Dégradation des membres de la famille du LDLR par la convertase PCSK9 : troisième locus de l'hypercholestérolémie familiale

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont les principales causes de mortalité et de morbidité à travers le monde. En Amérique du Nord, on estime à 90 millions le nombre d’individus ayant une ou plusieurs MCV, à près de 1 million le nombre de décès reliés par année et à 525 milliards de dollars les coûts directs et indirects en 2010. En collaboration avec l’équipe du Dre. Boileau, notre laboratoire a récemment identifié, le troisième locus impliqué dans l’hypercholestérolémie familiale. Une étude publiée dans le New Engl J Med a révélé que l’absence de la convertase PCSK9 réduit de 88% le risque de MCV, corrélé à une forte réduction du taux de cholestérol plasmatique (LDL-C). Il fut démontré que PCSK9 lie directement le récepteur aux lipoprotéines de faible densité (LDLR) et, par un mécanisme méconnu, favorise sa dégradation dans les endosomes/lysosomes provoquant ainsi une accumulation des particules LDL-C dans le plasma. Dans cet ouvrage, nous nous sommes intéressés à trois aspects bien distincts : [1] Quels sont les cibles de PCSK9 ? [2] Quelle voie du trafic cellulaire est impliquée dans la dégradation du LDLR par PCSK9 ? [3] Comment peut-on inhiber la fonction de PCSK9 ? [1] Nous avons démontré que PCSK9 induit la dégradation du LDLR de même que les récepteurs ApoER2 et VLDLR. Ces deux membres de la famille du LDLR (fortes homologies) sont impliqués notamment dans le métabolisme des lipides et de la mise en place de structures neuronales. De plus, nous avons remarqué que la présence de ces récepteurs favorise l’attachement cellulaire de PCSK9 et ce, indépendamment de la présence du LDLR. Cette étude a ouvert pour la première fois le spectre d’action de PCSK9 sur d’autres protéines membranaires. [2] PCSK9 étant une protéine de la voie sécrétoire, nous avons ensuite évalué l’apport des différentes voies du trafic cellulaire, soit extra- ou intracellulaire, impliquées dans la dégradation du LDLR. À l’aide de milieux conditionnées dérivés d’hépatocytes primaires, nous avons d’abord démontré que le niveau extracellulaire de PCSK9 endogène n’a pas une grande influence sur la dégradation intracellulaire du LDLR, lorsqu’incubés sur des hépatocytes provenant de souris déficientes en PCSK9 (Pcsk9-/-). Par analyses de tri cellulaire (FACS), nous avons ensuite remarqué que la surexpression de PCSK9 diminue localement les niveaux de LDLR avec peu d’effet sur les cellules voisines. Lorsque nous avons bloqué l’endocytose du LDLR dans les cellules HepG2 (lignée de cellules hépatiques pour l’étude endogène de PCSK9), nous n’avons dénoté aucun changement des niveaux protéiques du récepteur. Par contre, nous avons pu démontrer que PCSK9 favorise la dégradation du LDLR par l’intermédiaire d’une voie intracellulaire. En effet l’interruption du trafic vésiculaire entre le réseau trans-Golgien (RTG) et les endosomes (interférence à l’ARN contre les chaînes légères de clathrine ; siCLCs) prévient la dégradation du LDLR de manière PCSK9-dépendante. [3] Par immunobuvardage d’affinité, nous avons identifié que la protéine Annexine A2 (AnxA2) interagit spécifiquement avec le domaine C-terminal de PCSK9, important pour son action sur le LDLR. Plus spécifiquement, nous avons cartographié le domaine R1 (acides aminés 34 à 108) comme étant responsable de l’interaction PCSK9AnxA2 qui, jusqu’à présent, n’avait aucune fonction propre. Finalement, nous avons démontré que l’ajout d’AnxA2 prévient la dégradation du LDLR induite par PCSK9. En somme, nos travaux ont pu identifier que d’autres membres de la famille du LDLR, soit ApoER2 et VLDLR, sont sensibles à la présence de PCSK9. De plus, nous avons mis en évidence que l’intégrité du trafic intracellulaire est critique à l’action de PCSK9 sur le LDLR et ce, de manière endogène. Finalement, nous avons identifié l’Annexine A2 comme unique inhibiteur naturel pouvant interférer avec la dégradation du LDLR par PCSK9. Il est indéniable que PCSK9 soit une cible de premier choix pour contrer l’hypercholestérolémie afin de prévenir le développement de MCV. Cet ouvrage apporte donc des apports considérables dans notre compréhension des voies cellulaires impliquées, des cibles affectées et ouvre directement la porte à une approche thérapeutique à fort potentiel.

