Lien entre l'hémostase et le développement néoplasique : rôle spécifique du facteur tissulaire et de l'inhibiteur du facteur tissulaire

Il est reconnu, depuis une centaine d’années, que des désordres de la coagulation, regroupés sous le terme de coagulopathies, sont souvent associés au développement néoplasique. Pendant de nombreuses années, ces coagulopathies furent souvent reconnues comme une simple conséquence du développement du cancer. D’ailleurs, pour les cliniciens, l’apparition de ces anomalies sanguines constitue souvent le premier signe clinique d’un cancer occulte. Toutefois, l’étude approfondie du lien existant entre le système hémostatique et le cancer indique que différents facteurs hémostatiques vont interagir avec soit l’environnement tumoral ou soit la tumeur elle-même et influencer le développement du cancer. Au cours de nos travaux, nous avons porté une attention particulière à deux protéines jouant un rôle primordial dans l’hémostase. Le facteur tissulaire (TF) et l’inhibiteur du facteur tissulaire (TFPI) peuvent jouer des rôles pro- ou anti-néoplasique, et ce indépendamment de leurs fonctions hémostatiques normales. Dans le premier volet de cette thèse, nous avons étudié les propriétés antiangiogéniques de TFPI. L’angiogenèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir du réseau pré-existant, est reconnue comme étant une étape clée du développement tumoral. D’après nos travaux, le TFPI peut inhiber la formation de structures de type capillaire des cellules endothéliales (CEs) de la veine ombilicale humaine (HUVEC), et ce à une IC 50 de 5 nM, soit la concentration physiologique de l’inhibiteur. De plus, le TFPI bloque la migration des cellules endothéliales lorsque ces dernières sont stimulées par la sphingosine-1-phosphate (S1P), une molécule relâchée lors de l’activation des plaquettes sanguines. Cette inhibition de la migration cellulaire s’explique par l’effet du TFPI sur l’adhésion des CEs. En effet, TFPI inhibe la phosphorylation de deux protéines clées participant à la formation des complexes d’adhésion focales soit FAK (focal adhesion kinase) et PAX (paxilin). L’inhibition de ces deux protéines suggère qu’il y ait une réorganisation des complexes focaux, pouvant expliquer la perte d’adhérence. Finalement, des études de microscopie confocale démontrent que les cellules traitées au TFPI changent de morphologie au niveau du cytosquelette d’actine provoquant une désorganisation des structures migratoires (pseudopodes). Les effets du TFPI au niveau de la migration, de l’adhésion et de la morphologie cellulaire sont strictement spécifiques aux cellules endothéliales humaines, puisque aucun n’effet n’est observé en traitant des cellules cancéreuses de glioblastomes (GB) humains, qui sont normalement des tumeurs hautement vascularisées. En résumé, cette première étude démontre que le TFPI est un inhibiteur de l’angiogenèse. Dans le second volet de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux différents rôles de TF, le principal activateur de la coagulation. Cette protéine est également impliquée dans le développement néoplasique et notamment celui des médulloblastomes (MB) chez l’enfant via des fonctions hémostatiques et non-hémostatiques. Nos travaux démontrent que l’expression de TF est induite par la voie de signalisation de HGF (hepatocyte growth factor) et de son récepteur Met. Cet effet de HGF/Met semble spécifique aux MB puisque HGF ne peut stimuler l’expression de TF au niveau des cellules cancéreuses de glioblastomes. TF, exprimé à la surface des cellules médulloblastiques (DAOY), est responsable de l’activité pro-thrombogénique de ces cellules, ainsi qu’un acteur important de la migration de ces cellules en réponse au facteur VIIa (FVIIa). De plus, en étudiant 18 spécimens cliniques de MB, nous avons établi un lien entre l’intensité d’expression de TF et de Met. L’importance de cette corrélation est également suggérée par l’observation que les cellules exprimant les plus forts taux de TF et de Met sont également les plus agressives en termes d’index de prolifération et de dissémination métastatiques. En résumé, ces travaux représentent le point de départ pour la mise au point de TF comme un marqueur diagnostique clinique dans les cas de tumeurs du cerveau pédiatriques. De plus, l’élucidation de la voie de signalisation moléculaire responsable de l’expression de TF permet de mieux comprendre la biologie et le fonctionnement de ces tumeurs et de relier le profil d’expression de TF aux phénotypes agressifs de la maladie. Il est reconnu que HGF peut également jouer un rôle protecteur contre l’apoptose. Dans le troisième volet de cette thèse, nous avons remarqué que cette protection est corrélée à l’expression de TF. En réduisant à néant l’expression de TF à l’aide de la technologie des ARN silencieux (siRNA), nous démontrons que HGF ne protège plus les cellules contre l’apoptose. Donc, TF médie l’activité anti-apoptotique de HGF. TF assume cette protection en inactivant la phosphorylation de p53 sur la sérine 15, empêchant ainsi la translocation de p53 au noyau. Finalement, l’expression de TF et son interaction avec le FVIIa, au niveau des cellules médulloblastiques favorise la survie de ces dernières et ce même si elles sont soumises à de fortes concentrations de médicaments couramment utilisées en cliniques. Ce troisième et dernier volet démontre l’implication de TF en tant que facteur impliqué dans la survie des cellules cancéreuses, favorisant ainsi le développement de la tumeur. Dans son ensemble, cette thèse vise à démontrer que les facteurs impliqués normalement dans des fonctions hémostatiques (TFPI et TF) peuvent contribuer à réguler le développement tumoral. Tout système physiologique et pathologique est dépendant d’un équilibre entre activateur et inhibiteur et la participation de TF et de TFPI à la régulation du développement néoplasique illustre bien cette balance délicate. Par sa contribution anti- ou pro-néoplasique le système hémostatique constitue beaucoup plus qu’une simple conséquence du cancer; il fait partie par l’action de TF des stratégies élaborées par les cellules cancéreuses pour assurer leur croissance, leur déplacement et leur survie, alors que TFPI tente de limiter la croissance tumorale en diminuant la vascularisation.

