Semisynthetic aminoglycoside antibiotics : toward biomimetic synthesis, evasion of bacterial resistance and reduced toxicity

Les antibiotiques aminoglycosidiques sont des agents bactéricides de grande valeur et d’efficacité à large spectre contre les pathogènes Gram-positifs et Gram-négatifs, dont plusieurs membres naturels et semisynthétiques sont importants dans l’histoire clinique depuis 1950. Des travaux crystallographiques sur le ribosome, récompensés par le prix Nobel, ont démontré comment leurs diverses structures polyaminées sont adaptées pour cibler une hélice d’ARN dans le centre de codage de la sous-unité 30S du ribosome bactérien. Leur interférence avec l’affinité et la cinétique des étapes de sélection et vérification des tARN induit la synthèse de protéines à basse fidélité, et l’inhibition de la translocation, établissant un cercle vicieux d’accumulation d’antibiotique et de stress sur la membrane. En réponse à ces pressions, les pathogènes bactériens ont évolué et disséminé une panoplie de mécanismes de résistance enzymatiques et d’expulsion : tels que les N acétyltransférases, les O phosphotransférases et les O nucleotidyltransférases qui ciblent les groupements hydroxyle et amino sur le coeur des aminoglycosides; des méthyl-transférases, qui ciblent le site de liaison ribosomale; et des pompes d’expulsion actives pour l’élimination sélective des aminoglycosides, qui sont utilisés par les souches Gram-négatives. Les pathogènes les plus problématiques, qui présentent aujourd’hui une forte résilience envers la majorité des classes d’antibiotiques sur le bord de la pan-résistance ont été nommés des bactéries ESKAPE, une mnémonique pour Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa et Enterobacteriaceae. La distribution globale des souches avec des mécanismes de résistance envers les standards cliniques aminoglycosides, tels que la tobramycine, l’amikacine et la gentamicine, est comprise entre 20 et 60% des isolées cliniques. Ainsi, les aminoglycosides du type 4,6-disubstitués-2-deoxystreptamine sont inadéquats comme thérapies anti-infectieuses à large spectre. Cependant, la famille des aminoglycosides 4,5-disubstitués, incluant la butirosine, la neomycine et la paromomycine, dont la structure plus complexe, pourrait constituter une alternative. Des collègues dans le groupe Hanessian et collaborateurs d’Achaogen Inc. ont démontré que certains analogues de la paraomomycine et neomycine, modifiés par désoxygénation sur les positions 3’ et 4’, et par substitution avec la chaîne N1-α-hydroxy-γ-aminobutyramide (HABA) provenant de la butirosine, pourrait produire des antibiotiques très prometteurs. Le Chapitre 4 de cette dissertation présente la conception et le développement d’une stratégie semi-synthétique pour produire des nouveaux aminoglycosides améliorés du type 4,5 disubstitués, inspiré par des modifications biosynthétiques de la sisomicine, qui frustrent les mécanismes de résistance bactérienne distribuées globalement. Cette voie de synthèse dépend d’une réaction d’hydrogénolyse de type Tsuji catalysée par palladium, d’abord développée sur des modèles monosaccharides puis subséquemment appliquée pour générer un ensemble d’aminoglycosides hybrides entre la neomycine et la sisomicine. Les études structure-activité des divers analogues de cette nouvelle classe ont été évaluées sur une gamme de 26 souches bactériennes exprimant des mécanismes de résistance enzymatique et d’expulsion qui englobe l’ensemble des pathogènes ESKAPE. Deux des antibiotiques hybrides ont une couverture antibacterienne excellente, et cette étude a mis en évidence des candidats prometteurs pour le développement préclinique. La thérapie avec les antibiotiques aminoglycosidiques est toujours associée à une probabilité de complications néphrotoxiques. Le potentiel de toxicité de chaque aminoglycoside peut être largement corrélé avec le nombre de groupements amino et de désoxygénations. Une hypothèse de longue date dans le domaine indique que les interactions principales sont effectuées par des sels des groupements ammonium, donc l’ajustement des paramètres de pKa pourrait provoquer une dissociation plus rapide avec leurs cibles, une clairance plus efficace et globalement des analogues moins néphrotoxiques. Le Chapitre 5 de cette dissertation présente la conception et la synthèse asymétrique de chaînes N1 HABA β substitutées par mono- et bis-fluoration. Des chaînes qui possèdent des γ-N pKa dans l’intervalle entre 10 et 7.5 ont été appliquées sur une neomycine tétra-désoxygénée pour produire des antibiotiques avancés. Malgré la réduction considérable du γ N pKa, le large spectre bactéricide n’a pas été significativement affecté pour les analogues fluorés isosteriques. De plus, des études structure-toxicité évaluées avec une analyse d’apoptose propriétaire d’Achaogen ont démontré que la nouvelle chaîne β,β difluoro-N1-HABA est moins nocive sur un modèle de cellules de rein humain HK2 et elle est prometteuse pour le développement d’antibiotiques du type neomycine avec des propriétés thérapeutiques améliorées. Le chapitre final de cette dissertation présente la proposition et validation d’une synthèse biomimétique par assemblage spontané du aminoglycoside 66-40C, un dimère C2 symétrique bis-imine macrocyclique à 16 membres. La structure proposée du macrocycle a été affinée par spectroscopie nucléaire à un système trans,trans-bis-azadiène anti-parallèle. Des calculs indiquent que l’effet anomérique de la liaison α glycosidique entre les anneaux A et B fournit la pré-organisation pour le monomère 6’ aldéhydo sisomicine et favorise le produit macrocyclique observé. L’assemblage spontané dans l’eau a été étudié par la dimérisation de trois divers analogues et par des expériences d’entre croisement qui ont démontré la généralité et la stabilité du motif macrocyclique de l'aminoglycoside 66-40C.

