût. Ces résultats sont spécifiques aux participants masculins. Les données s’inscrivent dans une perspective évolutive de la psychopathie. L’étude met en évidence l’importance d’étudier l’influence respective des facettes de la personnalité psychopathique, ce même dans des populations non-cliniques. De plus, elle souligne la manifestation différentielle des tendances psychopathiques chez les hommes et chez les femmes.

Study of the subcellular localization of cell cycle regulator Cks1 and its impact on cancer

La progression dans le cycle cellulaire est contrôlée par de vagues oscillantes de cyclines et des kinases cycline-dépendantes (Cdk). Ces kinases sont régulées positivement par l’association des sous-unités cyclines régulatrices et négativement en se liant aux inhibiteurs de Cdk. Parmi ces derniers, p27 inhibe tous les complexes cycline-Cdk quelle que soit la phase cellulaire et agit en tant que régulateur négatif principal de la prolifération cellulaire dans une variété de cellules et de tissus. Intrinsèquement, p27 phosphorylé est ubiquitiné et dégradé par le complexe SCFSkp2-Cks1. Des études génétiques de la souris, ainsi que des examens cliniques chez l’homme, ont montré que p27 est un important suppresseur de tumeur. Le gène est rarement muté. Cependant, p27 est fréquemment réprimé dans les cancers humains en raison d’une augmentation de l’expression de Skp2 et de Cks1 dans le noyau, ce qui est généralement associée à un mauvais pronostic. La localisation subcellulaire de Cks1 est donc d'une importance primordiale dans le contrôle de la prolifération cellulaire. Les résultats récents de notre laboratoire ont montré une interaction entre Cks1 et les protéines de transport nucléaire importine α1 et β3. Aussi, l’analyse de la séquence primaire de Cks1 a également révélé un signal de localisation nucléaire classique (NLS) à son extrémité C-terminale. Des mutations ont été effectuées sur le NLS suspect pour déterminer si oui ou non l'import nucléaire de Cks1 était contrôlé par cette séquence. Un inhibiteur synthétique de l’importine β a également été utilisé pour étudier l’import de Cks1 dans le noyau. Les résultats indiquent que l’extrémité C-terminale de Cks1 est en effet un NLS puisque les mutations de Cks1 et l'inhibition de l’importine β conduisent, tous deux, à l'accumulation de Cks1 dans le cytoplasme. Ces résultats ont été utiles pour mieux comprendre le mécanisme régulant la localisation de Cks1. Toutefois, des travaux futurs sont nécessaires pour mieux comprendre l'impact de la séquestration cytoplasmique de Cks1 sur le cancer et ainsi espérer aboutir à l'identification de nouvelles cibles pharmacologiques impliqués dans la prolifération cellulaire.

Expression du facteur de transcription SRF chez les chevaux atteints de souffle

Il a été démontré que les chevaux atteints du souffle présentent une augmentation de la masse de muscle lisse entourant les voies respiratoires comparativement à des chevaux sains (Herszberg, Ramos-Barbon et al. 2006, Leclere, Lavoie-Lamoureux et al. 2011). L’augmentation de la masse de muscle lisse ainsi observée résulte d’une hyperplasie, et possiblement, d’une hypertrophie des myocytes. Les traitements usuels du souffle ne sont que partiellement efficaces à diminuer cette augmentation. L’objectif de cette étude était d’explorer les mécanismes moléculaires impliqués dans ces changements affectant la cellule musculaire lisse dans la pathologie du souffle chez le cheval. Pour ce faire, nous avons examiné les effets d’une exposition antigénique sur l’expression du «Serum Response Factor» (SRF) dans le muscle lisse bronchique. Le SRF est un facteur de transcription localisé dans le noyau de la cellule musculaire lisse et régulant l’expression génique de celle-ci en favorisant un phénotype prolifératif ou contractile. Les résultats démontrent qu’avant exposition antigénique, les pourcentages de cellules exprimant le SRF sont faibles. Une augmentation significative du pourcentage de myocytes exprimant le SRF survient suite à une stimulation antigénique chez les chevaux atteints de souffle alors qu’aucune augmentation n’est observée chez les chevaux contrôles. Ces résultats suggèrent que le SRF pourrait contribuer au remodelage du muscle lisse péribronchique dans la pathologie du souffle.