Caractérisation de l’ubiquitin-fold modifier (UFM1) dans un modèle C. elegans

L’ubiquitin-fold modifier (UFM1) fait partie de la classe 1 de la famille de protéine ubiquitin-like (Ubl). UFM1 et Ub ont très peu d’homologie de séquence, mais partagent des similarités remarquables au niveau de leur structure tertiaire. Tout comme l’Ub et la majorité des autres Ubls, UFM1 se lie de façon covalente à ses substrats par l’intermédiaire d’une cascade enzymatique. Il est de plus en plus fréquemment rapporté que les protéines Ubls sont impliquées dans des maladies humaines. Le gène Ufm1 est surexprimé chez des souris de type MCP développant une ischémie myocardique et dans les îlots de Langerhans de patients atteints du diabète de type 2. UFM1 et ses enzymes spécifiques, UBA5, UFL1 et UFC1, sont conservés chez les métazoaires et les plantes suggérant un rôle important pour les organismes multicellulaires. Le Caenorhabditis elegans est le modèle animal le plus simple utilisé en biologie. Sa morphologie, ses phénotypes visibles et ses lignées cellulaires ont été décrits de façon détaillée. De plus, son cycle de vie court permet de rapidement observer les effets de certains gènes sur la longévité. Ce modèle nous permet de facilement manipuler l’expression du gène Ufm1 et de mieux connaître ses fonctions. En diminuant l’expression du gène ufm-1 chez le C.elegans, par la technique de l’ARN interférence par alimentation, nous n’avons observé aucun problème morphologique grave. Les vers ressemblaient aux vers sauvages et possédaient un nombre de progéniture normal. Cependant, les vers sauvage exposés à l’ARNi d’ufm-1 vivent significativement moins longtemps que les contrôles et ce, de façon indépendante de la voie de signalisation de l’insuline/IGF. Chez le C. elegans la longévité et la résistance au stress cellulaire sont intimement liées. Nous n’avons remarqué aucun effet d’ufm-1 sur le stress thermal, osmotique ou oxydatif, mais il est requis pour la protection contre le stress protéotoxique. Il est également nécessaire au maintien de l’intégrité neuronale au cours du vieillissement des animaux. L’ensemble de nos données nous renseigne sur les fonctions putatives du gène Ufm1.

Le rôle de la barrière hémato-encéphalique dans la pathogénèse de l'oedème chez des rats souffrant d'insuffisance hépatique chronique

L’œdème cérébral est une complication associée à l’encéphalopathie hépatique (EH) lors d’une insuffisance hépatique chronique (cirrhose du foie). Présentement, l’origine de sa pathogenèse, vasogénique (rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE)) ou cytotoxique (prise anormale d’ions), n’a pas encore été déterminée. Il a été démontré que le co-transporteur Na-K-Cl (NKCC1) du côté luminal des microvaisseaux sanguins cérébraux (CMV) joue un rôle dans le développement de l’œdème cérébral dans des modèles d’ischémie où la bumetanide, un inhibiteur de NKCC, atténue l’œdème cérébral. Deux modèles d’EH ont été utilisés pour cette étude i) la ligature de la voie biliaire (BDL) qui présente l’hyperammoniémie chronique, l’œdème cérébral et le stress oxydatif systémique ; ii) l’anastomose portocave (PCA) qui présente de l’hyperammoniémie chronique seulement. Les buts du projet étaient de: i) définir l’origine du développement de l’œdème chez les rats BDL en étudiant l’extravasation de macromolécules, les jonctions serrées et l’activation des métalloprotéinases matricielles de la BHE; ii) observer les effets de l’hyperammoniémie chronique indépendamment sur la BHE chez les rats PCA; iii) évaluer le rôle de l’hyperammoniémie et du stress oxydatif et iv) étudier le rôle du NKCC1 dans les CMV dans la pathogenèse de l’œdème cérébral. Les résultats du projet démontrent que l’œdème est d’origine cytotoxique chez les rats BDL et que l’intégrité de la BHE est conservée chez les rats PCA malgré l’hyperammoniémie. L’expression génique du NKCC1 est associée à l’œdème mais pas son expression protéique et sa phosphorylation. Enfin, l’étude démontre que l’hyperammoniémie et le stress oxydatif indépendant ne jouent pas un rôle dans la pathogenèse de l’œdème mais suggère qu’ils y aient un effet synergique.