Investigating the role of potential genetic markers that can predict risk for steroid refractory inflammatory bowel disease

Contexte - La variation interindividuelle de la réponse aux corticostéroïdes (CS) est un problème important chez les patients atteints de maladies inflammatoires d’intestin. Ce problème est bien plus accentué chez les enfants avec la prévalence de la corticodépendance extrêmement (~40 %) élevée. La maladie réfractaire au CS a des répercussions sur le développement et le bien-être physique et psychologique des patients et impose des coûts médicaux élevés, particulièrement avec la maladie active comparativement à la maladie en rémission, le coût étant 2-3 fois plus élevé en ambulatoire et 20 fois plus élevé en hôpital. Il est ainsi primordial de déterminer les marqueurs prédictifs de la réponse aux CS. Les efforts précédents de découvrir les marqueurs cliniques et démographiques ont été équivoques, ce qui souligne davantage le besoin de marqueurs moléculaires. L'action des CS se base sur des processus complexes déterminés génétiquement. Deux gènes, le ABCB1, appartenant à la famille des transporteurs transmembraneaux, et le NR3C1, encodant le récepteur glucocorticoïde, sont des éléments importants des voies métaboliques. Nous avons postulé que les variations dans ces gènes ont un rôle dans la variabilité observée de la réponse aux CS et pourraient servir en tant que les marqueurs prédictifs. Objectifs - Nous avons visé à: (1) examiner le fardeau de la maladie réfractaire aux CS chez les enfants avec la maladie de Crohn (MC) et le rôle des caractéristiques cliniques et démographiques potentiellement liés à la réponse; (2) étudier l'association entre les variantes d'ADN de gène ABCB1 et la réponse aux CS; (3) étudier les associations entre les variantes d'ADN de gène NR3C1 et la réponse aux CS. Méthodes - Afin d’atteindre ces objectifs, nous avons mené une étude de cohorte des patients recrutés dans deux cliniques pédiatriques tertiaires de gastroentérologie à l’Ottawa (CHEO) et à Montréal (HSJ). Les patients avec la MC ont été diagnostiqués avant l'âge de 18 ans selon les critères standard radiologiques, endoscopiques et histopathologiques. La corticorésistance et la corticodépendance ont été définies en adaptant les critères reconnus. L’ADN, acquise soit du sang ou de la salive, était génotypée pour des variations à travers de gènes ABCB1 et NR3C1 sélectionnées à l’aide de la méthodologie de tag-SNP. La fréquence de la corticorésistance et la corticodépendance a été estimée assumant une distribution binomiale. Les associations entre les variables cliniques/démographiques et la réponse aux CS ont été examinées en utilisant la régression logistique en ajustant pour des variables potentielles de confusion. Les associations entre