La régulation du gène CYP19A1 dans les cellules de granulosa bovine in vitro

L’oestradiol joue un rôle important dans la reproduction en général, particulièrement dans la croissance folliculaire chez la vache. La production de l’œstradiol nécessite l’expression du gène CYP19A1 suite à la stimulation des cellules de granulosa par l’hormone folliculostimulante (FSH) ou le facteur de croissance insulinique de type 1 (IGF-1). Chez la vache, il existe six promoteurs (1.1 ; 1.2 ; 1.3 ; 1.4 ; 1.5 et 2) qui dirigent la transcription du gène CYP19A1 dans les cellules de la granulosa. Le principal promoteur qui dirige la transcription au niveau de l’ovaire (cellules de granulosa) est le promoteur 2 (P2). Cependant, l’effet de la FSH et de l’IGF-1 sur l’activation de ces promoteurs d’aromatase demeure mal connu. De plus, la demi-vie du transcrit CYP19A1 est très courte avec une région 3’UTR relativement longue. L’analyse de la séquence 3’UTR montre la présence des motifs ARE (séquence riche en AU), des études antérieur montrent que ces séquences impliquent dans la régulation de la stabilité ou la dégradation de l’ARNm, ce qui est fort probable que la courte demi-vie de l’ARNm CYP19A1 est sous le contrôle post-transcriptionel. L’objectif de la thèse visait à étudier la régulation de l’expression du gène CYP19A1 chez la vache. Il y a deux thèmes soit étude de la régulation transcriptionnelle ciblant le promoteur et soit étude de la régulation post-transcriptionnelle impliquant la région 3’non traduite (3’UTR). Le premier objectif vise à étudier la régulation transcriptionnelle du gène CYP19A1. Nous avons étudié l'activité du promoteur ovarien bovin dans deux modèles de cellules de la granulosa, les cellules lutéinisées et nonlutéinisées in vitro, suite à une stimulation des cellules par la FSH ou IGF-1. Nous avons également évalué la voie de signalisation impliquée dans la régulation des différents promoteurs en utilisant un RT-PCR et un gène rapporteur (les différents promoteurs d’aromatase ont été insérés dans le vecteur pGL3promoter en amont du gène exprimant la luciférase). Les résultats de RT-PCR démontrent que la FSH et l’IGF-1 augmentent les concentrations d’ARNm provenant des deux promoteurs 2 et 1.1 dans les cellules de la granulosa non lutéinisées. Des expériences subséquentes ont montré que la FSH stimule le promoteur 2 via la voie PKA tandis que l'IGF-1 stimule le promoteur 2 via la voie PKC. La FSH et l’IGF-1 stimulent l’expression du promoteur 1.1 via la voie PI3K. L’analyse de l’activité luciférase démontre que dans les cellules de granulosa lutéinisées, la FSH stimule le promoteur 1.1 de façon dose dépendante et ne semble y avoir aucun effet significatif sur le promoteur 2. Nous avons donc comparé l’activité du promoteur PII/P2 humain, du rat, de la chèvre et de la vache dans les cellules de granulosa bovine lutéinisées. Le résultat le plus significatif est que le promoteur 2 bovine (et caprine) dépend de plusieurs facteurs de transcription (NR5A2, FOXL2) comparé au promoteur PII humain et celui du promoteur proximal du rat qui dépendent principalement de l'AMPc. En effet, nos résultats ont démontré une expression raisonnablement robuste du P2 bovine lorsque les cellules sont traitées à la forskoline, NR5A2 et FOXL2. Le facteur FOXL2 semble déterminer l'activité du promoteur 2 chez le ruminant. Le deuxième objectif vise à étudier la régulation post-transcriptionnelle du gène CYP19A1. Pour ce faire, nous avons déterminé la séquence minimale de l'ARNm CYP19A1 requise pour la régulation de sa demi-vie. Différents séquences de la région 3’UTR ont été insérés dans le vecteur pGL3promoter en aval du gène exprimant la luciférase ou soit dans le vecteur pGEMTeasy. Le vecteur pGL3promoter a été transfecté dans les cellules de granulosa lutéinisées pour évaluer l'impact de la séquence 3'UTR sur l'expression du gène rapporteur de la luciférase, alors que le vecteur pGEMTeasy a été utilisé pour la transcription in vitro afin de générer de l’ARNm. Ce dernier sera utilisé en réaction croisée au UV avec des extraits protéiques pour démontrer l’association du complexe ARNm/protéine. L’analyse de l’activité luciférase a permis d’identifier une séquence de 200 pb située entre 926 et 1134 pb de la région 3'UTR de l’ARNm CYP19A1 qui a réduit significativement l’activité de la luciférase. Selon les analyses de la réaction croisée au UV, une ou plusieurs protéines de 66 et 80 kDA se lient spécifiquement à la séquence de 200 pb qui réduit l’activité de luciférase. Cette protéine s'exprime dans les cellules de granulosa, mais n’a pas été détectée dans d'autres tissus comme le foie et le cœur. Par ailleurs, l’utilisation du gène rapporteur sensible à la FSH a suscité l’intérêt d'une compagnie pharmaceutique qui vend de l’equine chorionic gonadotropin (eCG) pour lui permettre de distinguer facilement l’eCG ayant une forte activité FSH et donc, avoir un produit commercial plus efficace et de meilleure qualité. Dans cette étude, nous avons développé un système de bioessai à la FSH basé sur la transfection des cellules avec un récepteur à la FSH et un gène rapporteur colorimètrique qui permet d’estimer l’activité de la FSH dans le sérum de la jument et qui pourrait être applicable au niveau de la ferme/industrie.

