Lien entre l'hémostase et le développement néoplasique : rôle spécifique du facteur tissulaire et de l'inhibiteur du facteur tissulaire

Il est reconnu, depuis une centaine d’années, que des désordres de la coagulation, regroupés sous le terme de coagulopathies, sont souvent associés au développement néoplasique. Pendant de nombreuses années, ces coagulopathies furent souvent reconnues comme une simple conséquence du développement du cancer. D’ailleurs, pour les cliniciens, l’apparition de ces anomalies sanguines constitue souvent le premier signe clinique d’un cancer occulte. Toutefois, l’étude approfondie du lien existant entre le système hémostatique et le cancer indique que différents facteurs hémostatiques vont interagir avec soit l’environnement tumoral ou soit la tumeur elle-même et influencer le développement du cancer. Au cours de nos travaux, nous avons porté une attention particulière à deux protéines jouant un rôle primordial dans l’hémostase. Le facteur tissulaire (TF) et l’inhibiteur du facteur tissulaire (TFPI) peuvent jouer des rôles pro- ou anti-néoplasique, et ce indépendamment de leurs fonctions hémostatiques normales. Dans le premier volet de cette thèse, nous avons étudié les propriétés antiangiogéniques de TFPI. L’angiogenèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir du réseau pré-existant, est reconnue comme étant une étape clée du développement tumoral. D’après nos travaux, le TFPI peut inhiber la formation de structures de type capillaire des cellules endothéliales (CEs) de la veine ombilicale humaine (HUVEC), et ce à une IC 50 de 5 nM, soit la concentration physiologique de l’inhibiteur. De plus, le TFPI bloque la migration des cellules endothéliales lorsque ces dernières sont stimulées par la sphingosine-1-phosphate (S1P), une molécule relâchée lors de l’activation des plaquettes sanguines. Cette inhibition de la migration cellulaire s’explique par l’effet du TFPI sur l’adhésion des CEs. En effet, TFPI inhibe la phosphorylation de deux protéines clées participant à la formation des complexes d’adhésion focales soit FAK (focal adhesion kinase) et PAX (paxilin). L’inhibition de ces deux protéines suggère qu’il y ait une réorganisation des complexes focaux, pouvant expliquer la perte d’adhérence. Finalement, des études de microscopie confocale démontrent que les cellules traitées au TFPI changent de morphologie au niveau du cytosquelette d’actine provoquant une désorganisation des structures migratoires (pseudopodes). Les effets du TFPI au niveau de la migration, de l’adhésion et de la morphologie cellulaire sont strictement spécifiques aux cellules endothéliales humaines, puisque aucun n’effet n’est observé en traitant des cellules cancéreuses de glioblastomes (GB) humains, qui sont normalement des tumeurs hautement vascularisées. En résumé, cette première étude démontre que le TFPI est un inhibiteur de l’angiogenèse. Dans le second volet de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux différents rôles de TF, le principal activateur de la coagulation. Cette protéine est également impliquée dans le développement néoplasique et notamment celui des médulloblastomes (MB) chez l’enfant via des fonctions hémostatiques et non-hémostatiques. Nos travaux démontrent que l’expression de TF est induite par la voie de signalisation de HGF (hepatocyte growth factor) et de son récepteur Met. Cet effet de HGF/Met semble spécifique aux MB puisque HGF ne peut stimuler l’expression de TF au niveau des cellules cancéreuses de glioblastomes. TF, exprimé à la surface des cellules médulloblastiques (DAOY), est responsable de l’activité pro-thrombogénique de ces cellules, ainsi qu’un acteur important de la migration de ces cellules en réponse au facteur VIIa (FVIIa). De plus, en étudiant 18 spécimens cliniques de MB, nous avons établi un lien entre l’intensité d’expression de TF et de Met. L’importance de cette corrélation est également suggérée par l’observation que les cellules exprimant les plus forts taux de TF et de Met sont également les plus agressives en termes d’index de prolifération et de dissémination métastatiques. En résumé, ces travaux représentent le point de départ pour la mise au point de TF comme un marqueur diagnostique clinique dans les cas de tumeurs du cerveau pédiatriques. De plus, l’élucidation de la voie de signalisation moléculaire responsable de l’expression de TF permet de mieux comprendre la biologie et le fonctionnement de ces tumeurs et de relier le profil d’expression de TF aux phénotypes agressifs de la maladie. Il est reconnu que HGF peut également jouer un rôle protecteur contre l’apoptose. Dans le troisième volet de cette thèse, nous avons remarqué que cette protection est corrélée à l’expression de TF. En réduisant à néant l’expression de TF à l’aide de la technologie des ARN silencieux (siRNA), nous démontrons que HGF ne protège plus les cellules contre l’apoptose. Donc, TF médie l’activité anti-apoptotique de HGF. TF assume cette protection en inactivant la phosphorylation de p53 sur la sérine 15, empêchant ainsi la translocation de p53 au noyau. Finalement, l’expression de TF et son interaction avec le FVIIa, au niveau des cellules médulloblastiques favorise la survie de ces dernières et ce même si elles sont soumises à de fortes concentrations de médicaments couramment utilisées en cliniques. Ce troisième et dernier volet démontre l’implication de TF en tant que facteur impliqué dans la survie des cellules cancéreuses, favorisant ainsi le développement de la tumeur. Dans son ensemble, cette thèse vise à démontrer que les facteurs impliqués normalement dans des fonctions hémostatiques (TFPI et TF) peuvent contribuer à réguler le développement tumoral. Tout système physiologique et pathologique est dépendant d’un équilibre entre activateur et inhibiteur et la participation de TF et de TFPI à la régulation du développement néoplasique illustre bien cette balance délicate. Par sa contribution anti- ou pro-néoplasique le système hémostatique constitue beaucoup plus qu’une simple conséquence du cancer; il fait partie par l’action de TF des stratégies élaborées par les cellules cancéreuses pour assurer leur croissance, leur déplacement et leur survie, alors que TFPI tente de limiter la croissance tumorale en diminuant la vascularisation.