variantes génétiques de ABCB1 et NR3C1 et la réponse aux CS ont été examinées en utilisant la régression logistique assumant différents modèles de la transmission. Les associations multimarqueurs ont été examinées en utilisant l'analyse de haplotypes. Les variantes nongénotypées ont été imputées en utilisant les données de HAPMAP et les associations avec SNPs imputés ont été examinées en utilisant des méthodes standard. Résultats - Parmi 645 patients avec la MC, 364 (56.2%) ont reçu CS. La majorité de patients étaient des hommes (54.9 %); présentaient la maladie de l’iléocôlon (51.7%) ou la maladie inflammatoire (84.6%) au diagnostic et étaient les Caucasiens (95.6 %). Huit pourcents de patients étaient corticorésistants et 40.9% - corticodépendants. Le plus bas âge au diagnostic (OR=1.34, 95% CI: 1.03-3.01, p=0.040), la maladie cœxistante de la région digestive supérieure (OR=1.35, 95% CI: 95% CI: 1.06-3.07, p=0.031) et l’usage simultané des immunomodulateurs (OR=0.35, 95% CI: 0.16-0.75, p=0.007) ont été associés avec la corticodépendance. Un total de 27 marqueurs génotypés à travers de ABCB1 (n=14) et NR3C1 (n=13) ont été en l'Équilibre de Hardy-Weinberg, à l’exception d’un dans le gène NR3C1 (rs258751, exclu). Dans ABCB1, l'allèle rare de rs2032583 (OR=0.56, 95% CI: 0.34-0.95, p=0.029) et génotype hétérozygote (OR=0.52, 95% CI: 0.28-0.95 p=0.035) ont été négativement associes avec la dépendance de CS. Un haplotype à 3 marqueurs, comprenant le SNP fonctionnel rs1045642 a été associé avec la dépendance de CS (p empirique=0.004). 24 SNPs imputés introniques et six haplotypes ont été significativement associés avec la dépendance de CS. Aucune de ces associations n'a cependant maintenu la signification après des corrections pour des comparaisons multiples. Dans NR3C1, trois SNPs: rs10482682 (OR=1.43, 95% CI: 0.99-2.08, p=0.047), rs6196 (OR=0.55, 95% CI: 0.31-0.95, p=0.024), et rs2963155 (OR=0.64, 95% CI: 0.42-0.98, p=0.039), ont été associés sous un modèle additif, tandis que rs4912911 (OR=0.37, 95% CI: 0.13-1.00, p=0.03) et rs2963156 (OR=0.32, 95% CI: 0.07-1.12, p=0.047) - sous un modèle récessif. Deux haplotypes incluant ces 5 SNPs (AAACA et GGGCG) ont été significativement (p=0.006 et 0.01 empiriques) associés avec la corticodépendance. 19 SNPs imputés ont été associés avec la dépendance de CS. Deux haplotypes multimarqueurs (p=0.001), incluant les SNPs génotypés et imputés, ont été associés avec la dépendance de CS. Conclusion - Nos études suggèrent que le fardeau de la corticodépendance est élevé parmi les enfants avec le CD. Les enfants plus jeunes au diagnostic et ceux avec la maladie coexistante de la région supérieure ainsi que ceux avec des variations dans les gènes ABCB1 et NR3C1 étaient plus susceptibles de devenir corticodépendants.