Voies de signalisation non-canoniques du récepteur V2 de la vasopressine

Le récepteur V2 (V2R) de la vasopressine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG), jouant un rôle fondamental dans le maintien de l’homéostasie hydrosodique. À l’instar de nombreux RCPGs, il est capable d’interagir avec plusieurs types de protéines G hétérotrimériques et possède des voies de signalisation peu explorées aux mécanismes mal compris. Ces voies non canoniques font l’objet des travaux exposés dans ce mémoire. Il s’agit d’explorer les caractéristiques et mécanismes de la signalisation de V2R via G12, et de la voie d’activation d’ERK 1/2 par transactivation du récepteur de l’insulin-like growth factor 1, IGF1R. Par des études de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), nous exposons la capacité de V2R à interagir avec la sous-unité Gα12 ainsi que la modulation de la conformation de l’hétérotrimère G12 par l’agoniste de V2R, l’arginine-vasopressine. Ces travaux dévoilent également la modulation de l’interaction entre Gα12 et son effecteur classique RhoA, suggérant un engagement de RhoA, ainsi que la potentialisation via Gα12 de la production d’AMP cyclique. À l’aide de diverses méthodes d’inhibition sélective, nos résultats précisent les mécanismes de la transactivation. Ils supportent notamment le rôle initiateur de l’activation de Src par V2R et l’absence d’implication des ligands connus d’IGF1R dans la transactivation. La métalloprotéase MMP 3 apparaît par ailleurs comme un bon candidat pour réguler la transactivation. Ce projet met en lumière des modes de signalisation peu explorés de V2R, dont l’implication physiologique et physiopathologique pourrait s’avérer significative, au-delà d’un apport fondamental dans la compréhension de la signalisation des RCPGs.