Peptides vasoactifs endogènes dans la prolifération accrue des cellules musculaires lisses vasculaires de rats spontanément hypertendus: rôle des facteurs de croissance.

Contribuant à la pathophysiologie des maladies vasculaires comme dans le cas de l’hypertension, le remodelage vasculaire est associé à une altération de la croissance des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) (prolifération, taille, etc.). Or la prolifération des CMLV est augmentée par les peptides vasoactifs tels que l’angiotensine II (AngII) et l’endothéline-1 (ET-1). Ces peptides étant surexprimés lors de l’hypertension, cette étude fut entreprise pour déterminer leur contribution endogène ainsi que celles du facteur de croissance épidermique (EGF), du facteur de croissance insulinique (IGF-1) et du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) à la prolifération accrue des CMLV et aux mécanismes sous-jacents. Des CMLV A-10 et des CMLV de rats WKY et SHR âgés de 12 semaines ont été utilisées pour cette étude. La prolifération cellulaire fut déterminée par incorporation de [3H]thymidine. La phosphorylation de ERK 1/2 et du récepteur de EGF fut déterminée par immunobuvardage. Les CMLV de SHR, comparées à celles de WKY, ont montré une prolifération accrue qui fut atténuée par le losartan, un antagoniste du récepteur AT1 de l’AngII et par le BQ-123 et le BQ-788, antagonistes des récepteurs ETA et ETB de l’ET-1. La prolifération accrue des CMLV de SHR fut ramenée à celle des WKY par les inhibiteurs des récepteurs au PDGF (AG-1295), au IGF-1 (AG-1024) et au EGF (AG-1478). La phosphorylation du récepteur au EGF, accrue dans les CMLV de rats SHR comparée à celle des WKY, fut atténuée par le losartan, le BQ-123, le BQ-788 et l’AG-1478, mais ne fut pas atténuée par l’AG-1295 et l’AG-1024. De plus, la phosphorylation accrue de ERK 1/2 dans les CMLV de rats SHR fut atténuée par le losartan, le BQ-123, le BQ-788 et les inhibiteurs des récepteurs aux facteurs de croissance. Parallèlement, le rôle de la transactivation de EGF-R dans la prolifération accrue induite par AngII et ET-1 fut aussi examiné dans les CMLV A-10. L’augmentation, induite par AngII et ET-1, de la prolifération et de la phosphorylation de ERK 1/2 dans les CMLV A-10 fut ramenée au niveau contrôle par AG-1478. Ces données suggèrent que les peptides vasoactifs endogènes induisent la prolifération accrue des CMLV par la signalisation des MAP kinases résultant de la transactivation de EGF-R.

Étude du rôle de l’auto-antigène nucléaire centromérique B (CENP-B) et des auto-anticorps anti-CENP-B dans l’activation des cellules musculaires lisses vasculaires : implication potentielle dans la pathophysiologie de la sclérose systémique

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune dont l’un des principaux auto-anticorps, dirigé contre la protéine centromérique B (CENP-B), est fortement associé à l’hypertension artérielle pulmonaire, l’une des causes majeures de décès dû à la ScS. L’hypertension résulte de l’occlusion progressive des vaisseaux suite à une hyperactivation des cellules musculaires lisses (CML) de la paroi vasculaire. Cependant, les facteurs responsables de ce remodelage vasculaire restent inconnus. Plusieurs études récentes ont démontré que certains auto-antigènes possèdent des fonctions biologiques additionnelles lorsqu'ils se retrouvent dans le milieu extracellulaire. En effet, une fois libérés par nécrose ou apoptose, ces auto-antigènes adoptent une activité biologique qui s'apparente à celles des cytokines et peuvent ainsi participer aux processus normaux de réparation de blessure et/ou acquérir une activité pathogène qui contribue au développement de certaines maladies auto-immunes. Nos résultats suggèrent que la CENP-B peut être ajoutée à cette liste de molécules bifonctionnelles. À l'aide des techniques d'immunofluorescence, d'ELISA cellulaire et de cytométrie en flux, nous avons démontré que la CENP-B se liait spécifiquement à la surface des CML vasculaire de l’artère pulmonaire avec une plus grande affinité pour le phénotype contractile que synthétique. Cette liaison provoquait la migration des cellules ainsi que la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine 6 et 8. Les mécanismes par lesquels la protéine exerçait ces effets impliquaient la phosphorylation de FAK et Src ainsi que la voie des MAP kinases, avec ERK1/2 et p38. Des études de signalisation intracellulaire effectuées à l’aide de plusieurs inhibiteurs spécifiques ainsi que des études de désensibilisation nous ont permis d’identifier le récepteur de la CENP-B en plus d’identifier les mécanismes complets de sa signalisation membranaire. Nous avons démontré que la CENP-B se liait de manière spécifique aux CML vasculaire via le récepteur de chémokine 3 (CCR3) pour ensuite transactiver le récepteur EGF, selon un mécanisme métalloprotéase-dépendant qui implique le relargage du HB-EGF. Cette transactivation est un processus important dans l’activation de la voie des MAP kinases ainsi que dans la sécrétion d’IL-8 induite par la CENP-B. Finalement, nous avons démontré que les auto-anticorps anti-CENP-B pouvaient abolir cette cascade de signalisation, empêchant ainsi la CENP-B d’exercer son rôle de cytokine. L’identification de la CENP-B comme ligand du CCR3 ouvre donc plusieurs perspectives quant à l’étude du rôle pathogène des auto-anticorps anti-CENP-B dans la ScS.