Postcolonial readings of resistance and negotiation in selected contemporary African writing

Cette dissertation traite des (re)configurations postcoloniales de la résistance et de la négociation comme concepts permettant d’aborder les représentations des conflits nationaux dans les littératures Africaines contemporaines. Ensemble, ces concepts ouvrent de nouvelles voix et possibilités de se remémorer, de raconter, et de lire la violence en problématisant non seulement les discours sur la guerre civile en Afrique, mais aussi les conceptions d’histoire nationale, de la mémoire, et de leur représentation. Si cette étude cherche à reconfigurer la négociation et la résistance au-delà des définitions qui tendent à les opposer, elle se consacre surtout à développer la notion de négociation comme stratégie de dépassement, de lecture, et d’écriture, qui, néanmoins, ne vise pas de résolution. La négociation implique ainsi une conception pluraliste d’un pouvoir d’action sociale, politique, et culturelle. Cette dissertation avance que la négociation est un concept d’écriture et de lecture qui intervient dans les événements, discours, et pratiques de remémoration en prenant compte de leurs multiplicités et définitions instables. Cette étude explore les manières selon lesquelles Nuruddin Farah, Chenjerai Hove, Yvonne Vera, Chimamanda Adichie, et Sefi Atta déploient la négociation et la résistance comme outils d’engagement esthétique et sociopolitique dans la narration de la violence en Somalie, au Zimbabwe, et au Nigeria. En outre, la négociation marque mon analyse de l’intervention des textes dans les discours d’historiographie et de représentation. Si ces romans mettent en exergue la généalogie complexe du conflit postcolonial, ils négocient aussi les implications multiples, incluant la leur, dans les questions problématiques de la responsabilité et de la représentation. La vii négociation représente un acte conscient à travers lequel nous reconnaissons l’instabilité de toute bataille politique, morale, ou éthique sans pour autant céder à un cynisme paralysant. De par son approche négociée et interdisciplinaire, cette dissertation ne fait pas qu’entrer en débat avec des discours multiples des études postcoloniales, Africaines, et littéraires. Elle intervient aussi dans les conceptions de la nation, la violence, la mémoire, la responsabilité, et la justice selon les études philosophiques, politiques, et culturelles. Outre les critiques littéraires, les chapitres interrogent les théories de penseurs tels Ngugi wa Thiong’o, David Jefferess, Pheng Cheah, et Wole Soyinka. Cette approche éclectique reflète l’attention des romans à la complexité irréductible des responsabilités individuelles et collectives dans les récits d’histoire et d’appartenance nationales. Cet engagement négocié avec les questions entourant la postcolonialité, malgré la dominance actuelle des discours de la globalisation, permet de reconceptualiser l’approche postcoloniale pour contrer les analyses déhistorisées et décontextualisées des conflits sociopolitiques en Afrique. Le chapitre 1 élabore les concepts clés de la dissertation. Le chapitre 2 explore la résistance et la négociation dans le langage figuré métonymique dans les représentations de la guerre en Somalie. Le chapitre 3 se consacre à l’analyse de la figure de la spectralité dans la narration de l’histoire et de la violence nationales au Zimbabwe. Finalement, le chapitre 4 négocie les concepts de représentation et de responsabilité dans les récits du trauma postcolonial au Nigeria. viii Mots-clés : négociation, résistance, littératures africaines, violence, responsabilité, nation, représentation

Characterization of antimicrobial resistance in Aeromonas and Vibrio isolated in Canada from fish and seafood