Les récepteurs intracellulaires de l'angiotensine II : nouvelles cibles thérapeutiques pour le remodelage cardiaque

L'angiotensine-II (Ang-II), synthétisée à partir de sources extracardiaques et intracardiaques, régule l'homéostasie cardiaque en favorisant des effets mitogéniques et en promouvant la croissance cellulaire résultant d’une altération de l'expression génique. Dans cette étude, nous avons évalué la possibilité que les récepteurs de l'angiotensine-1 (AT1) ou les récepteurs de l'angiotensine-2 (AT2) situés sur l'enveloppe nucléaire régulent l’expression génique des cardiomyocytes. En analysant les noyaux cellulaires retenus des fractions de cœur de rat par immunobuvardage Western, nous avons détecté une co-purification préférentielle des protéines AT1 et AT2 avec un marqueur de la membrane nucléaire (Nup 62), par rapport aux marqueurs de la membrane plasmique (Calpactin I), de l’appareil de Golgi (GRP 78) ou du réticulum endoplasmique (GM130). La microscopie confocale a permis de démontrer la présence des AT1 et AT2 dans les membranes nucléaires. La microinjection de l’Ang-II-FITC sur des cardiomyocytes a provoqué une liaison de préférence aux sites nucléaires. Les enregistrements de transients calciques ont illustré que les AT1 nucléaires régulent le relâchement du Ca2+. L’incubation des ligands spécifiques d’AT1 et d’AT2 avec l’UTP [α32P] a résulté en une synthèse de novo d’ARN (par exemple, 16,9 ± 0,5 cpm/ng ADN contrôle vs 162,4 ± 29,7 cpm/ng ADN-Ang II, 219,4 ± 8,2 cpm/ng ADN L -162313 (AT1) et 126,5 ± 8,7 cpm/ng ADN CGP42112A (AT2), P <0,001). L’incubation des noyaux avec Ang-II augmente de façon significative l’expression de NFκB, une réponse qui est réprimée partiellement par la co-administration de valsartan ou de PD123177. Les expériences dose-réponse avec Ang-II administrée à l'ensemble des noyaux purifiés vs. aux cardiomyocytes seuls a montré une augmentation plus importante dans les niveaux d'ARNm de NFκB avec une affinité de ~ 3 fois plus grande (valeurs d’EC50 = 9 contre 28 pmol/L, respectivement), suggérant un rôle préférentiel nucléaire dans la signalisation. Par conséquent, nous avons conclu que les membranes cardiaques nucléaires possèdent des récepteurs d’Ang-II couplés à des voies de signalisation et à la transcription génique. La signalisation nucléaire pourrait jouer un rôle clé dans les changements de l'expression de gènes cardiaques, entraînant ainsi des implications mécanistiques et thérapeutiques diverses.

Mutations du gène HFE dans le cancer épithélial de l'ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire est le cancer gynécologique le plus agressif avec le plus haut taux de mortalité. La croissance des cellules cancéreuses de l’ovaire est limitée par les nutriments de l’environnement, le fer étant un des éléments indispensables à leur prolifération. L’hémochromatose héréditaire est une maladie associée à une accumulation corporelle de fer. Cette maladie est liée à deux mutations majeures du gène HFE soit H63D et C282Y. Étant donnée l’influence de la protéine HFE sur l’entrée du fer dans la cellule, des mutations du gène HFE pourraient être associées à une croissance rapide des cellules cancéreuses. Des études de génotypage du gène HFE effectuées chez 526 patientes avec cancer épithélial de l’ovaire, ont révélées une fréquence allélique de la mutation C282Y significativement plus élevées chez les patientes avec tumeur ovarienne comparativement aux patientes du groupe contrôle (5.9% versus 1.3%, p = 0.02). De plus, le taux de survie des patientes avec mutations C282Y et tumeur ovarienne de G3, après 2 ans, est faible (20%) lorsque comparé à celui des patientes sans mutations (60%, p = 0.005). Une analyse de régression multivariée de Cox a démontrée un risque relatif de 3.1, suggérant que les patientes avec mutations C282Y ont 3 fois plus de chance d’avoir une faible survie (p=0.001). Également, des études de corrélation ont démontrées que les niveaux de ferritine du sérum étaient plus élevés chez les patientes avec grade avancé du cancer épithélial de l’ovaire (r = 0.445 et p= 0.00001), suggérant que ce paramètre pourrait servir comme marqueur tumoral. Afin de comprendre ces résultats, nous avons tout d’abord étudiés l’influence des mutations HFE sur les cellules cancéreuses. Pour ce faire, la lignée du cancer de l’ovaire TOV-112D, homozygote pour la mutation C282Y, a été transfectée avec les vecteurs HFEwt et HFEC282Y. Bien qu’aucune différence significative n’ait été trouvée en termes de TfR totaux, des analyses par FACS ont démontrées un phénotype de déficience de fer pour les clones stables HFEwt. In vitro, la restauration de la protéine HFE, dans la lignée TOV-112D du cancer de l’ovaire, n’influence pas la croissance cellulaire. Ensuite, nous avons étudiés l’influence des niveaux de fer sur la progression tumorale. Une expérience in vivo préliminaire a démontré une tendance à un volume tumoral supérieur dans un modèle de souris de surcharge de fer,HfeRag1-/-. De plus, les souris HfeRag1-/-, injectées avec la lignée du cancer de l’ovaire TOV-21G, ont montrées des niveaux significativement plus faibles de fer sérique comparativement à leur contrôle (fer sérique 40±7μM versus 27±6μM, p = 0.001). En conclusion, des études supplémentaires sont nécessaires afin de comprendre davantage le rôle des mutations HFE sur la progression tumorale. Notamment, les niveaux élevés de fer pourraient rendre les cellules tumorales résistantes aux traitements ou encore, augmenter la toxicité et ainsi, contribuer à un mauvais prognostique.

