Caractérisation des nanoparticules polymériques par la technique d'ultracentrifugation analytique

L’utilisation de nanoparticules (NPs) dans divers domaines industriels est de plus en plus fréquente ce qui génère leur propagation dans l’environnement. Selon leur persistance, mobilité, bioaccumulation et toxicité, des risques inconnus pour la santé et pour des écosystèmes peuvent en résulter. En effet, la caractérisation et la quantification sont des défis analytiques très complexes en raison de la nature dynamique (petite taille, grande réactivité et instabilité) des nanomatériaux. L'objectif de cette étude est donc de caractériser par ultracentrifugation analytique (AUC) des nanoparticules polymériques (Allosperse® dites allosphères) qui sont destinées à des fins agricoles. Pour y parvenir, différentes NPs métalliques (argent, quantum dot), oxydes métalliques (dioxyde de titane, oxyde de zinc) et NPs de polystyrène ont d’abord été mesurés par AUC à l’aide des différents systèmes de détection (absorbance, fluorescence et interférence). Dans le cas des allosphères, un grand nombre d'essais préliminaires ont été réalisés afin d'optimiser la vitesse d'ultracentrifugation, le temps d'ultracentrifugation, le nombre de numérisations et la concentration de l'échantillon. Un protocole optimisé a été utilisé pour la détermination du diamètre hydrodynamique (dh) des NPs. Les différentes analyses qui ont été réalisées dans cette étude révèlent que l’AUC permet de déterminer la taille de très petites NPs. Par ailleurs, une étude du comportement de ces allosphères pour des pH entre 4-8, des forces ioniques de 0 à 500 mM, en présence ou absence de matière organique naturelle a été entreprise. Les travaux ont montré que le dH était d’environ 7,0 nm avec de petites augmentations à faible pH, ou à très grande force ionique ou dureté. Ces résultats indiquent la grande stabilité physique et chimique des allosphères qui auront, ainsi, une grande mobilité dans les sols. La diffusion de lumière dynamique et la spectroscopie de corrélation de fluorescence ont été utilisées afin de valider les résultats obtenus par l’AUC.

Modèle cellulaire de carcinogenèse pour les cancers de l’oropharynx induits par le VPH

Problématique: Le virus du papillome humain (VPH) est présent dans près de 50% des cancers de l’oropharynx. Le potentiel oncogénique du VPH est encodé dans les oncoprotéines E6 et E7, qui agissent en modulant différents gènes, dont les gènes suppresseurs de tumeur p53 et pRb. Les cellules VPH positives démontrent une altération au niveau de la signalisation de la réponse aux dommages à l’ADN (RDA), un mécanisme de contrôle dans l’arrêt de la croissance des cellules ayant subit des dommages au niveau de leur ADN. Hypothèse et objectifs : Nous croyons que les défauts au niveau de la RDA des cancers VPH positifs peuvent être exploités afin de sensibiliser préférentiellement les cellules cancéreuses aux traitements de radiothérapie. Cette stratégie de recherche nécessite l’élaboration d’un modèle cellulaire de carcinogenèse isogénique pour le cancer de l’oropharynx que nous proposons de développer et de caractériser. L’étude vise à dériver des lignées isogéniques à partir de kératinocytes primaires et cellules épithéliales de l’oropharynx pour ensuite valider la carcinogenèse de notre modèle in vitro & in vivo Méthodologie : Des lignées cellulaires de kératinocytes primaires et de cellules épithéliales de l’oropharynx ont été successivement modifiées par transduction afin de présenter les mutations associées aux cancers de l’oropharynx induits par le VPH. Les cellules ont été modifiées avec des lentivirus codants pour la télomérase (hTERT), les oncogènes E6, E7 et RasV12. Afin de valider la cancérogenèse in vitro de notre modèle, des études d’invasion en matrigel et de croissance sans ancrage en agar mou ont été réalisées. Les populations cellulaires transformées ont été ensuite introduites dans des souris immunodéficientes afin d’évaluer leur tumorogénicité in vivo. Résultats : À partir des plasmides recombinés construits par méthodes de clonage traditionnelle et de recombinaison « Gateway », nous avons produit des lentivirus codants pour la télomérase humaine (hTERT), les oncogènes viraux E6 et E7 et l’oncogène Ras. Les kératinocytes primaires et cellules épithéliales de l’oropharynx ont été infectés successivement par transduction et sélectionnés. Nous avons validé l’expression de nos transgènes par méthode d’immunofluorescence, de Western Blot et de réaction de polymérisation en chaîne quantitative en temps réel (qRT-PCR). Nous avons établi trois lignées des cellules épithéliales de l’oropharynx (HNOE) à partir d’échantillons tissulaires prélevés lors d’amygdalectomie (HNOE42, HNO45, HNOE46). Les cellules transduites avec le lentivirus exprimant le promoteur fort CMV/TO de l’oncogène RasV12 ont présenté un changement morphologique compatible avec une sénescence prématurée induite par l’oncogène Ras. En exprimant des quantités plus faibles du RasV12 mutant, la lignée cellulaire HEKn hTERT-E6-E7 PGK RasV12 a réussi à échapper à la sénescence induite par l’oncogène Ras. La population cellulaire exprimant HEKn hTERT-E6-E7-PGK RasV12 a présenté un phénotype malin en culture et à l’étude d'invasion, mais n’a pas démontré de résultats positifs à l’étude de croissance sans ancrage en agar mou ni en xénogreffe en souris immunodéficientes. Conclusion : Nos résultats démontrent qu’en présence des oncogènes viraux E6 et E7, il y a un troisième mécanisme suppresseur de tumeur qui médie la sénescence induite par l’oncogène Ras. Nous avons identifié que la présence de E6 seule ne suffit pas à immortaliser les kératinocytes primaires humains (HEKn). Nous n’avons pas réussi à créer un modèle in vitro de carcinogenèse pour les cancers de l’oropharynx induits par le VPH.