Plusieurs études ont examiné la sensibilité aux antimicrobiens chez les bactéries d’organismes provenant de produits issus de l’aquaculture ou de leur environnement. Aucune information n’est cependant disponible concernant la résistance aux antimicrobiens dans les bactéries de la flore de poissons ou de fruits de mer vendus au détail au Canada. C’est particulièrement vrai en ce qui a trait aux bactéries des genres Aeromonas et Vibrio, dont certaines espèces sont des agents pathogènes zoonotiques connus. Au cours de cette étude, la sensibilité aux antimicrobiens d’isolats d’Aeromonas spp. et de Vibrio spp. provenant de poissons et de crevettes domestiques et importés a été mesurée à l’aide de techniques de micro dilution en bouillon et/ou de diffusion sur disque. Les classes d’antimicrobiens examinés comprenaient les tétracyclines (TET), les inhibiteurs de la voie des folates (sulfadiméthoxine-triméthoprime, SXT), le florfenicol (FLO), et les quinolones (acide nalidixique / enrofloxacine, NA/ENO). Des valeurs seuils épidémiologiques pour Aeromonas et Vibrio ont été établies en utilisant la méthode d’interprétation normalisée des données de résistance provenant de diffusion sur disque. La recherche de gènes de résistance associés au profil de résistance des isolats a été effectuée en utilisant des PCRs et des puces ADN. Le nombre d’isolats résistants aux divers antimicrobiens parmi les 201 isolats d’Aeromonas et les 185 isolats de Vibrio étaient respectivement les suivants: TET (n=24 et 10), FLO (n=1 et 0), SXT (n=2 et 8), NA (n=7 et 5) et ENO (n= 5 et 0). Diverses associations de gènes tet(A), tet(B), tet(E), floR, sul1, sul2, et intI1 ont été détectées, les gènes tet(E), intI1, sul2 et tet(B) étant les plus communs. Les espèces d’Aeromonas et de Vibrio isolées de poissons au détail et de fruits de mer peuvent héberger une variété de gènes de résistance, bien que peu fréquemment. Le risque que représente ces gènes de résistance reste à évaluer en considérant le potentiel infectieux des bactéries, l’utilisation des ces agents antimicrobiens pour le traitement des maladies en aquaculture et en médecine humaine et leur rôle en tant que réservoir de la résistance antimicrobienne.

Fonctions antitumorales de la voie ERK/MAPK et développement rationnel de nouvelles stratégies thérapeutiques

Les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2) régulent une multitude de processus cellulaires, incluant la prolifération, la survie et la différenciation. Ces kinases représentent l’élément terminal de la voie ERK/MAPK, laquelle est activée dans près de 30% de tous les cancers humains et donc généralement perçue comme étant un effecteur critique de la progression tumorale. Cependant, une accumulation d’observations suggèrent que les kinases ERK pourraient également induire la suppression tumorale. Le but premier de cette thèse est de démontrer comment la signalisation par ERK peut contribuer à la suppression tumorale et de concilier les mécanismes impliqués avec son rôle dans la progression du cancer. Puisque nos travaux ont une incidence sur les bénéfices attendus de certaines thérapies actuellement en développement, le deuxième objectif de la thèse est de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour combattre le cancer. Nous avons démontré qu’une hyperactivation des kinases ERK induit la sénescence cellulaire. Le mécanisme implique la dégradation sélective et dépendante du protéasome de nombreuses protéines, ce que nous avons nommé le SAPD (Senescence-Associated Protein Degradation). Ce processus cible des protéines requises pour différentes fonctions cellulaires, incluant la progression du cycle cellulaire, les fonctions mitochondriales et la biogenèse des ribosomes. Ensuite, nos résultats montrent qu’en plus d’inhiber l’établissement de la sénescence, une diminution de la signalisation par les kinases ERK favorise la reprogrammation cellulaire, laquelle permet aux cellules précancéreuses de développer leur tumorigénicité et aux cellules cancéreuses d’acquérir des propriétés attribuables aux cellules souches. Ces observations suggèrent que les mécanismes qui inhibent la voie ERK/MAPK pourraient favoriser l’initiation du cancer, la formation de métastases et la résistance à diverses thérapies. Enfin, nous avons démontré que la metformine, utilisée pour le traitement du diabète, inhibe le facteur de transcription NF-kB. Ce dernier joue un rôle central dans la reprogrammation cellulaire et dans la production de cytokines pro-inflammatoires nocives par les cellules sénescentes. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que la metformine pourrait être utilisée en combinaison avec certaines thérapies afin d’éviter les effets secondaires tant d’une inhibition des kinases ERK que d’une hyperactivation. Globalement, les résultats présentés démontrent que l’effet de la voie ERK/MAPK dépend de la force de son activation. Alors qu’une activation modérée peut contribuer à la prolifération de la plupart des cellules, une forte activation induit la sénescence tandis qu’au contraire, une faible activation favorise la reprogrammation des cellules cancéreuses et donc une augmentation de l’agressivité de la tumeur. Cette polyvalence de la voie suggère une certaine prudence face à l’usage des inhibiteurs de la voie ERK/MAPK. Cependant, elle nous motive à travailler au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, lesquelles pourraient inclure la metformine.