Le vieillissement chronologique de Schizosaccharomyces pombe : Implication des voies de détection du glucose

La première augmentation de la longévité en laboratoire fût observée à la suite d’une intervention nutritionnelle consistant en une réduction de l’apport alimentaire chez le rat. Plus tard, ce phénomène a été reproduit dans de très nombreuses espèces et référé en tant que restriction calorique. Le développement des techniques de biologie moléculaire moderne a permis de montrer dans des organismes modèles simples que cette flexibilité du processus de vieillissement était régulée par des facteurs génétiques. De fait, plusieurs mécanismes cellulaires ont alors pu être identifiés comme responsables de ce contrôle du vieillissement. Ces voies de régulation ont révélées être conservées entre les espèces, depuis les levures jusqu’aux organismes multicellulaires tels que le nématode, la mouche ou la souris, suggérant l’existence d’un programme universel de vieillissement dans le vivant. La levure s’est avéré à plusieurs reprises être un modèle puissant et fiable pour la découverte de gènes impliqués dans ce phénomène. Mon étude a consisté au développement d’un nouveau modèle unicellulaire d’étude du vieillissement à travers l’espèce Schizosaccharomyces pombe appelée aussi levure à fission. La première étape de mon travail a montré que les voies de détection des nutriments gouvernées par la sérine/thréonine protéine kinase A (Pka1) et la sérine/thréonine kinase Sck2 contrôlent le vieillissement chronologique de ces cellules comme il était connu dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Ceci permit de valider l’utilisation de la levure à fission pour l’étude du vieillissement. Ensuite, nous avons analysé plus en détail l’effet pro-vieillissement du glucose en étudiant le rôle de sa détection par le récepteur membranaire Git3 couplé à la protéine G (Gpa2) en amont de la kinase Pka1. La perte du signal du glucose par la délétion de Git3 imite partiellement l’effet d’augmentation de longévité obtenu par baisse de la concentration en glucose dans le milieu. De plus, l’effet néfaste du signal du glucose est maintenu en absence de tout métabolisme du glucose suite à la mutation des hexokinases, premières enzymes de la glycolyse. L’ensemble de ces résultats suggèrent que la signalisation du glucose est prédominante sur son métabolisme pour son effet pro-vieillissement. D’autre part, à la fois la suppression de cette signalisation et la baisse de niveau de glucose disponible allongent la durée de vie en corrélation avec une augmentation de la résistance au stress, une hausse d’activité mitochondriale et une baisse de production de radicaux libres. Finalement, le criblage d’une banque de surexpression d’ADNc a permis d’identifier plusieurs gènes candidats responsables de ces effets en aval de la voie de signalisation Git3/PKA. La recherche sur les mécanismes moléculaires du vieillissement propose une nouvelle approche, un nouvel angle de vue, pour la compréhension des fonctions cellulaires et promet d’apporter de précieuses clefs pour mieux comprendre certaines maladies. En effet, le vieillissement est la première cause d’apparition de nombreuses affections comme les cancers, les maladies cardiovasculaires et métaboliques ou les maladies neurodégénératives tels que les syndromes d’Alzheimer et de Parkinson.

Comparaison des mécanismes de régulation des isoformes a et b des récepteurs 5-HT4

Les actions thérapeutiques des antidépresseurs, disponibles actuellement, requièrent plusieurs semaines de traitement. Ce délai est dû aux adaptations des sites pré et post-synaptiques qui, respectivement, augmentent la disponibilité synaptique des monoamines sérotonine et noradrénaline (5-HT et NA), et entraînent les changements neuroplastiques modifiant la fonction neuronales dans les régions limbiques. Il a été récemment observé, chez un modèle animal de dépression, que l’agoniste RS67333 des récepteurs sérotoninergiques de type 5-HT4 produisait des changements comportementaux, électrophysiologiques, cellulaires et biochimiques, tel qu’observé chez les antidépresseurs. Ces changements apparaissent seulement après 3 jours de traitement tandis que les antidépresseurs nécessitent souvent plusieurs semaines. De plus, l’activation des récepteurs 5-HT4 ne générait pas de tolérance, et cela pendant 21 jours de traitement. Seulement, les propriétés de signalisation et de régulation de ces récepteurs sont très loin d’êtres établies. Nous avons alors voulu mieux caractériser ces deux aspects de leur fonction, en se concentrant d’avantage sur les isoformes a et b, fortement exprimés dans le système limbique. Pour cela, nous avons voulu évaluer d’abord leur capacité de production d’AMPc dans un système hétérologue. Les essais d’accumulation d’AMPc démontrent que les deux isoformes sont capables de moduler positivement et négativement des niveaux d’AMPc en présence de 5-HT. Par contre, la stimulation au RS67333 induit seulement une augmentation du niveau d’AMPc dans les deux cas. Ensemble, ces observations indiquent que les deux isoformes sont capables de coupler à l’adénylate cyclase à travers les protéines Gαs et Gαi. La quantification des récepteurs internalisés a montré que l’isoforme b internalisait plus efficacement que l’isoforme a suite à l’incubation à la 5-HT (61 ± 3 % pour le b vs 40 ± 2 % pour le a). Les protéines kinases PKA et PKC n’étaient pas impliquées dans cette différence, toutefois, la PKC a été trouvée essentielle à l’internalisation des deux isoformes. L’internalisation de l’isoforme b par 5-HT n’a pas été affecté par la surexpression de forme inactive de GRK2 (GRK2- K220R) et a été partiellement inhibé par un mutant négative de la β-arrestine (βarr(319-418)), tandis que l’internalisation de l’isoforme a a été bloquée par les deux. Ces observations indiquent que les mécanismes d’internalisation des deux isoformes du récepteur 5-HT4 les plus abondants dans le système nerveux central sont distincts. Des comportements spécifiques à chaque isoforme ont aussi été constatés au niveau de la régulation fonctionnelle suite à l’exposition au RS67333, qui désensibilise seulement l’isoforme b. D’après nos observations, nous avons conclu que les isoformes a et b diffèrent dans leur propriétés de signalisation et de régulation. L’incapacité du RS67333 à désensibiliser l’isoforme a fournit un substrat moléculaire pour les effets antidépressifs prolongés de cet agoniste dans les études pré-cliniques.