La sélectivité fonctionnelle des ligands du récepteur delta opiacé

Les récepteurs couplés aux protéines GRCPG sont une des plus grandes familles de récepteur membranaire codifié par le génome humain et certainement la plus grande famille de récepteurs. Localisés au niveau des membranes plasmiques, ils sont responsables d’une grande variété de réponses cellulaires. L’activation de ces derniers par des ligands était traditionnellement associée à un changement de conformation de la protéine, passant d’un état inactif à un état actif. Toutefois, certaines observations entraient en contradiction avec cette théorie et laissaient supposer la présence de plusieurs conformations actives du récepteur. Ces différentes conformations pouvaient être actives pour certaines voies de signalisation ou de régulation et inactives pour d’autres. Ce phénomène, initialement appelé agoniste dirigé ou « biased agonism », est maintenant décrit comme étant la sélectivité fonctionnelle des ligands des RCPG. Cette sélectivité des voies de signalisation et de régulation permettrait en théorie de développer des ligands capables de cibler seulement les voies de signalisation et de régulation responsable des effets thérapeutiques sans activer les voies responsables des effets secondaires ou indésirables. Le récepteur delta opiacé (DOR) est un RCPG impliqué dans la gestion de la douleur chronique. L’action analgésique de ses ligands est toutefois soumise à un effet de tolérance produite lors de leur utilisation à long terme. Cet effet secondaire limite l’utilisation thérapeutique de ces médicaments. Cette thèse s’est donc intéressée à la sélectivité fonctionnelle des ligands du DOR afin d’évaluer la possibilité de réduire les effets de tolérance produits par ces molécules. En premier lieu, nous avons déterminé que le DOR peut être stabilisé dans plusieurs conformations actives dépendantes du ligand qui le lie et ces conformations possèdent différents profils d’activation des voies de signalisation et de régulation. En deuxième lieu, nous avons déterminé que les différents ligands du DOR stabilisent des conformations du complexe récepteur/protéine G qui ne concordent pas avec la théorie des récepteurs à deux états, suggérant plutôt la présence d’une multitude de conformations actives. Finalement, nous avons démontré que ces différentes conformations interagissaient de façon distincte avec les protéines de régulation des RCPG; le ligand favorisant le retour du récepteur à la membrane produisant moins de désensibilisation et moins de tolérance aiguë à l’analgésie que le ligand favorisant la séquestration du récepteur à l’intérieur de la cellule. Les résultats de cette thèse démontrent que la sélectivité fonctionnelle des ligands opiacés pourrait être utilisée dans le développement de nouveau analgésique produisant moins de tolérance.

Modulation de la néovascularisation post-ischémique en présence de facteurs de risque cardiovasculaire