Étude de l'impact de deux traitements, dont un sans antibiotiques, sur la santé digestive et les populations de Clostridium perfringens dans des élevages de poulets de chair.

Le problème grandissant de l’antibiorésistance remet en question plusieurs pratiques reliées à l’utilisation des antibiotiques, dont l’usage à grande échelle pour des fins de promotion de la croissance chez les animaux de consommation. Depuis 2006, le retrait des antibiotiques dans les élevages de poulets de chair en Europe a été associé à la résurgence d’entérite nécrotique, une maladie intestinale causée par la bactérie Clostridium perfringens. Alors que la pathogénie de la maladie semblait bien comprise, le retrait des antibiotiques a montré que peu de solutions de remplacement sont disponibles afin de prévenir cette maladie. Très peu d’études se sont intéressées à mieux caractériser la dynamique des populations de C. perfringens dans les élevages avicoles et l’effet que pouvait avoir le retrait des antibiotiques sur l’évolution de ces populations. La présente étude a évalué l’impact du remplacement des antibiotiques promoteurs de croissance et des anticoccidiens pendant une période de 14 mois, dans huit élevages commerciaux de poulets de chair au Québec. Un protocole d’élevage alternatif, combinant des stratégies telles que des produits à base d’huiles essentielles, des acides organiques et inorganique, une vaccination contre la coccidiose ainsi qu’une amélioration des conditions de démarrage des poussins, a été utilisé en remplacement des antimicrobiens. Les performances zootechniques, la santé digestive ainsi que l’occurrence d’entérite nécrotique pour les lots de poulets soumis au protocole d’élevage alternatif ont été comparées avec celles de lots de poulets de chair recevant une ration conventionnelle. Des analyses moléculaires basées sur la PCR et le PFGE ont été utilisées afin de documenter l’impact de la mise en place du protocole d’élevage alternatif sur les populations de C. perfringens. Les résultats obtenus montrent qu’aucune différence entre les groupes soumis aux deux types de protocoles n'est observée en ce qui a trait à la viabilité en élevage, à l'âge d'abattage et aux taux de condamnations à l'abattoir. Toutefois, les lots soumis au traitement alternatif ont eu des performances moindres pour le poids moyen à l'abattage, le gain moyen quotidien et la conversion alimentaire. Un peu plus de 27% des lots soumis au protocole alternatif ont connu un épisode d’entérite nécrotique clinique. Les analyses ont aussi montré que l’un ou l’autre des protocoles ne semble pas exercer d’influence particulière sur la dynamique temporelle des populations de C. perfringens. Pour les lots soumis au protocole d’élevage alternatif, une forte diversité génétique pour C. perfringens a été liée à un risque augmenté de vivre un épisode d’entérite nécrotique. À l’opposé, les lots alternatifs ayant vécu des épisodes récurrents de la maladie ont montré une diminution significative de la diversité génétique, ainsi qu’une augmentation marquée du nombre de souches de C. perfringens transportant plusieurs gènes de virulence. La présente étude a permis de mieux documenter, d’un point de vue économique et scientifique, la production de poulets de chair élevés sans antibiotiques ni anticoccidiens au Québec. Cette étude est la seule du genre s’étant intéressée à la caractérisation et à la comparaison dans le temps des flores de C. perfringens retrouvées dans les deux types d’élevages. Elle a révélé que la production à grande échelle de poulets de chair élevés sans antibiotiques ni anticoccidiens est possible au Québec, mais que celle-ci présente des impacts sur les performances zootechniques des oiseaux, sur leur santé digestive et sur la dynamique des populations de C. perfringens. Mots-clés : poulets de chair, antibiotiques, huiles essentielles, acides organiques, vaccination coccidiose, performances zootechniques, santé digestive, entérite nécrotique, Clostridium perfringens, dynamique populationnelle