Étiopathogenèse de la scoliose idiopathique de l'adolescent : implication de la mélatonine et de l'ostéopontine

La scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est une maladie dont la cause est encore inconnue, et qui génère des déformations complexes du rachis, du thorax et du bassin. La prévalence est de 4% dans la population adolescente au Québec. Cette pathologie affecte surtout les filles durant leur poussée de croissance pubertaire. Parmi plusieurs hypothèses émises, l’hypothèse neuroendocrinienne, impliquant une déficience en mélatonine comme agent étiologique de la SIA a suscité beaucoup d’intérêt. Cette hypothèse découle du fait que l’ablation de la glande pinéale chez le poulet produit une scoliose ressemblant sous plusieurs aspects à la pathologie humaine. La pertinence biologique de la mélatonine dans la scoliose est controversée, étant donné que la majorité des études chez l’homme n’ont pu mettre en évidence une diminution significative des niveaux de mélatonine circulante chez les patients scoliotiques. Nous avons démontré un dysfonctionnement dans la signalisation de la mélatonine au niveau des tissus musculo-squelettiques chez une série de patients atteints de SIA (Moreau & coll. 2004). Nous avons confirmé ce défaut chez un plus grand nombre de patients ainsi qu’en utilisant une nouvelle technologie (spectroscopie cellulaire diélectrique) n’ayant pas recours à un prétraitement des cellules donnant ainsi des résultats plus précis. Cette technique a montré la présence des mêmes groupes fonctionnels identifiés auparavant par la technique d’AMPc. Le dysfonctionnement de la signalisation de la mélatonine est dû à une phosphorylation accrue des protéines G inhibitrices. Ce défaut pourrait être causé par un déséquilibre de l’activité des kinases et phosphatases capables de réguler la phosphorylation des protéines Gi. Parmi ces kinases, PKCd a suscité initialement notre intérêt vu qu’elle peut phosphoryler les protéines Gi. Nous avons démontré que cette kinase interagit avec le récepteur de la mélatonine MT2 et que cette interaction varie selon le groupe fonctionnel auquel un patient SIA appartient. Par la suite nos travaux se sont dirigés vers la découverte d’effecteurs cellulaires régulés par la mélatonine et plus spécifiquement l’ostéopontine (OPN), compte tenu de son rôle présumé comme mécanorécepteur et dans certaines structures jouant un rôle dans la proprioception, le contrôle postural et la fonction vestibulaire. L’OPN a été identifiée initialement par sa surexpression au niveau protéique et de l’ARNm dans la musculature paraspinale uniquement chez les poulets scoliotiques. Nous avons également utilisé un autre modèle animal, la souris C57Bl/6 naturellement déficiente en mélatonine. Nous avons généré des souris bipèdes en amputant les membres antérieurs de souris OPN KO, des souris CD44 KO ainsi que des souris contrôles C57Bl/6. Nos résultats ont montré qu’aucune souris OPN KO (n=50) ou CD44 KO (n=60) ne développe la maladie, contrairement aux souris contrôles C57Bl/6 (n=50) dont 45% deviennent scoliotiques. Ces résultats nous ont poussés à investiguer le rôle de cette protéine dans l’étiopathogenèse de la maladie chez l’humain. Nos résultats ont montré une augmentation des niveaux circulants d’OPN chez les patients atteints de la SIA et que l’élevation en OPN corrélait avec la sévérité de la maladie. Nos études chez les enfants asymptomatiques nés de parents scoliotiques et qui sont plus à risque de développer la maladie ont aussi démontré des différences significatives au niveau des concentrations en OPN en comparaison avec les sujets sains. En effet, plusieurs enfants à risque présentaient des niveaux d’OPN supérieurs à 800ng/ml suggérant un plus grand risque de développer une scoliose indiquant aussi que l’augmentation des niveaux en OPN précède le début de la maladie.

Étude du rôle de la MAP Kinase non-conventionnelle ERK3 dans le développement thymique et l'activation des lymphocytes T

Les voies de signalisation des MAP kinases (MAPK) conventionnelles jouent des rôles essentiels pendant le développement des lymphocytes T (LT) ainsi que lors de leur activation suite à la reconnaissance antigénique. En raison de ses différences structurelles ainsi que de son mode de régulation, ERK3 fait partie des MAPK dites non-conventionnelles. Encore aujourd’hui, les événements menant à l’activation de ERK3, ses substrats ou partenaires ainsi que sa fonction physiologique demeurent peu caractérisés. Nous avons entrepris dans cette thèse d’étudier le rôle de ERK3 lors du développement et de l’activation des LT en utilisant un modèle de souris déficient pour l’expression de ERK3. Nous avons premièrement établi que ERK3 est exprimée chez les thymocytes. Ensuite, nous avons évalué le développement thymique chez la souris ERK3-déficiente et nous avons observé une diminution significative de la cellularité aux étapes DN1, DP et SP CD4+ du développement des LT. La création de chimères hématopoïétiques ERK3-déficientes nous a permis de démontrer que la diminution du nombre de cellules observée aux étapes DN1 et DP est autonome aux thymocytes alors que le phénotype observé à l’étape SP CD4+ est dépendant de l’abolition simultanée de ERK3 dans l’épithélium thymique et dans les thymocytes. Une étude plus approfondie de l’étape DP nous a permis de démontrer qu’en absence de ERK3, les cellules DP meurent plus abondamment et accumulent des cassures doubles brins (DSB) dans leur ADN. De plus, nous avons démontré que ces cassures dans l’ADN sont réalisées par les enzymes RAG et qu’en absence de ces dernières, la cellularité thymique est presque rétablie chez la souris ERK3-déficiente. Ces résultats suggèrent que ERK3 est impliquée dans un mécanisme essentiel à la régulation des DSB pendant le réarrangement V(D)J de la chaîne  du récepteur des cellules T (RCT). Dans le deuxième article présenté dans cette thèse, nous avons montré que ERK3 est exprimé chez les LT périphériques, mais seulement suite à leur activation via le RCT. Une fois activés in vitro les LT ERK3-déficients présentent une diminution marquée de leur prolifération et dans la production de cytokines. De plus, les LT ERK3-déficients survivent de façon équivalente aux LT normaux, mais étonnamment, ils expriment des niveaux plus faibles de la molécule anti-apoptotique Bcl-2. Ces résultats suggèrent que la prolifération réduite des LT ERK3-déficients est la conséquence d’une altération majeure de leur activation. Ainsi, nos résultats établissent que ERK3 est une MAPK qui joue des rôles essentiels et uniques dans le développement thymique et dans l’activation des lymphocytes T périphériques. Grâce à ces travaux, nous attribuons pour la toute première fois une fonction in vivo pour ERK3 au cours de deux différentes étapes de la vie d’un LT.