Ablation laser femtoseconde de verres métalliques de Cu_x Zr_(1−x) : une étude par dynamique moléculaire

L’ablation laser de verres métalliques de CuxZr1−x (x = 0.33, 0.50 et 0.67) et d’un alliage métallique cristallin de CuZr2 dans la structure C11b a été étudiée par dynamique moléculaire (DM) combinée à un modèle à deux températures (TTM). Le seuil d’ablation (Fth) a été déterminé pour chacun des 4 échantillons et s'est avéré plus bas pour les échantillons plus riches en Cu étant donné que la cohésion du Cu est plus faible que celle du Zr dans tous les échantillons. Pour x=0.33, Fth est plus bas pour le cristal que pour l’amorphe car le couplage électron-phonon est plus faible dans ce dernier, ce qui implique que l’énergie est transférée plus lentement du système électronique vers le système ionique pour le a-CuZr2 que le c-CuZr2. La vitesse de l’onde de pression créée par l’impact du laser croît avec la fluence dans l’échantillon cristallin, contrairement aux échantillons amorphes dans lesquels sa vitesse moyenne est relativement constante avec la fluence. Ceci est expliqué par le fait que le module de cisaillement croît avec la pression pour le cristal, ce qui n’est pas le cas pour les verres métalliques étudiés. Finalement, la zone affectée par la chaleur (HAZ) a été étudiée via la profondeur de fusion et les déformations plastiques. La plus faible température de fusion des échantillons amorphes implique que la profondeur de fusion est plus importante dans ceux-ci que dans l’échantillon cristallin. Dans les verres métalliques, les déformations plastiques ont été identifiées sous forme de zones de transformation par cisaillement (STZ) qui diffusent et fusionnent à plus haute fluence. Aucune déformation plastique importante n’a été identifiée dans le c-CuZr2 mis à part de légères déformations près du front de fusion causées par les contraintes résiduelles. Ce travail a ainsi permis d’améliorer notre compréhension de l’ablation laser sur les verres métalliques et de l’étendue des dommages qu’elle peut entraîner.

Architectures radiales hétéro-poly-métalliques pour la photosynthèse artificielle et le stockage de l'information

Par une approche supramoléculaire, des architectures radiales hétéro-poly-métalliques ont été réalisées pour des applications en photosynthèse artificielle et en magnétisme moléculaire. Dans une première partie, la synthèse et la caractérisation (spectroscopie UV-vis, émission, électrochimique, DRX) de complexes de ruthénium(II), possédant une gamme de ligands polypyridines, ont été réalisées. Les calculs théoriques ont été effectués afin de soutenir l’interprétation des propriétés photophysiques. Ces complexes, présentant un certain nombre de pyridines externes, ont servi de cœur à des architectures à base de rhénium tris-carbonyles (pour les effets d’antenne), et de cobaloximes (pour les propriétés catalytiques). Les nucléarités obtenues varient de 2 à 7 selon le cœur utilisé. Ces systèmes ont été engagés dans des cycles de photo-production de dihydrogène, démontrant une meilleure efficacité que la référence du domaine, le [Ru(bpy)3]2+. La seconde partie concerne l’étude de couples de métaux de transition, construits à partir de briques polycyanométallates, ou de lanthanides pontés par des ligands oxamides. Ces approches « complexes comme ligand » puis « assemblages comme ligand » permettent d’obtenir des systèmes de haute nucléarité, présentant des propriétés de molécule-aimant ou des effets magnéto-caloriques (à base de CrNi, GdCu, DyCu). Des propriétés photomagnétiques ont été observées sur les couples RuCu et MoCu, pouvant servir de commutateurs moléculaires dans des systèmes complexes. Enfin, une structure hétéro-tétra-métallique trifonctionnelle a été obtenue contenant à la fois un commutateur MoCu, une entité molécule-aimant CuTb et un complexe de ruthénium.