Modulation of Oxytocin Receptors in Right Ventricular Hypertrophy

L’hypertension pulmonaire (HP) est une maladie dont l’étiologie est inconnue et qui entraîne ultimement une défaillance du ventricule droit (VD) et le décès. L’HP peut être induite chez le rat par la la monocrotaline (MCT), un alcaloïde pyrrolizidique extrait de la plante Crotalaria Spectabilis, causant des lésions à l’endothélium des artères pulmonaires, menant à un épaississement de ces dernières et à une augmentation de la résistance vasculaire. Ceci à pour conséquence de causer une hypertrophie du VD, de l’inflammation, une dysfonction endothéliale NO-dépendante des artères coronariennes et une augmentation des peptides natriurétiques circulants. Objectif: Nous avons testé l’hypothèse selon laquelle l’étiopathologie de l’HP impliquerait le récepteur à ocytocine (OTR) dû à son implication fonctionnelle avec les cytokines inflammatoires et la libération du peptide natriurétique atrial (ANP) et du NO. Méthodes: Des rats mâles Sprague-Dawley pesant 220-250g reçurent une seule injection sous-cutanée de MCT (60 mg/kg). 6 à 7 semaines (46±1 jours) suivant l’injection, les rats furent sacrifiés et l’expression génique et protéique fut déterminée par PCR en temps réel et par western blot, respectivement, dans le VD et le ventricule gauche (VG) Résultats: Les rats traités au MCT démontrèrent une augmentation significative du VD. Une hypertrophie du VD était évidente puisque le ratio du VD sur le VG ainsi que le poids du septum étaient près de 77% plus élevés chez les rats traités au MCT que chez les rats contrôles. Le traitement au MCT augmenta l’expression génique d’ANP (3.7-fois dans le VG et 8-fois dans le VD) ainisi que le NP du cerveau (2.7-fois dans le VG et 10-fois dans le VD). Les transcrits de trois récepteurs de NP augmentèrent significativement (0.3-2 fois) seulement dans le VD. L’expression protéique de la NO synthase (iNOS) fut également augmentée de façon sélective dans le VD. Par contre, les transcripts de NOS endothéliale et de NOS neuronale étaient plus élevés (0.5-2 fold) dans le VG. L’ARNm et l’expression protéique d’OTR furent diminués de 50% dans le VD, tandis qu’une augmentation de l’expression des cytokines IL-1β and IL-6 fut observée. L’ARNm de Nab1, un marqueur d’hypertrophie pathologique, fut augmentée de deux-fois dans le VD. Conclusion: L’augmentation d’expression génique de NP dans le VD des rats traités au MCT est associée à une augmentation des transcripts du récepteur NP, suggérant une action locale de NP dans le VD durant l’HP. L’expression d’OTR est atténuée dans le VD, possiblement par des cytokines inflammatoires puisque le promoteur du gène de l’OTR contient de multiples éléments de réponse aux interleukines. Diminuer l’expression d’OTR dans le VD durant l’hypertension pulmonaire pourrait influencer de manière positive la fonction cardiaque car l’OTR régule la contractilité et le rythme cardiaque. Mots clés: hypertension pulmonaire, hypertrophie du ventricule droit monocrotaline, récepteur à ocytocine, inflammation, peptides natriurétiques.