L’athérosclérose est la principale cause d’infarctus du myocarde, de mort subite d’origine cardiaque, d’accidents vasculaires cérébraux et d’ischémie des membres inférieurs. Celle-ci cause près de la moitié des décès dans les pays industrialisés. Lorsque les obstructions artérielles athérosclérotiques sont tellement importantes que les techniques de revascularisation directe ne peuvent être effectuées avec succès, la sévérité de l’ischémie tissulaire résiduelle dépendra de l’habilité de l’organisme à développer spontanément de nouveaux vaisseaux sanguins (néovascularisation). La néovascularisation postnatale est le résultat de deux phénomènes : la formation de nouveaux vaisseaux à partir de la vasculature existante (angiogenèse) et la formation de vaisseaux à partir de cellules souches progénitrices (vasculogenèse). Notre laboratoire a démontré que plusieurs facteurs de risque associés aux maladies cardiovasculaires (tabagisme, vieillissement, hypercholestérolémie) diminuaient également la réponse angiogénique suite à une ischémie. Cependant, les mécanismes précis impliqués dans cette physiopathologie sont encore inconnus. Un point commun à tous ces facteurs de risque cardiovasculaire est l’augmentation du stress oxydant. Ainsi, le présent ouvrage visait à élucider l’influence de différents facteurs de risque cardiovasculaire et du stress oxydant sur la néovascularisation. Nos résultats démontrent que l’exposition à la fumée de cigarette et le vieillissement sont associés à une diminution de la néovascularisation en réponse à l’ischémie, et que ceci est au moins en partie causé par une augmentation du stress oxydant. De plus, nous démontrons que les acides gras dérivés de la diète peuvent affecter la réponse à l’ischémie tissulaire. La première étude du projet de recherche visait à évaluer l’impact de l’exposition à la fumée de cigarette sur la néovascularisation post-ischémique, et l’effet d’une thérapie antioxydante. L’exposition à la fumée de cigarette a été associée à une réduction significative de la récupération du flot sanguin et de la densité des vaisseaux dans les muscles ischémiques. Cependant, une récupération complète de la néovascularisation a été démontrée chez les souris exposées à la fumée de cigarette et traitées au probucol ou aux vitamines antioxydantes. Nous avons démontré qu’une thérapie antioxydante administrée aux souris exposées à la fumée de cigarette était associée à une réduction significative des niveaux de stress oxydant dans le plasma et dans les muscles ischémiques. De plus, les cellules endothéliales progénitrices (EPCs) exposées à de l’extrait de fumée de cigarette in vitro présentent une diminution significative de leur activité angiogénique (migration, adhésion et incorporation dans les tissus ischémiques) qui a été complètement récupérée par le probucol et les vitamines antioxydantes. La deuxième étude avait pour but d’investiguer le rôle potentiel de la NADPH oxydase (Nox2) pour la modulation de la néovascularisation post-ischémique dans le contexte du vieillissement. Nous avons trouvé que l’expression de la Nox2 est augmentée par le vieillissement dans les muscles ischémiques des souris contrôles. Ceci est associé à une réduction significative de la récupération du flot sanguin après l’ischémie chez les vieilles souris contrôles comparées aux jeunes. Nous avons aussi démontré que la densité des capillaires et des artérioles est significativement réduite dans les muscles ischémiques des animaux vieillissants alors que les niveaux de stress oxydant sont augmentés. La déficience en Nox2 réduit les niveaux de stress oxydant dans les tissus ischémiques et améliore la récupération du flot sanguin et la densité vasculaire chez les animaux vieillissants. Nous avons aussi démontré que l’activité fonctionnelle des EPCs (migration et adhésion à des cellules endothéliales matures) est significativement diminuée chez les souris vieillissantes comparée aux jeunes. Cependant, la déficience en Nox2 est associée à une récupération de l’activité fonctionnelle des EPCs chez les animaux vieillissants. Nous avons également démontré une augmentation pathologique du stress oxydant dans les EPCs isolées d’animaux vieillissants. Cette augmentation de stress oxydant dans les EPCs n’est pas présente chez les animaux déficients en Nox2. La troisième étude du projet de recherche a investigué l’effet des acides gras dérivés de la diète sur la néovascularisation postnatale. Pour ce faire, les souris ont reçu une diète comprenant 20% d’huile de maïs (riche en oméga-6) ou 20% d’huile de poisson (riche en oméga-3). Nos résultats démontrent qu’une diète riche en oméga-3 améliore la néovascularisation post-ischémique au niveau macro-vasculaire, micro-vasculaire et clinique comparée à une diète riche en oméga-6. Cette augmentation de la néovascularisation postnatale est associée à une réduction du ratio cholestérol total/cholestérol HDL dans le sérum et à une amélioration de la voie VEGF/NO dans les tissus ischémiques. De plus, une diète riche en acides gras oméga-3 est associée à une augmentation du nombre d’EPCs au niveau central (moelle osseuse) et périphérique (rate). Nous démontrons aussi que l’activité fonctionnelle des EPCs (migration et incorporation dans des tubules de cellules endothéliales matures) est améliorée et que le niveau de stress oxydant dans les EPCs est réduit par la diète riche en oméga-3. En conclusion, nos études ont permis de déterminer l’impact de différents facteurs de risque cardiovasculaire (tabagisme et vieillissement) et des acides gras dérivés de la diète (oméga-3) sur la néovascularisation post-ischémique. Nous avons aussi identifié plusieurs mécanismes qui sont impliqués dans cette physiopathologie. Globalement, nos études devraient contribuer à mieux comprendre l’effet du tabagisme, du vieillissement, des oméga-3, et du stress oxydant sur l’évolution des maladies vasculaires ischémiques.