Implication de l'endosome de recyclage dans la migration cellulaire in vivo

Au cours de l’ovogenèse chez la mouche du vinaigre: Drosophila melanogaster, un groupe de cellules folliculaires appelées cellules de bord, migrent à travers les cellules nourricières pour atteindre l’ovocyte. Cet événement, nécessitant la transition épithélio- mésenchymateuse (TEM), la réorientation, puis l’arrêt, ressemble à la formation de métastases. L’endocytose est un régulateur clé de plusieurs événements polarisés, y compris la migration cellulaire. En effet, différentes protéines impliquées dans la migration, comme les intégrines et les E-cadhérines (cadhérines épithéliales), sont régulées par transport à travers les endosomes. De même, l’endocytose restreint au front de migration l’activité des récepteurs tyrosine kinases (RTKs) qui guident les cellules de bord dans leur mouvement. Cependant les mécanismes moléculaires de cette restriction spatiale de l’activité des RTKs demeurent largement inconnus. Nous avons testé l’implication du trafic vésiculaire à travers la machinerie d’endocytose, dans la migration dirigée des cellules de bord, car ce système est facilement accessible pour l’expression de protéines et l’analyse de mutants. Nous avons commencé par confirmer une observation précédente du rôle de l’endosome précoce dans la migration des cellules de bord. Ensuite, nous avons identifié l’endosome de recyclage (ER) comme un régulateur clé de cette migration. En effet, nous avons démontré que l’expression dans les cellules de bord d’une forme dominante négative de Rab11, la petite GTPase régulant le transport vésiculaire à travers l’ER, bloque la migration ou entraîne de sévères défauts de migration dans environ 80% des chambres d’œufs examinées. De plus, nous observons par immunofluorescence une relocalisation de l’activité des RTKs alors que d’autres protéines de migration ne sont pas affectées par Rab11 dominant négatif. Ce résultat a été par la suite confirmé par une interaction génétique entre Rab11 et les RTKs. D’autre part, nous avons montré que le complexe exocyste, un effecteur de Rab11, est impliqué dans la migration des cellules de bord. Nous avons trouvé par microscopie confocale en tissu fixé et par microscopie en temps réel que Sec15, un composant de ce complexe, est polarisé, de façon Rab11- dépendante, dans des vésicules qui s’accumulent au front de migration tout au long du mouvement des cellules de bord. De plus, la perte de l’activité de Sec15 perturbe à son tour la migration. Ainsi, toutes ces données démontrent le rôle fondamental d’un cycle d’endo- exocytose dans le maintien des RTKs actifs au niveau du front de migration des cellules de bord le long de leur mouvement.

Endothelin-1 and H2O2-induced signaling in vascular smooth muscle cells : modulation by CaMKII and Nitric oxide