Syndrome inflammatoire chez les schizophrènes toxicomanes

La schizophrénie est une maladie mentale grave qui présente une comorbidité fréquente avec la toxicomanie et avec divers troubles immunitaires. Une méta-analyse réalisée récemment dans notre laboratoire a montré une augmentation d’IL-6 (une cytokine pro-inflammatoire), du récepteur soluble d’IL-2 (un marqueur d’activation du système immunitaire), et d’IL-1RA (une cytokine anti-inflammatoire) dans la schizophrénie, suggérant l’existence d’un syndrome inflammatoire dans cette maladie. La toxicomanie aussi est associée au dérèglement du réseau des cytokines inflammatoires, mais les effets dépendent du type de drogues et ils sont parfois diamétralement opposés. On dispose encore de peu d’informations sur le statut immunitaire et inflammatoire des patients qui ont un double diagnostic de schizophrénie et de toxicomanie. Le but de ce travail était d’explorer l’existence d’un état inflammatoire systémique chez les patients schizophrènes et toxicomanes, et l’influence du traitement avec un médicament antipsychotique atypique, la quétiapine. Les objectifs spécifiques étaient : 1) Mesurer les concentrations plasmatiques des cytokines inflammatoires chez les schizophrènes et toxicomanes avant, pendant et après traitement avec la quétiapine ; et 2) Faire des études de corrélations entre les taux de cytokines, les symptômes cliniques, et la consommation de drogues. Les résultats montrent que comparativement aux contrôles normaux, les patients avec un double diagnostic présentent une augmentation d’IL-6, d’IL-1RA, du sIL-2R et d’IL-8 avant traitement à la quétiapine. Les augmentations des concentrations plasmatiques d’IL-1RA sont particulièrement importantes chez les patients avec double diagnostic, si on les compare à celles publiées chez les schizophrènes sans toxicomanie. Le traitement à la quétiapine n’influence pas les concentrations plasmatiques de ces cytokines, sauf sIL-2R qui augmente davantage au cours du traitement. Des corrélations positives de puissance modérée sont retrouvées entre IL-6 et dépression, IL-6 et alcool, IL-1RA et cognition, IL-8 et dépression, IL-8 et alcool, sIL-2R et cannabis. Notre étude révèle que la réponse inflammatoire est activée chez les schizophrènes et toxicomanes. De plus, la toxicomanie semble jouer un rôle facilitant ou potentialisateur dans les augmentations des taux circulants d’IL-1RA. Les études en cours sur différentes populations de schizophrènes avec ou sans toxicomanie, et chez des toxicomanes non schizophrènes permettront de préciser le rôle des différentes drogues d’abus dans le syndrome inflammatoire chez les schizophrènes, ainsi que les implications de ce syndrome sur le plan clinique et thérapeutique.

Identification précoce des nouveau-nés qui auront des problèmes de développement à deux ans: utilité de l'Évaluation neurologique d'Amiel-Tison

Malgré les avancées médicales, la prédiction précoce du devenir développemental des enfants nés prématurément demeure un défi. Ces enfants sont à risque de séquelles plus ou moins sévères telles l'infirmité motrice d'origine cérébrale, les déficiences intellectuelles et sensorielles ainsi que les difficultés d'apprentissage. Afin de diminuer l’impact fonctionnel de ces séquelles, l’identification de marqueurs précoces devient un enjeu important. Dans le contexte actuel de ressources financières et humaines limitées, seuls les enfants nés avant 29 semaines de gestation ou avec un poids de naissance (PN) <1250g sont systématiquement suivis, laissant pour compte 95% des enfants prématurés. L’identification de marqueurs précoces permettrait de cibler les enfants nés après 28 semaines de gestation porteurs de séquelles. Le principal objectif des présents travaux visait à évaluer l’utilité de l’Évaluation neurologique d’Amiel-Tison (ENAT) dans l’identification et le suivi des enfants nés entre 29 et 37 semaines de gestation et qui présenteront des problèmes neurodéveloppementaux à l’âge corrigé (AC) de 24 mois. Plus précisément, la fidélité inter-examinateurs, la stabilité ainsi que la validité prédictive de l’ENAT ont été évaluées. La cohorte était composée initialement de 173 enfants nés entre 290/7 et 370/7 semaines de gestation, avec un PN<2500g et ayant passé au moins 24 heures à l’unité de soins néonatals du CHU Sainte-Justine. Les enfants étaient évalués avec l’ENAT à terme et aux AC de 4, 8, 12 et 24 mois. À l’AC de 24 mois, leur développement était évalué à l’aide du Bayley Scales of Infant Development–II. Les principaux résultats révèlent une excellente fidélité inter-examinateurs ainsi qu’une bonne stabilité au cours des deux premières années de vie du statut et des signes neurologiques. Des différences significatives à l’AC de deux ans ont été relevées aux performances développementales en fonction du statut neurologique à terme, qui constitue l’un des meilleurs facteurs prédictifs de ces performances. Les résultats encouragent l’intégration du statut neurologique tel que mesuré par l’ENAT comme marqueur précoce dans le cours d’une surveillance neurodéveloppementale des enfants les plus à risque.