Role of the ASPP Family in the Regulation of p53-Mediated Apoptotic Death of Retinal Ganglion Cells after Optic Nerve Injury

Le glaucome est la première cause de cécité irréversible à travers le monde. À présent il n’existe aucun remède au glaucome, et les thérapies adoptées sont souvent inadéquates. La perte de vision causée par le glaucome est due à la mort sélective des cellules rétiniennes ganglionnaires, les neurones qui envoient de l’information visuelle de la rétine au cerveau. Le mécanisme principal menant au dommage des cellules rétiniennes ganglionnaires lors du glaucome n’est pas bien compris, mais quelques responsables putatifs ont été proposés tels que l’excitotoxicité, le manque de neurotrophines, la compression mécanique, l’ischémie, les astrocytes réactifs et le stress oxidatif, parmis d’autres. Indépendamment de la cause, il est bien établi que la perte des cellules rétiniennes ganglionnaires lors du glaucome est causée par la mort cellulaire programmée apoptotique. Cependant, les mécanismes moléculaires précis qui déclenchent l’apoptose dans les cellules rétiniennes ganglionnaires adultes sont mal définis. Pour aborder ce point, j’ai avancé l’hypothèse centrale que l’identification de voies de signalisations moléculaires impliquées dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires offrirait des avenues thérapeutiques pour ralentir ou même prévenir la mort de celles-ci lors de neuropathies oculaires telles que le glaucome. Dans la première partie de ma thèse, j’ai caractérisé le rôle de la famille de protéines stimulatrices d’apoptose de p53 (ASPP), protéines régulatrices de la famille p53, dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires. p53 est un facteur de transcription nucléaire impliqué dans des fonctions cellulaires variant de la transcription à l’apoptose. Les membres de la famille ASPP, soit ASPP1, ASPP2 et iASPP, sont des protéines de liaison de p53 qui régulent l’apoptose. Pourtant, le rôle de la famille des ASPP dans la mort des cellules rétiniennes ganglionnaires est inconnu. ASPP1 et ASPP2 étant pro-apoptotiques, l’hypothèse de cette première étude est que la baisse ciblée de ASPP1 et ASPP2 promouvrait la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires après une blessure du nerf optique. Nous avons utilisé un modèle expérimental bien caractérisé de mort apoptotique neuronale induite par axotomie du nerf optique chez le rat de type Sprague Dawley. Les résultats de cette étude (Wilson et al. Journal of Neuroscience, 2013) ont démontré que p53 est impliqué dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires, et qu’une baisse ciblée de ASPP1 et ASPP2 par acide ribonucléique d’interference promeut la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires. Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai caractérisé le rôle d’iASPP, le membre anti-apoptotique de la famille des ASPP, dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires. L’hypothèse de cette seconde étude est que la surexpression d’iASPP promouvrait la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires après axotomie. Mes résultats (Wilson et al. PLoS ONE, 2014) démontrent que le knockdown ciblé de iASPP exacerbe la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires, et que la surexpression de iASPP par virus adéno-associé promeut la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes régulateurs sous-jacents la perte de cellules rétiniennes ganglionnaires par apoptose et pourraient fournir des pistes pour la conception de nouvelles stratégies neuroprotectrices pour le traitement de maladies neurodégénératives telles que le glaucome.

La voie de régulation de la traduction de l’ARNm ASH1 : une concertation entre Khd1, Puf6 et Loc1