Développement d’outils analytiques pour la détection de biomolécules directement dans des fluides sanguins

Cette thèse porte sur le développement de biocapteurs basés sur la technique de résonance des plasmons de surface (SPR) pour effectuer des analyses directement dans un fluide sanguin n’ayant subi aucune purification ou dilution. L’ensemble des biocapteurs discutés exploiteront un instrument SPR portable développé dans le groupe du professeur Masson. Le premier volet de la thèse portera sur le processus d’interférence lié à l’adsorption non spécifique du sérum à la surface du capteur. L’analyse des biomolécules adsorbées sera effectuée en combinant la SPR à la spectrométrie de masse. Les informations obtenues seront exploitées pour la construction de biocapteurs adaptés à l’analyse en milieu sanguin. Un premier biocapteur développé ciblera la protéine antigène prostatique spécifique (APS) contenue dans le sérum servant de biomarqueur pour dépister le cancer de la prostate. Pour détecter les faibles concentrations de cette protéine directement dans le sérum, un matériel plasmonique microstructuré sera utilisé pour amplifier les signaux obtenus et sera recouvert d’une monocouche peptidique minimisant l’adsorption non spécifique du sérum. L’instrument SPR aura été adapté pour permettre également la détection simultanée de fluorescence. Un test ELISA sera ainsi effectué en parallèle du test SPR. Chacune des techniques fournira un contrôle pour la deuxième, tout en permettant de détecter le biomarqueur au niveau requis pour dépister la maladie. La combinaison des deux méthodes permettra aussi d’élargir la gamme dynamique du test de dépistage. Pour terminer, l’instrument SPR portable sera utilisé dans le cadre de détection de petites biomolécules ayant un potentiel thérapeutique directement dans un échantillon de sang. Des peptides ayant une activité anti-athérosclérotique pourront ainsi être détectés à même un échantillon de sang ni purifié ni dilué, et ce à des concentrations de l’ordre du micromolaire. Une modification de la microfluidique via l’introduction d’une membrane poreuse au cœur de celle-ci sera la clé permettant d’effectuer de telles analyses. La présente thèse met de l’avant de nouvelles stratégies et des modifications instrumentales permettant d’analyser des protéines et des petites molécules directement dans un échantillon non purifié de sérum ou de sang. Les modifications apportées au système fluidique, à l’instrument SPR et au niveau du biocapteur employé permettront d’effectuer des biodétections dans des matrices aussi complexes que les fluides sanguins. Les présents travaux mettent en lumière la capacité d’un instrument SPR/fluorescence portable à faire en 12 minutes la biodétection d’un marqueur du cancer de la prostate directement dans un échantillon de sérum. Finalement, on rapporte ici un des premiers articles où un biocapteur SPR est utilisé à même un échantillon de sang non-purifié pour faire des biodétections.

Réduction des artéfacts de tuteur coronarien au moyen d’un algorithme de reconstruction avec renforcement des bords : étude prospective transversale en tomodensitométrie 256 coupes

Les artéfacts métalliques entraînent un épaississement artéfactuel de la paroi des tuteurs en tomodensitométrie (TDM) avec réduction apparente de leur lumière. Cette étude transversale prospective, devis mesures répétées et observateurs avec méthode en aveugle, chez 24 patients consécutifs/71 tuteurs coronariens a pour objectif de comparer l’épaisseur de paroi des tuteurs en TDM après reconstruction par un algorithme avec renforcement des bords et un algorithme standard. Une angiographie coronarienne par TDM 256 coupes a été réalisée, avec reconstruction par algorithmes avec renforcement des bords et standard. L’épaisseur de paroi des tuteurs était mesurée par méthodes orthogonale (diamètres) et circonférentielle (circonférences). La qualité d’image des tuteurs était évaluée par échelle ordinale, et les données analysées par modèles linéaire mixte et régression logistique des cotes proportionnelles. L’épaisseur de paroi des tuteurs était inférieure avec l’algorithme avec renforcement des bords comparé à l’algorithme standard, avec les méthodes orthogonale (0,97±0,02 vs 1,09±0,03 mm, respectivement; p<0,001) et circonférentielle (1,13±0,02 vs 1,21±0,02 mm, respectivement; p<0,001). Le premier causait moins de surestimation par rapport à l’épaisseur nominale comparé au second, avec méthodes orthogonale (0,89±0,19 vs 1,00±0,26 mm, respectivement; p<0,001) et circonférentielle (1,06±0,26 vs 1,13±0,31 mm, respectivement; p=0,005) et diminuait de 6 % la surestimation. Les scores de qualité étaient meilleurs avec l’algorithme avec renforcement des bords (OR 3,71; IC 95% 2,33–5,92; p<0,001). En conclusion, la reconstruction des images avec l’algorithme avec renforcement des bords génère des parois de tuteurs plus minces, moins de surestimation, et de meilleurs scores de qualité d’image que l’algorithme standard.