Systèmes vésiculaires colloïdaux pour la vectorisation de la 1-β-D-arabinofuranosylcytosine

La 1-β-D-arabinofuranosylcytosine (ara-C) demeure l’agent anticancéreux principalement utilisé dans le traitement de la leucémie myéloblastique aiguë (LMA), malgré sa dégradation et son élimination rapide après une administration parentérale. Son encapsulation dans des vecteurs pharmaceutiques, majoritairement des liposomes, a permis de surmonter ces inconvénients. L’objectif général de ce projet de doctorat était de développer deux systèmes à libération prolongée, à base de phospholipides, de cholestérol et de poly(éthylène glycol) (PEG) afin d’encapsuler l’ara-C et ultimement, d’améliorer son efficacité dans le traitement de la LMA. Des Sphérulites® (vésicules multilamellaires d’un type particulier) ont d’abord été étudiées pour leur forte capacité d’encapsulation, due à leur mode de préparation. Par la suite, une formulation liposomale capable, d’une part de cibler spécifiquement les cellules leucémiques et, d’autre part, de promouvoir la libération intracellulaire de l’ara-C grâce à sa sensibilité au pH, a été mise au point. Les deux formulations se devaient d’avoir un faible diamètre, une stabilité en présence de fluides biologiques et des temps de circulation prolongés chez l’animal. Une préparation de Sphérulites®, composée de Phospholipon 90G, de Solutol HS15 et de cholestérol, a permis d’obtenir des vésicules de 300 nm de diamètre. Un dérivé lipidique de PEG a pu être fixé à leur surface, sans modifier la disposition concentrique des lamelles, ni changer leur stabilité. Les Sphérulites® PEGylées ont été chargées d’ara-C et injectées chez le rat par la voie intraveineuse. Elles ont démontré des temps de circulation significativement prolongés comparativement aux Sphérulites® sans PEG. Cependant, l’ara-C s’est retrouvée éliminée de la circulation sanguine très rapidement, révélant une libération précoce du principe actif à partir de ces vésicules. Les liposomes sensibles au pH (~150 nm) ont été obtenus suite à l’insertion d’un copolymère à base de dioctadécyle, de N-isopropylacrylamide (NIPAM) et d’acide méthacrylique. L’anticorps anti-CD33, soit complet soit son fragment Fab’, a été fixé à la surface des liposomes afin de cibler les cellules leucémiques. Les essais in vitro ont démontré la spécificité de la formulation pour différentes cellules leucémiques (CD33+), sa stabilité en présence de protéines plasmatiques et la libération intracellulaire d’un marqueur fluorescent et de l’ara-C. Enfin, des études menées chez la souris saine et immunodéprimée inoculée de cellules HL60 ont montré que la formulation exposant le fragment Fab’ possédait un profil pharmacocinétique et une biodistribution semblables à ceux des liposomes contrôles non-ciblés. L’encapsulation de l’ara-C a permis d’améliorer grandement ses temps de circulation après une administration intraveineuse. Cependant, bien que les immunoliposomes ont permis de prolonger la survie des souris leucémiques comparativement à l’ara-C libre, l’addition du polymère sensible au pH n’a pas permis d’apporter de réel avantage à la formulation lorsque administrée in vivo. Les résultats obtenus dans ce travail de thèse ont, dans un premier temps, mis en évidence que les Sphérulites® pourraient s’avérer utiles dans la vectorisation d’agents anticancéreux si leur capacité à retenir le principe actif in vivo était améliorée. Dans un second temps, les données présentées avec les immunoliposomes suggèrent qu’ils pourraient apporter un bénéfice notable dans le traitement de la LMA.

L’impact du polymorphisme du gène E2 sur la quantification de la charge virale du VPH-16 dans les maladies précancéreuses du col utérin

Le VPH-16 de même que certains VPH, dont le VPH-18, causent le cancer du col utérin. Son intégration dans le génome humain pourrait être un marqueur de progression de l’infection. Les charges virales totale et intégrée sont présentement mesurées en quantifiant par PCR en temps réel les gènes E6 (RT-E6) et E2 (RT-E2-1) du VPH-16. Nous avons évalué l’impact du polymorphisme du gène E2 sur la quantification de l’ADN du VPH-16 dans des spécimens cliniques. Dans un premier temps, le gène E2 de 135 isolats de VPH-16 (123 appartenaient au clade Européen et 12 à des clades non- Européens) fut séquencé. Ensuite, un test de PCR en temps réel ciblant les séquences conservées dans E2 (RT-E2-2) fut développé et optimisé. Cent trente-neuf spécimens (lavages cervicaux et vaginaux) provenant de 74 participantes (58 séropositives pour le VIH, 16 séronégatives pour le VIH) ont été étudiés avec les trois tests E2 (RT-E2-2), E6 (RT-E6) et E2 (RT-E2-1). Les ratios de la quantité d’ADN de VPH-16 mesuré avec RT-E2-2 et RT-E2-1 dans les isolats Européens (médiane, 1.02; intervalle, 0.64-1.80) et Africains 1 (médiane, 0.80; intervalle, 0.53-1.09) sont similaires (P=0.08). Par contre, les ratios mesurés avec les isolats Africains 2 (médiane, 3.23; intervalle, 1.92-3.49) ou Asiatique- Américains (médiane, 3.78; intervalle, 1.47-37) sont nettement supérieurs à ceux obtenus avec les isolats Européens (P<0.02 pour chaque comparaison). Les distributions des quantités de E2 contenues dans les 139 échantillons mesurées avec RT-E2-2 (médiane, 6150) et RT-E2-1 (médiane, 8960) étaient statistiquement différentes (P<0.0001). Nous avons observé que les charges virales totale (odds ratio (OR) OR, 2.16 95% intervalle de confiance (IC) 1.11-4.19), et épisomale du VPH-16 (OR, 2.14 95% IC 1.09-4.19), mais pas la présence de formes intégrées (OR, 3.72 95% IC 1.03-13.4), sont associées aux néoplasies intraepitheliales cervicales de haut grade (CIN-2,3), et ce, en contrôlant pour des facteurs confondants tels que l’âge, le taux de CD4 sanguin, l’infection au VIH, et le polymorphisme de VPH-16. La proportion des échantillons ayant un ratio E6/E2 > 2 pour les femmes sans lésion intraépithéliale (7 de 35) est similaire à celle des femmes avec CIN-2,3 (5 de 11, p=0.24) ou avec CIN- 1 (4 de14, P=0.65). Le polymorphisme du gène E2 est un facteur qui influence la quantification des charges intégrées de VPH-16.