La localisation des ARNm par transport dirigé joue un rôle dans le développement, la motilité cellulaire, la plasticité synaptique et la division cellulaire asymétrique. Chez la levure Saccharomyces cerevisiæ, la localisation d’ARNm est un phénomène dont les mécanismes de régulation sont conservés auprès de nombreux autres organismes. Lors de la division de la levure, plus d’une trentaine de transcrits sont localisés par transport actif à l’extrémité du bourgeon de la cellule-fille. Parmi ceux-ci, l’ARNm ASH1 est le mieux caractérisé et constitue le modèle utilisé dans cette étude. Pour exercer sa fonction, la protéine Ash1 doit être produite uniquement après la localisation de l’ARNm ASH1. Pour ce faire, les mécanismes de régulation de la traduction de l’ARNm ASH1 empêchent son expression durant le transport. Ce projet de recherche vise à étudier les mécanismes de régulation de la traduction de l’ARNm ASH1 par les répresseurs traductionnels connus, soit Khd1, Puf6 et Loc1. Les études antérieures se sont penchées sur ces facteurs de manière individuelle. Cependant, dans cette étude, nous avons exploré la présence d’une collaboration entre ceux-ci. Ainsi, nous avons voulu déterminer si les répresseurs traductionnels peuvent être intégrés en une seule voie de régulation de la traduction de l’ARNm ASH1. De plus, nous avons cherché à identifier le mécanisme de recrutement des répresseurs traductionnels sur l’ARNm ASH1, qui correspond au point initial des voies de régulations de l’ARNm ASH1. Nos résultats montrent que les répresseurs traductionnels de l’ARNm ASH1, soit Khd1 et Puf6, font partie d’une même voie de régulation de la traduction. Le rôle du facteur nucléaire Loc1 dans la voie de régulation de la traduction, quant à elle, a été examinée à partir d’expériences permettant l’étude du mécanisme de recrutement des répresseurs traductionnels dans le noyau. Ainsi, nos travaux montrent que Puf6 et Loc1 sont associés de manière ARN-dépendant avec la machinerie de transcription, notamment au facteur d’élongation de la transcription Spt4-Spt5/DSIF. Par ailleurs, notre laboratoire a précédemment montré que la localisation nucléaire de la protéine de liaison à l’ARN She2 est essentielle au recrutement des facteurs Loc1 et Puf6 sur l’ARNm ASH1. Des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) supportent l’hypothèse que le recrutement de Loc1 est essentiel à celui de Puf6, qui s’effectue ultérieurement. Ainsi, à partir des résultats de cette étude et des résultats publiés précédemment dans notre laboratoire, nous avons élaboré un modèle de recrutement coordonné des facteurs She2, Loc1 et Puf6 sur l’ARNm ASH1 naissant. De manière générale, cette étude a permis d’établir la présence d’une seule voie de régulation de la traduction de l’ARNm ASH1 et une meilleure connaissance du recrutement des facteurs de répression traductionnelle sur celui-ci.

Facteurs de risque d’insuffisance rénale chronique chez les greffés cardiaques : du phénotype aux tests pharmacogénomiques

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est un problème majeur fréquemment rencontré chez les greffés cardiaques. Les inhibiteurs de la calcineurine, pierre angulaire de l’immunosuppression en transplantation d’organes solides, sont considérés comme une des principales causes de dysfonction rénale postgreffe. Plusieurs autres éléments tels que les caractéristiques démographiques, cliniques et génétiques du receveur contribuent également au phénomène, mais il demeure plutôt difficile de déterminer quels sont les patients les plus à risque de développer une IRC après la transplantation. Ainsi, la découverte de nouveaux marqueurs génétiques de dysfonction rénale pourrait un jour mener à l’individualisation de la thérapie immunosuppressive selon le profil génétique de chaque patient. Or, on ne connaît pas les opinions des greffés à l’égard des tests pharmacogénomiques et l’on ne sait pas si celles-ci diffèrent des opinions exprimées par les individus en bonne santé. Cette thèse de doctorat a donc pour objectifs : 1- De décrire l’évolution de la fonction rénale à très long terme après la transplantation et d’identifier les marqueurs démographiques et phénotypiques associés à l’IRC postgreffe cardiaque; 2- D’identifier les marqueurs génétiques associés à la néphrotoxicité induite par les inhibiteurs de la calcineurine; 3- D’évaluer et de comparer les attitudes des patients et des individus en bonne santé par rapport à l’intégration clinique potentielle des marqueurs pharmacogénomiques. Trois projets ont été réalisés pour répondre à ces questions. Le premier repose sur une analyse rétrospective de l’évolution de la fonction rénale chez les patients greffés au sein de notre établissement entre 1983 et 2008. Nous y avons découvert que le déclin de la fonction rénale se poursuit jusqu’à 20 ans après la transplantation cardiaque et que les facteurs de risque d’IRC incluent entre autres l’âge avancé, le sexe féminin, la dysfonction rénale prégreffe, l’hypertension, l’hyperglycémie et l’utilisation de la prednisone. Le deuxième projet est une étude pharmacogénomique s’intéressant aux déterminants génétiques de la néphrotoxicité induite par les inhibiteurs de la calcineurine. Elle nous a permis d’illustrer pour la première fois qu’un polymorphisme génétique lié à PRKCB (gène codant pour la protéine kinase C-β) est associé avec la fonction rénale des patients greffés cardiaques, alors que cela n’est probablement pas le cas pour les polymorphismes de TGFB1 (gène codant pour le transforming growth factor-β1). La troisième section de cette thèse rapporte les résultats d’un questionnaire dont le but était de comparer les attitudes envers les tests pharmacogénomiques parmi un groupe de personnes en bonne santé, de patients greffés cardiaques et de patients souffrant d’insuffisance cardiaque. Cette étude a démontré que, bien que l’enthousiasme pour la pharmacogénomique soit partagé par tous ces individus, les craintes liées à la confidentialité et aux répercussions potentielles sur l’emploi et les assurances sont plus prononcées chez les personnes en bonne santé. En résumé, les travaux issus de cette thèse ont révélé que l’identification précoce des patients greffés cardiaques les plus susceptibles de présenter une détérioration de la fonction rénale ainsi que l’adoption d’une approche thérapeutique individualisée reposant notamment sur les applications cliniques de la pharmacogénomique pourraient éventuellement permettre de freiner cette complication postgreffe.