L’endothéline-1 (ET-1) est un peptide vasoactif extrêmement puissant qui possède une forte activité mitogénique dans les cellules du muscle lisse vasculaire (VSMCs). Il a été démontré que l’ET-1 est impliquée dans plusieurs maladies cardio-vasculaires, comme l’athérosclérose, l'hypertension, la resténose après l'angioplastie, l’insuffisance cardiaque et l'arythmie. L’ET-1 exerce ses effets via plusieurs voies de signalisation qui incluent le Ca2+, les protéines kinases activées par les mitogènes (MAPKs) y compris les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2) et la voie de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/protein kinase B (PKB). Plusieurs études ont démontré que les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) peuvent jouer un rôle important dans la signalisation d’ERK1/2 et de PKB induite par plusieurs facteurs de croissance et hormones. Nous avons précédemment montré que l'ET-1 produit des ROS qui agissent comme médiateur de la signalisation cellulaire induite par l’ET-1. Le peroxyde d’hydrogène (H2O2), une molécule qui appartient à la famille des ROS, peut activer les voies de la MAPK et de la PKB dans les VSMCs. Par ailleurs, nos résultats suggèrent également que le Ca2+ et la calmoduline (CaM) sont essentiels pour la phosphorylation d’ERK1/2, de p38 et de PKB induite par le H2O2 dans les VSMCs. La Ca2+/CaM-dependent protein kinases II (CaMKII) est une sérine/thréonine protéine kinase multifonctionnelle activée par le Ca2+/CaM. Il a été montré que la CaMKII est impliquée dans les voies de signalisation induite par le H2O2 dans les cellules endothéliales. Cependant, le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de la proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) induite par l’ET-1 et le H2O2, de même que son rôle dans l’effet hypertrophique et prolifératif de l’ET-1 dans les VSMCs demeure inexploré. Le monoxyde d’azote (NO) est une molécule vasoactive impliquée dans la régulation de plusieurs réponses hormonales. Le NO peut moduler la signalisation contrôlant la croissance cellulaire induite par plusieurs agonistes d’où son rôle protecteur dans le système vasculaire. Des études ont montré que le NO peut inhiber la voie de Ras/Raf/ERK1/2 et la voie de PKB induite par le facteur de croissance endothélial (EGF) et l’angiotensine II (Ang II). Beaucoup d’autres travaux ont mis en évidence un cross-talk entre les voies de signalisation activées par l’ET-1 et le NO. La capacité du NO à inhiber la signalisation intracellulaire induite par l’ET-1 dans les VSMCs demeure inconnue. Le travail présenté dans cette thèse vise à déterminer le rôle du système Ca2+-CaM-CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 et le H2O2 ainsi que son rôle dans la croissance et la prolifération cellulaire induites par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également testé le rôle du NO dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 ainsi que la synthèse protéique induite par l’ET-1. Dans la première partie de notre étude, nous avons examiné le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs en utilisant trois approches différentes i.e. l'usage d'inhibiteurs pharmacologiques, un peptide auto-inhibiteur de la CaMKII (CaMKII AIP) et la technique de siRNA. Nous avons démontré que la CaMKII est impliquée dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Des études précédentes ont montré à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques comme le KN-93 que l'Ang II et les agents induisant une augmentation de la concentration en Ca2+ intracellulaire comme l’ionomycine, provoquent la phosphorylation d’ERK1/2 via la CaM dans les VSMCs. Cependant, en utilisant différentes approches, nos études ont montré pour la première fois une implication de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également rapporté pour la première fois, un rôle crucial de la CaMKII dans la pathophysiologie vasculaire associée à l’ET-1 puisque l’activation de la CaMKII joue un rôle important dans l’hypertrophie et la croissance cellulaire. Dans la deuxième partie, à la lumière des études précédentes qui montraient que les ROS agissent comme médiateurs de la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs, nous avons examiné si la CaMKII est également impliquée dans l’activation des voies d’ERK1/2 et de PKB induite par le H2O2. En utilisant des approches pharmacologiques et moléculaires, nous avons montré, comme pour l’ET-1, que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par le H2O2. Nous avons précédemment montré que la transactivation du récepteur de type I de l’insulin-like growth factor (IGF-1R) est nécessaire à l’activation de PKB induite par le H2O2. Pour cette raison, nous avons examiné l'effet de l'inhibition de la CaMKII par l’inhibiteur pharmacologique ou par le knock-down de la CaMKII sur la phosphorylation d’IGF-1R induite par le H2O2. Les résultats démontrent que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et d’IGF-1R induite par le H2O2. Dans la troisième partie de notre étude, nous avons également examiné le mécanisme moléculaire par lequel le NO exerce ses effets anti-mitogéniques et anti-hypertrophiques dans la signalisation induite par l’ET-1. En testant l'effet de deux différents donneurs de NO (S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), sodium nitroprusside (SNP)) et un inhibiteur de NO synthase, le N (G)-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1, nous avons observé que le NO a un effet inhibiteur sur la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Par ailleurs, le 8-Br-GMPc, un analogue du GMPc, a un effet similaire à celui des deux donneurs du NO, tandis que l’oxadiazole quinoxaline (ODQ), un inhibiteur de la guanylate cyclase soluble, inverse l'effet inhibiteur du NO. Nous concluons que le NO diminue la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 d’une manière dépendante du GMPc. Le NO inhibe aussi les effets hypertrophiques de l’ET-1 puisque le traitement avec le SNAP diminue la synthèse des protéines induite par l’ET-1. En résumé, les études présentées dans cette thèse démontrent que l’ET-1 et le H2O2 sont des activateurs de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 dans les VSMCs et que la CaMKII s’avère nécessaire pour ce processus, en agissant en amont de l’activation de IGF-1R induite par le H2O2 dans les VSMCs. Elles montrent également que le NO inhibe la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1. Enfin, nos travaux suggèrent aussi que l’activation de la CaMKII stimule la synthèse des protéines et de l’ADN induites par l’ET-1 alors que le NO inhibe la synthèse des protéines induite par ET-1. Mots clés: Endothéline ; Peroxyde d'hydrogène ; CaMKII ; Monoxyde d’azote ; Système vasculaire ; PKB; ERK1/2; IGF-1R; Hypertrophie.

Le VEGF induit la synthèse du PAF par l’entremise de l’activation du VEGFR-2 : identification des phosphotyrosines impliquées

Notre laboratoire a démontré que la capacité proinflammatoire du vascular endothelial growth factor (VEGF-A165) implique la synthèse endothéliale du facteur d’activation plaquettaire (PAF) via l’activation du récepteur tyrosine kinase homodimérique VEGFR-2/R-2. La synthèse du PAF requiert l’activation de la p38 MAPK et p42/44 MAPK qui activent la phospholipase A2 secrétée de type V (sPLA2-V). Nous avons découvert que la synthèse aigue de prostacycline (PGI2) induite par le VEGF-A165 requiert l’activation des récepteurs hétérodimériques VEGFR-1/R-2. L’activation sélective des récepteurs du VEGF peut donc agir comme balance dans la synthèse de facteurs pro-(PAF) et anti-(PGI2) inflammatoire. Cependant, les tyrosines impliquées dans la transphosphorylation de VEGFR-2/R-2 menant à la synthèse du PAF sont inconnues. Par mutagenèse dirigée, nous avons effectué des transfections transitoires de cellules endothéliales avec des plasmides codant pour le VEGFR-2 dont les tyrosines ciblées ont été remplacées de façon séquentielle par une phénylalanine. Un vecteur vide pcDNA a été utilisé comme contrôle négatif. La stimulation des cellules endothéliales de l’aorte bovine (BAEC) transfectées avec le VEGF-A165 (1nM) pendant 15 minutes augmente la synthèse du PAF de 300%, laquelle était similaire dans les BAEC non transfectées. Dans les BAEC transfectées avec les vecteurs pcDNA codant pour les mutations Y801F, Y1059F, Y1175F et Y1214F, nous avons observé une réduction de 54, 73, 68, et 57% respectivement de la synthèse du PAF induite par le VEGF par rapport au pcDNA témoin. Nos résultats apportent un nouvel aperçu sur le mécanisme par lequel le VEGF induit la synthèse du PAF qui est connu pour sa contribution dans l’activité pro-inflammatoire du VEGF.