Caractérisation du potentiel métastatique des carcinomes mammaires de phénotype basal

Au Canada, on estime qu'une femme sur neuf développera un cancer du sein et qu'une femme sur vingt-huit en mourra. Les carcinomes mammaires de phénotype basal qui comprennent environ 15 à 25% des cancers envahissants du sein sont des tumeurs malignes ayant un très mauvais pronostic. Dans ce type tumoral, les métastases sont fréquentes et les décès nombreux. La formation des métastases est un processus complexe qui comprend plusieurs étapes; chacune peut être étudiée par des marqueurs spécifiques. Notre hypothèse de recherche est que le carcinome mammaire de phénotype basal possède des caractéristiques spécifiques qui permettent d'expliquer son potentiel métastatique élevé. Six micromatrices tissulaires comprenant un total de 213 tumeurs mammaires ont été confectionnées. L'expression des marqueurs usuels de la métastase et celle de nouveaux marqueurs a été étudiée par des techniques d'immunohistochimie. L'étude comparative de l’expression des marqueurs du potentiel métastatique par les carcinomes mammaires de phénotype basal indique que les protéines Ki-67, EGFR, CD276 et galectine-7 sont étroitement reliées à ce type de cancer. De plus, l'expression du marqueur GATA-3, un marqueur anti-métastatique, fait complètement défaut. Nos résultats confirment que le cancer du sein de phénotype basal possède un plus grand potentiel métastatique que les autres sous-types génétiques et suggèrent que la galectine-7 puisse être impliquée.

Les manifestations subtiles du stress dans le continuum de la psychose

RÉSUMÉ L’étiologie de la schizophrénie est complexe et le modèle de vulnérabilité-stress (Nuechterlein & Dawson, 1984) propose que des facteurs de vulnérabilité d’ordre génétique combinés à une histoire environnementale de stress particulier pousseraient l’individu vers un état clinique de psychose. L’objectif principal de cette thèse est de mieux comprendre la réaction physiologique des personnes schizophrènes face à un stress psychologique, tout en conceptualisant les symptômes psychotiques comme faisant partie d’un continuum, plutôt que de les restreindre sur un plan catégoriel. Afin de faire la différence entre les patients schizophrènes et les individus de la population générale, au-delà de la sévérité de leurs symptômes psychotiques, leur réaction au stress est comparée et le phénomène de seuil critique dans la réaction de cortisol est exploré en tant que point décisif pouvant distinguer entre les deux groupes. La première étude de cette thèse (Brenner et al., 2007) examine la fiabilité, la validité et la structure factorielle du Community Assessment of Psychic Experiences (CAPE) (Stefanis et al., 2002), avec un échantillon francophone et anglophone de la population nord américaine, un questionnaire auto-administré de 42 items qui évalue les expériences quasi-psychotiques présentes dans la population générale : des symptômes positifs (ou psychotiques), négatifs (ou végétatifs) et dépressifs. Ce questionnaire a été complété par un échantillon de 2 275 personnes de la population montréalaise. Les résultats appuient la consistance interne des 3 sous-échelles originales. De plus, l’analyse factorielle exploratoire suggère des solutions de 3-5 facteurs, où les solutions à 4 et 5 facteurs proposent de séparer les symptômes positifs en sous-catégories plus spécifiques. Finalement, cette étude suggère une version plus courte du CAPE, avec seulement 23 items, tout en préservant les mêmes trois échelles originales. La toile de fond de cet article confirme l’existence du phénomène du continuum de la psychose, où une variation de symptômes psychotiques peut se retrouver aussi bien dans la population générale que dans la population clinique. Dans une deuxième étude (Brenner et al., 2009), cette thèse examine à quel point la réponse de l’hormone de stress, le cortisol, à un test de stress psychosocial nommé le Trier Social Stress Test (TSST) (Kirschbaum, Pirke, & Hellhammer, 1993), peut établir une différence entre les sujets témoins et les patients schizophrènes, tout en contrôlant des variables importantes. Un groupe de 30 personnes schizophrènes et un groupe de 30 sujets de la population générale, recrutés lors de la première étude de cette thèse, ont participé à cette recherche qui est construite selon un plan expérimental. Le groupe témoin inclut des personnes légèrement symptomatiques et un chevauchement des scores psychotiques existe entre les deux groupes. Suite au stresseur, les deux groupes démontrent une augmentation significative de leur rythme cardiaque et de leur pression artérielle. Cependant, leur réponse de cortisol a tendance à différer : les patients schizophrènes présentent une réponse de cortisol plus petite que celle des témoins, mais en atteignant un seuil statistique significatif seulement à la mesure qui suit immédiatement le stresseur. Ces résultats significatifs sont obtenus en contrôlant pour la sévérité des symptômes positifs, un facteur discriminant significatif entre les deux groupes. Ainsi, le niveau de cortisol mesuré immédiatement après le stresseur se révèle être un marqueur de seuil critique pouvant établir une distinction entre les deux groupes. Aussi, leur réponse de cortisol maximale a tendance à apparaître plus tard que chez les sujets témoins. De façon générale, la réaction au stress des deux groupes étudiés est un autre moyen d’observer la continuité d’un comportement présent chez les individus, jusqu’à ce qu’un seuil critique soit atteint. Ainsi, il est possible de trancher, à un moment donné, entre psychose clinique ou absence de diagnostic.