Caractérisation du gène de l'enzyme de conversion de l'angiotensine-2 dans le rein diabétique et implication dans le développement de la néphropathie diabétique et de l'hypertension

De nombreuses études ont bien démontré que l’activation du système rénine-angiotensine (RAS) joue un rôle important dans le développement de l’hypertension et de la néphropathie diabétique (DN). La découverte de l’enzyme de conversion de l’angiotensine-2 (ACE2) et l’identification du récepteur MAS, spécifique pour l’angiotensine 1-7 (Ang 1-7), ont permis d’identifier deux nouveaux membres du RAS. L’axe ACE2/Ang 1-7/MAS contrebalance les effets de l’axe ACE/Ang II/AT1. Plusieurs évidences impliquent la contribution du RAS intrarénal dans la DN. Des études réalisées dans notre laboratoire avec des souris transgéniques surexprimant l’angiotensinogène de rat dans les cellules de leurs tubules proximaux rénaux (RPTCs) ont permis de démontrer l’importance du RAS intrarénal dans l’induction de l’hypertension et les dommages rénaux. Nous avons également observé que l’expression rénale de l’ACE2 et les niveaux urinaires d’ANG 1-7 sont plus faibles chez les souris Akita (diabète de type 1) et qu’un traitement avec des bloqueurs du RAS permet de normaliser l’expression de l’ACE2 et de prévenir le développement de l’hypertension dans le modèle des souris Akita. Dans un milieu diabétique, à la fois la glycémie et l’angiotensine II (Ang II) peuvent induire la génération des espèces réactives de l’oxygène (ROS), contribuant ainsi aux dommages rénaux. Afin d’explorer la relation entre les ROS, ACE2 et la DN, nous avons créé des souris Akita transgéniques surexprimant la catalase (Cat) dans les RPTCs, en croisant des souris Akita diabétique de type 1 à notre modèle de souris transgéniques surexprimant la Cat de rat dans les RPTCs. Dans une seconde étude, des souris Akita ont été traitées avec l’Ang 1-7 ou une combinaison d’Ang 1-7 et de son antagoniste, A779, afin d’étudier la relation entre l’action de l’Ang 1-7, l’hypertension systolique (sHTN), le stress oxydatif, les dommages rénaux, ACE2 et l’expression du récepteur Mas. Nos résultats ont montré que la surexpression de Cat atténue le stress oxydatif rénal; prévient l’hypertension, améliore le taux de filtration glomérulaire, l’albuminurie, l’hypertrophie rénale, la fibrose tubulo-interstitielle et l’apoptose tubulaire; et supprime l’expression des gènes profibrotiques et proapoptotiques dans les RPTCs des souris Akita Cat-Tg lorsque comparées aux souris Akita. De plus, la surexpression de Cat dans les RPTC des souris Akita normalise l’expression rénale de l’ACE2 et les niveaux urinaires d’Ang 1-7. D’autre part, l’administration d’Ang 1-7 prévient l’hypertension systémique, normalise le ratio albumine/créatinine urinaire et atténue l’hyperfiltration glomérulaire des souris Akita, sans affecter la glycémie sanguine. De plus, le traitement avec l’Ang 1-7 atténue aussi le stress oxydatif et l’expression de la NADPH oxydase, Agt, ACE, TGF-β1 (transforming growth factor-β1) et collagène IV, tout en augmentant l’expression de l’ACE2 et du récepteur Mas dans les reins des souris Akita. Ces effets sont renversés par la co-admininstration d’A779. Ces résultats démontrent que la surexpression de Cat prévient l’hypertension et la progression de la néphropathie, en plus de mettre en lumière l’importance du stress oxydatif intrarénal et l’expression de l’ACE2 comme facteurs contribuant à l’hypertension et les dommages rénaux observés dans le diabète. En outre, nos données suggèrent que l’Ang 1-7 joue un rôle protecteur dans l’hypertension et les dommages aux RPTC dans le diabète, principalement en réduisant les voies de signalisations du stress oxydatif dans les reins et en normalisant l’expression de l’ACE2 et du récepteur Mas. Nos résultats indiquent aussi que l’Ang 1-7 pourrait agir comme un agent thérapeutique potentiel dans le traitement de l’hypertension systémique et les dommages rénaux observés dans le diabète. En conséquence, l’Ang 1-7 est responsable du rôle protecteur de l’ACE2 dans l’hypertension et la DN.