Rôle de la protéine ScFRK1 dans le développement du sac embryonnaire et son impact sur le guidage des tubes polliniques

Le gène Solanum chacoense Fertilization-Related Kinase 1 (ScFRK1) code pour une protéine de la famille des MAPKK kinases exprimée spécifiquement dans les ovules. Son transcrit s’accumule principalement dans la zone micropylaire du sac embryonnaire à l’anthèse et diminue rapidement après pollinisation. Ces résultats suggèrent un rôle possible avant ou pendant la fécondation. Bien qu'aucune expression ne soit détectée dans le pollen à maturité, la protéine est cependant présente dans les cellules mères de microspores. Des plantes transgéniques sous-exprimant ScFRK1 ne montrent aucun phénotype au niveau des tissus végétatifs, mais présentent de petits fruits dépourvus de graines. L’étude microscopique du gamétophyte femelle révèle que son développement ne progresse pas au-delà du stade de la mégaspore fonctionnelle et une grande proportion de sacs embryonnaires anormaux est corrélée avec une faible expression de ScFRK1. De plus, la production de pollen viable diminue en fonction de la baisse des niveaux d’expression du gène, ce qui pourrait s’expliquer par un problème au cours de la mitose I. Puisque l’intégrité du sac embryonnaire est essentielle au guidage des tubes polliniques, nous avons conçu un système de guidage semi-in vivo permettant d’évaluer la capacité des ovules du mutant ScFRK1 à les attirer. L’attraction est sévèrement affectée dans de telles conditions, ce qui confirme l'implication des cellules de la zone micropylaire comme source attractive. Notre système nous a également permis de démontrer que le guidage est très spécifique à l’espèce et que cette attraction constitue un mécanisme important favorisant la spéciation et la maintenance des barrières interspécifiques dans la reproduction sexuée des végétaux.

Étude de la régulation du facteur de transcription NF-kB dans l'infection par le RSV

L’infection par le Virus Respiratoire Syncytial cause des affections pulmonaires aiguës en pédiatrie caractérisée par une réponse inflammatoire excessive médiée par la production de cytokines par les cellules épithéliales des voies aériennes. Les gènes codant pour ces cytokines sont régulés par le facteur de transcription NF-κB (p50/p65) dont l’activation est classiquement induite par la phosphorylation de son inhibiteur IκBα, ce qui permet l’accumulation de l’hétérodimère au noyau. Par contre, nous avons récemment identifié la phosphorylation en sérine 536 de la sous-unité p65 comme une autre étape essentielle à son activation lors de l’infection des AEC par RSV. Le travail présenté dans ce mémoire a permis de démontrer que l’inhibition de l’expression de RIG-I, de Cardif ou de TRAF6, 3 protéines impliquées dans la reconnaissance cellulaire des virus, conduit à l’inhibition de cette phosphorylation en réponse à RSV. Nous avons également établi à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques et d’ARNi que, parmi les diverses kinases connues pour phosphoryler p65 en réponse à divers stimulus, IKKα/β sont essentielles à cette phosphorylation lors d’une stimulation par RSV. Puisque TRAF6 est bien connu dans la littérature pour activer le complexe IKK, nous proposons que TRAF6, après reconnaissance de l’ARN viral de RSV par RIG-I, active le complexe IKK qui induit la phosphorylation de la sousunité p65 de NF-κB, permettant l’expression de gènes cibles. D’autre part, nous avions précédemment démontré que Nox2, un isoforme de NADPH oxydase, contrôle l’activation de NF-κB en régulant les phosphorylations de IκBα et p65. Nous montrons ici que l’inhibition de Nox2 réduit fortement l’activité du complexe kinase IKK. De plus, la présence au niveau basal de Nox2 est critique pour le niveau d’ARN messager de Cardif. Nous proposons donc que la régulation de la phosphorylation de p65 en ser536 par Nox2 soit via son effet sur Cardif en permettant la fonctionnalité de la voie RIG-I.

Étude des voies de signalisation en amont et en aval de la petite GTPase Rac1

Les évènements moléculaires en amont et en aval de la petite GTPase Rac1 menant à la migration cellulaire sont encore mal compris. La première partie du projet consiste à utiliser une approche protéomique non-biaisée pour tenter d’identifier les partenaires de Rac. Pour ce faire, nous avons développé une méthode de purification efficace et rapide de manière à maintenir les complexes protéiques transitoires intacts. Dans un deuxième temps, nous avons identifié des sites de phosphorylation sur la RacGEF atypique Dock5 en aval des intégrines. Afin de mieux comprendre le rôle de la phosphorylation de cette protéine, nous avons criblé une banque de kinases ce qui nous a permis d’identifier 14 kinases pouvant phosphoryler la région PXXP de Dock5. D’après nos résultats, ceci aurait comme effet de diminuer l’interaction entre Dock5 et ses partenaires contenant des domaines SH3. Ainsi, la phosphorylation de Dock5 régulerait la formation de complexes et le recrutement de Dock5 par des protéines adaptatrices.