Étude des voies d’internalisation de l’entérotoxine STb d’Escherichia coli dans des lignées cellulaires

L’entérotoxine stable à la chaleur STb est produite par les Escherichia coli entérotoxinogènes (ETEC). Son rôle dans la diarrhée post-sevrage porcine est établi. L’internalisation de STb a été observée dans des cellules épithéliales intestinales humaines et de rat. Cependant, le mécanisme d’internalisation n’est pas totalement compris, particulièrement dans le jéjunum porcin, la cible in vivo de STb. Par la cytométrie en flux, nous avons examiné l’internalisation de STb couplée à un marqueur fluorescent dans les cellules épithéliales intestinales porcines IPEC-J2 et les fibroblastes murins NIH3T3. Nos résultats révèlent que l’internalisation de STb est températureindépendante dans les IPEC-J2 tandis qu’elle est température-dépendante dans les NIH3T3, où la réorganisation de l’actine est aussi nécessaire. Toutefois, les niveaux de sulfatide, le récepteur de STb, sont semblables à la surface des deux lignées. Le sulfatide est internalisé à 37°C de façon similaire entre les deux types cellulaires. La rupture des lipid rafts, les microdomaines membranaires contenant le sulfatide, par la méthyl-βcyclodextrine ou la génistéine, n’affecte pas l’internalisation de STb dans les deux lignées. Notre étude indique que le mécanisme d’internalisation de STb est dépendant du type cellulaire. L’activité de la cellule hôte peut être requise ou non. Le récepteur de STb, le sulfatide, n’est pas directement impliqué dans ces mécanismes. L’internalisation activité cellulaire-dépendante suggère une endocytose, nécessitant la réorganisation de l’actine mais pas les lipid rafts. L’internalisation de STb est donc un processus complexe dépendant du type cellulaire, qu’il apparait plus relevant d’étudier dans des modèles cellulaires représentatifs des conditions in vivo.

Caractérisation fonctionnelle de la GTPase Ran dans le cancer épithélial de l'ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire est le plus létal des cancers gynécologiques. Les tumeurs de l’ovaire se divisent en différentes classes reflétant l’étendue de la maladie. Les tumeurs à faible potentiel de malignité présentent une survie relative à 5 ans de 90%, alors que pour les tumeurs invasives, la survie à 5 ans chute drastiquement à 35-40%. Au laboratoire, nous avons précédemment identifié la protéine Ran, un membre de la superfamille des GTPases Ras, comme marqueur fortement exprimé dans les cancers épithéliaux de l’ovaire de haut grade et de haut stade dont la surexpression est associée à un mauvais pronostic. Ran est déjà connue pour contribuer au transport nucléocytoplasmique et à la progression du cycle cellulaire, mais son rôle dans le cancer ovarien n’est pas bien défini. En utilisant une approche de shRNA inductibles à la tétracycline basée sur les lentivirus, nous avons montré que la diminution de l’expression de Ran dans des lignées cellulaires agressives du cancer de l’ovaire affecte drastiquement la prolifération cellulaire par l’induction d’une apoptose caspase-3 dépendante. Par un essai de tumeurs en xénogreffes, nous avons démontré que la déplétion de Ran résulte en une diminution de la tumorigenèse et que la formation éventuelle de tumeurs est associée à une sélection des cellules tumorales ayant la capacité de ré-exprimer la protéine Ran. Ces résultats suggèrent un rôle critique pour Ran dans la survie et la tumorigénicité des cellules du cancer ovarien, indiquant que Ran pourrait être une cible thérapeutique intéressante.

Effet de la thérapie de resynchronisation cardiaque sur les fonctions ventriculaires gauche et droite

La thérapie de resynchronisation cardiaque (CRT) est un traitement qui vise à rétablir le synchronisme de contraction du ventricule gauche chez les patients souffrant d’insuffisance cardiaque. Aujourd’hui encore, plus de 30% de ces patients ne répondent pas au traitement de resynchronisation. Afin de mieux comprendre les effets de la CRT sur la fonction cardiaque, un resynchronisateur biventriculaire a été implanté chez des chiens sains et des chiens atteints d’insuffisance cardiaque. Les fonctions ventriculaires gauche et droite ont été étudiées selon différents modes de resynchronisation. Les résultats de cette étude confirment premièrement que la durée du complexe QRS n’est pas un marqueur approprié dans l’optimisation de la CRT. Les résultats démontrent également qu’une optimisation individualisée de la CRT est nécessaire afin de maximiser l’effet de la thérapie sur le ventricule gauche et que la modulation du délai de resynchronisation a un impact significatif sur la fonction ventriculaire droite. Plus précisément, la fonction systolique du ventricule droit est optimale lors d’une activation précoce de l’électrode gauche.