Impact de la maladie du greffon contre l’hôte sur la reconstitution immunitaire suite à une transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques

La transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques (ASCT) est couramment utilisée pour traiter différents cancers hématologiques. Malheureusement, l’effet bénéfique de cette technique est limité par la réaction du greffon contre l’hôte (GVHD) qui demeure la cause principale de mortalité post-greffe. La GVHD endommage différents organes et retarde la reconstitution immunitaire des lymphocytes T (LT) ce qui augmente les risques d’infection et de rechute. Le développement de nouveaux traitements permettant d’accélérer la reconstitution immunitaire augmenterait donc les chances de survie des patients greffés. Il existe deux façons de régénérer des LT: via la thymopoïèse qui consiste à produire de nouveaux LT, ou par la prolifération homéostatique (PH) qui implique l’expansion rapide des LT matures retrouvés dans le greffon. La PH requiert deux signaux essentiels: l’interleukine-7 (IL-7) et la présentation d’antigènes du soi par les cellules dendritiques (DC) via le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) I pour les LT CD8+ et le CMH II pour les LT CD4+. Dans un contexte d’ASCT, la chimiothérapie et la GVHD endommagent le thymus rendant la thymopoïèse inefficace. Par conséquent, la reconstitution immunitaire repose presque entièrement sur la PH des LT. L’objectif de cette thèse était de comprendre comment la GVHD affecte la reconstitution des LT. Grâce à un modèle murin, nous avons démontré que la PH des LT CD4+ est absente durant la GVHD et ce, dû à de faibles niveaux d’IL-7 et une diminution du nombre de DC. La perte des DC est en grande partie causée par des niveaux réduits de stromal derived factor-1α (SDF-1α) et par l’absence de progéniteurs de DC dans la moelle osseuse des souris en GVHD. Le traitement des souris en GVHD avec du SDF-1α permet d’augmenter le nombre de DC, et lorsqu’administré avec l’IL-7, améliore significativement la PH des LT CD4+. Contrairement aux LT CD4+, l’administration d’IL-7 seule est suffisante pour restaurer la PH des LT CD8+ durant la GVHD et ce, même en absence des DC. Ces différences s’expliquent pour deux raisons : 1) l’expression du CMH I, contrairement au CMH II, n’est pas limitée aux DC mais est également exprimée par les cellules stromales du receveur ce qui est suffisant pour induire la PH des LT CD8+ et 2) les LT CD8+ répondent à des concentrations plus faibles d’IL-7 systémique comparativement aux LT CD4+. En conclusion, l’ensemble de ces résultats permettra de mettre en place des études translationnelles sur le potentiel thérapeutique du SDF-1α et de l’IL-7 dans la reconstitution immunitaire des patients greffés.