Mécanismes moléculaires d’activation du récepteur A des peptides natriurétiques

Le récepteur A des peptides natriurétiques (NPRA) fait partie de la famille des guanylates cyclases membranaires. L’activation du NPRA par ses agonistes naturels, ANP et BNP, induit une production de GMPc qui est responsable de leur rôle dans l’homéostasie cardiovasculaire, l’inhibition de l’hypertrophie et de la fibrose cardiaques et la régulation de la lipolyse. Le NPRA est un homodimère non covalent composé d’un domaine extracellulaire de liaison du ligand (ECD), d’un unique domaine transmembranaire (TM), d’un domaine d’homologie aux kinases et d’un domaine guanylate cyclase. Bien que le NPRA ait un rôle physiologique important, les mécanismes moléculaires régissant son processus d’activation restent inconnus. Nous avons donc analysé les premières étapes du processus d’activation du NPRA. Nous avons d'abord étudié le rôle de la dimérisation des ECD dans l’activation du récepteur. Nous avons utilisé les techniques de liaison de radioligand, de FRET et de modélisation moléculaire, pour caractériser la liaison à l’ECD des agonistes naturels, d’un superagoniste et d’un antagoniste. L’ANP se lie à un dimère d’ECD préformé et la dimérisation spontanée est l’étape limitante du processus de liaison. De plus, comme le démontrent nos études de FRET, tous les peptides, incluant l’antagoniste, stabilisent le récepteur sous sa forme dimérique. Cependant, l’antagoniste A71915 stabilise le dimère d’ECD dans une conformation différente de celle induite par l’ANP. La dimérisation du NPRA semble donc nécessaire, mais non suffisante à l’activation du récepteur. L’état d’activation du NPRA dépend plutôt de l’orientation des sous unités dans le dimère. Nous avons ensuite étudié le mécanisme moléculaire de transduction du signal à travers la membrane. Plusieurs études ont suggéré que l’activation du NPRA implique un changement de conformation du domaine juxtamembranaire (JM). Cependant, les études de cristallographie de l’ECD soluble de NPRA n’ont pas permis de documenter la structure du JM et le changement de conformation impliqué dans la transduction du signal reste inconnu. Pour analyser ce changement de conformation, nous avons d’abord séquentiellement substitué les neuf acides aminés du JM par une cystéine. En étudiant la capacité des mutants à former des dimères covalents de façon constitutive ou induite par l’ANP, nous avons pu évaluer la proximité relative des résidus du JM, avant et après activation du NPRA. Ces résultats ont démontré la proximité élevée de certains résidus spécifiques et sont en contradiction avec les données cristallographiques. Nous avons également démontré que le domaine intracellulaire impose une contrainte conformationnelle au JM à l’état de base, qui est levée après liaison de l’ANP. En introduisant de 1 à 5 alanines dans l’hélice-α transmembranaire, nous avons montré qu’une rotation des TM de 40° induit une activation constitutive du NPRA. Le signal d’activation pourrait donc être transmis à travers la membrane par un mécanisme de rotation des TM. En utilisant nos données expérimentales, nous avons généré le premier modèle moléculaire illustrant la conformation active du NPRA, où les domaines JM et TM sont représentés. Dans son ensemble, cette étude apporte une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires régissant les premières étapes du processus complexe d’activation du NPRA.

Rôle de la protéine phosphatase PPM1A dans l'homéostasie hépatique du glucose et des lipides

L’insuline est une hormone essentielle qui induit des réponses complexes dans l’organisme pour maintenir l’homéostasie du glucose et des lipides. La résistance à son action est un phénomène pathologique observé dans un large éventail de situations, allant de l’obésité et du syndrome métabolique à la stéatose hépatique et au diabète de type 2, qui aboutissent au développement de l’athérosclérose et de la mortalité. Des avancées remarquables ont été réalisées dans notre compréhension des mécanismes moléculaires responsables du développement de la résistance à l’action de l’insuline. En particulier, l’induction d’un stress cellulaire par des taux élevés d’acides gras libres (AGL) et des cytokines, via l’activation des protéines Ser/Thr kinases, qui augmente la phosphorylation sur des résidus sérine, des molécules critiques impliquées dans la signalisation insulinique (p. ex. IR, IRS et p85) et conduit à la diminution de la réponse cellulaire à l’insuline. Cependant, la plupart des chercheurs ont limité leur travail dans l’investigation du rôle des protéines kinases susceptibles de modifier la réponse cellulaire à l’insuline. Donc, peu de données sont disponibles sur le rôle des Protéines Ser/Thr phosphatases (PS/TPs), même si il est bien établi que la phosphorylation de ces protéines est étroitement régulée par un équilibre entre les activités antagonistes des Ser/Thr kinases et des PS/TPs. Parmi les PS/TPS, PPM1A (également connu sous le nom PP2Cα) est une phosphatase particulièrement intéressante puisqu’il a été suggéré qu’elle pourrait jouer un rôle dans la régulation du métabolisme lipidique et du stress cellulaire. Ainsi, en se basant sur des résultats préliminaires de notre laboratoire et des données de la littérature, nous avons émis l’hypothèse selon laquelle PPM1A pourrait améliorer la sensibilité à l’insuline en diminuant l’activité des protéines kinases qui seraient activées par le stress cellulaire induit par l’augmentation des AGL. Ces effets pourraient finalement améliorer le métabolisme glucidique et lipidique dans l’hépatocyte. Ainsi, pour révéler le rôle physiologique de PPM1A à l’échelle d’un animal entier, nous avons généré un modèle animal qui la surexprime spécifiquement dans le foie. Nous décrivons ici notre travail afin de générer ce modèle animal ainsi que les premières analyses pour caractériser le phénotype de celui-ci. Tout d’abord, nous avons remarqué que la surexpression de PPM1A chez les souris C57BL/6J n’a pas d’effets sur le gain de poids sur une longue période. Deuxièmement, nous avons observé que PPM1A a peu d’effets sur l’homéostasie du glucose. Par contre, nous avons montré que sa surexpression a des effets significatifs sur l’homéostasie du glycogène et des triglycérides. En effet, nous avons observé que le foie des souris transgéniques contient moins de glycogène et de triglycérides que le foie de celles de type sauvage. De plus, nos résultats suggèrent que les effets de la surexpression de PPM1A pourraient refléter son impact sur la synthèse et la sécrétion des lipides hépatiques puisque nous avons observé que sa surexpression conduit à l’augmentation la triglycéridémie chez les souris transgéniques. En conclusion, nos résultats prouvent l’importance de PPM1A comme modulateur de l’homéostasie hépatique du glucose et des lipides. Des analyses supplémentaires restent cependant nécessaires pour confirmer ceux-ci et éclaircir l’impact moléculaire de PPM1A et surtout pour identifier ses substrats.