Étude moléculaire de la fonction du gène Bmi1 dans le processus de sénescence du système nerveux

Des études présentées dans cette thèse ont permis de démontrer que le gène du groupe Polycomb (PcG) Bmi1 est essentiel à l’auto-renouvellement des progéniteurs rétiniens immatures et pour le développement rétinien après la naissance. Ce travail illustre chez l’embryon que Bmi1 est hautement enrichie dans une sous-population de progéniteurs rétiniens exprimant le marqueur de surface SSEA-1 et différents marqueurs de cellules souches. À tous les stades de développement analysés, l’absence de Bmi1 résulte en une diminution de la prolifération et de l’auto-renouvellement des progéniteurs immatures. Pour mieux comprendre la cascade moléculaire en absence de Bmi1, nous avons inactivé p53 dans les colonies Bmi1-/-. Cette inactivation a permis une restauration partielle du potentiel d’auto-renouvellement. De plus, en absence de Bmi1, la prolifération et la maintenance de la population de progéniteurs rétiniens immatures localisés dans le corps ciliaire sont aussi affectées après la naissance. Bmi1 permet donc de distinguer les progéniteurs immatures de la population principale de progéniteurs, et est requis pour le développement normal de la rétine. Nous avons également démontré que l’oncogène Bmi1 est requis dans les neurones pour empêcher l’apoptose et l’induction d’un programme de vieillissement prématuré, causé par une baisse des défenses anti-oxydantes. Nous avons observé dans les neurones Bmi1-/- une augmentation des niveaux de p53, de la concentration des ROS et de la sensibilité aux agents neurotoxiques. Nous avons démontré ainsi que Bmi1 contrôle les défenses anti-oxydantes dans les neurones en réprimant l’activité pro-oxydante de p53. Dans les neurones Bmi1-/-, p53 provoque la répression des gènes anti-oxydants, induisant une augmentation des niveaux de ROS. Ces résultats démontrent pour la première fois que Bmi1 joue un rôle critique dans la survie et le processus de vieillissement neuronal.

L’influence du réseau de chimiokines sur les lymphocytes T dans le contexte de l’infection à virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1)

Les chimiokines et leurs récepteurs respectifs jouent un rôle important dans l’immunité innée et adaptative. Les récepteurs de chimiokines identifient des cellules T CD4+ avec potentiel de migration dans des tissus spécifiques et à fonctionnalité distincte du point de vue de la spécificité antigénique et de la production de cytokines. L’identité de la population des cellules T CD4+ susceptibles versus résistantes à l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) reste mal définie. Le recrutement dans les muqueuses intestinales d’un excès de cellules T effectrices (CD8+) comparé aux cellules cibles (CD4+) représente un bon pronostic de l’infection par le virus de l’immunodéficience simienne (VIS), tandis que la déplétion des cellules Th17 dans les tissus lymphoïdes associés au tractus gastro-intestinal (GALT) est un marqueur de la progression de l’infection à VIH. L’effet régulateur des chimiokines sur l’activation de la réplication virale dans différentes sous-populations cellulaires T CD4+ reste peu étudié. Ce projet de maîtrise est divisé en 3 parties: (1) l’identification des récepteurs de chimiokines CCR4, CXCR3 et CCR6 comme marqueurs de surfaces des sous populations T CD4+ avec susceptibilité distincte à l’infection par le VIH; (2) la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules T CD4+ et T CD8+ spécifiques au VIH de sujets à progression lente vers le stade sida (LTNP); et (3) les effets des chimiokines ligands de CCR4, CXCR3 et CCR6 sur l’activation cellulaire et la réplication virale in vitro. Nos résultats démontrent que les cellules T CD4+ CCR4+CCR6+ (profile cytokinique Th17) et CXCR3+CCR6+ (profile cytokinique Th1/Th17) sont hautement permissives à l’infection par le VIH. Nous proposons également de nouveaux corrélats de protection immunitaire contre le VIH chez les sujets LTNP: (i) le potentiel de co-localisation dans les muqueuses intestinales des cellules T CD4+ et CD8+ spécifiques au VIH via l’intégrine β7, (ii) le ratio élevé entre les cellules T effectrices (CD8+) versus les cellules cibles (CD4+) spécifiques au VIH, (iii) le profil cytokinique Th17 et (iv) la capacité des cellules T CD4+ et CD8+ spécifiques au VIH à produire des ligands de CCR5 bloquant l’entrée virale. Finalement, nos résultats sur l’effet co-stimulateur des chimiokines sur les cellules T et leurs effets opposés sur la réplication virale démontrent l’implication du réseau des chimiokines dans la régulation de la pathogenèse de l’infection à VIH.