Quantitative proteomics methods for the analysis of histone post-translational modifications

Les histones sont des protéines nucléaires hautement conservées chez les cellules des eucaryotes. Elles permettent d’organiser et de compacter l’ADN sous la forme de nucléosomes, ceux-ci representant les sous unités de base de la chromatine. Les histones peuvent être modifiées par de nombreuses modifications post-traductionnelles (PTMs) telles que l’acétylation, la méthylation et la phosphorylation. Ces modifications jouent un rôle essentiel dans la réplication de l’ADN, la transcription et l’assemblage de la chromatine. L’abondance de ces modifications peut varier de facon significative lors du developpement des maladies incluant plusieurs types de cancer. Par exemple, la perte totale de la triméthylation sur H4K20 ainsi que l’acétylation sur H4K16 sont des marqueurs tumoraux spécifiques a certains types de cancer chez l’humain. Par conséquent, l’étude de ces modifications et des événements determinant la dynamique des leurs changements d’abondance sont des atouts importants pour mieux comprendre les fonctions cellulaires et moléculaires lors du développement de la maladie. De manière générale, les modifications des histones sont étudiées par des approches biochimiques telles que les immuno-buvardage de type Western ou les méthodes d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Cependant, ces approches présentent plusieurs inconvénients telles que le manque de spécificité ou la disponibilité des anticorps, leur coût ou encore la difficulté de les produire et de les valider. Au cours des dernières décennies, la spectrométrie de masse (MS) s’est avérée être une méthode performante pour la caractérisation et la quantification des modifications d’histones. La MS offre de nombreux avantages par rapport aux techniques traditionnelles. Entre autre, elle permet d’effectuer des analyses reproductibles, spécifiques et facilite l’etude d’un large spectre de PTMs en une seule analyse. Dans cette thèse, nous présenterons le développement et l’application de nouveaux outils analytiques pour l’identification et à la quantification des PTMs modifiant les histones. Dans un premier temps, une méthode a été développée pour mesurer les changements d’acétylation spécifiques à certains sites des histones. Cette méthode combine l’analyse des histones intactes et les méthodes de séquençage peptidique afin de déterminer les changements d’acétylation suite à la réaction in vitro par l’histone acétyltransférase (HAT) de levure Rtt109 en présence de ses chaperonnes (Asf1 ou Vps75). Dans un second temps, nous avons développé une méthode d’analyse des peptides isomériques des histones. Cette méthode combine la LC-MS/MS à haute résolution et un nouvel outil informatique appelé Iso-PeptidAce qui permet de déconvoluer les spectres mixtes de peptides isomériques. Nous avons évalué Iso-PeptidAce avec un mélange de peptides synthétiques isomériques. Nous avons également validé les performances de cette approche avec des histones isolées de cellules humaines érythroleucémiques (K562) traitées avec des inhibiteurs d’histones désacétylases (HDACi) utilisés en clinique, et des histones de Saccharomyces cerevisiae liées au facteur d’assemblage de la chromatine (CAF-1) purifiées par chromatographie d’affinité. Enfin, en utilisant la méthode présentée précédemment, nous avons fait une analyse approfondie de la spécificité de plusieurs HATs et HDACs chez Schizosaccharomyces pombe. Nous avons donc déterminé les niveaux d’acétylation d’histones purifiées à partir de cellules contrôles ou de souches mutantes auxquelles il manque une HAT ou HDAC. Notre analyse nous a permis de valider plusieurs cibles connues des HATs et HDACs et d’en identifier de nouvelles. Nos données ont également permis de définir le rôle des différentes HATs et HDACs dans le maintien de l’équilibre d’acétylation des histones. Dans l’ensemble, nous anticipons que les méthodes décrites dans cette thèse permettront de résoudre certains défis rencontrés dans l’étude de la chromatine. De plus, ces données apportent de nouvelles connaissances pour l’élaboration d’études génétiques et biochimiques utilisant S. pombe.