Méthodologie pour la synthèse combinatoire d’azapeptides: application à la synthèse d’analogues aza-GHRP-6 en tant que ligands du récepteur CD36

Les azapeptides sont des mimes peptidiques où le carbone alpha d’un ou de plusieurs acides aminés est remplacé par un atome d’azote. Cette modification tend à stabiliser une conformation en repliement beta en raison de la répulsion électronique entre les paires d’électrons libres des atomes d’azote adjacents et de la géométrie plane de l’urée. De plus, le résidu semicarbazide a une meilleure résistance face aux protéases en plus d’être chimiquement plus stable qu’une liaison amide. Bien que les propriétés des azapeptides en fassent des mimes peptidiques intéressants, leurs méthodes de synthèses font appel à la synthèse laborieuse d’hydrazines substituées en solution. Le peptide sécréteur d’hormone de croissance 6 (GHRP-6, His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2) est un hexapeptide synthétique qui possède une affinité pour deux récepteurs distincts: les récepteurs GHS-R1a et CD36. Les travaux effectués au cours de mon doctorat qui seront détaillés dans cet ouvrage visent à atteindre deux objectifs: (1) le développement d’analogues du peptide GHRP-6 sélectif à un seul récepteur et (2) la mise au point d’une nouvelle méthodologie pour la synthèse combinatoire d’azapeptides. En réponse au premier objectif, la synthèse parallèle de 49 analogues aza-GHRP-6 a été effectuée et certains candidats sélectifs au récepteur CD36 ont été identifiés. L’étude de leurs propriétés anti-angiogéniques, effectuée par nos collaborateurs, a également permis d’identifier des candidats intéressants pour le traitement potentiel de la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Une nouvelle approche pour la synthèse combinatoire d’azapeptides, faisant appel à l’alkylation et la déprotection chimiosélective d’une sous-unité semicarbazone ancrée sur support solide, a ensuite été développée. La portée de cette méthodologie a été augmentée par la découverte de conditions permettant l’arylation régiosélective de cette sous-unité semicarbazone, donnant accès à treize nouveaux dérivés aza-GHRP-6 possédant des résidus aza-arylglycines aux positions D-Trp2 et Trp4. L’élaboration de conditions propices à l’alkylation et la déprotection chimiosélective de la semicarbazone a donné accès à une variété de chaînes latérales sur l’acide aminé « aza » préalablement inaccessibles. Nous avons, entre autres, démontré qu’une chaîne latérale propargyl pouvait être incorporée sur l’acide aminé « aza ». Tenant compte de la réactivité des alcynes, nous avons ensuite élaboré des conditions réactionnelles permettant la formation in situ d’azotures aromatiques, suivie d’une réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire sur support solide, dans le but d’obtenir des mimes de tryptophane. Sept analogues du GHRP-6 ont été synthétisés et testés pour affinité au récepteur CD36 par nos collaborateurs. De plus, nous avons effectué une réaction de couplage en solution entre un dipeptide possédant un résidu aza-propargylglycine, du paraformaldehyde et une variété d’amines secondaires (couplage A3) afin d’accéder à des mimes rigides d’aza-lysine. Ces sous-unités ont ensuite été incorporées sur support solide afin de générer sept nouveaux azapeptides avec des dérivés aza-lysine à la position Trp4 du GHRP-6. Enfin, une réaction de cyclisation 5-exo-dig a été développée pour la synthèse de N-amino imidazolin-2-ones en tant que nouveaux mimes peptidiques. Leur fonctionnalisation par une série de groupements benzyliques à la position 4 de l’hétérocycle a été rendue possible grâce à un couplage Sonogashira précédant la réaction de cyclisation. Les propriétés conformationnelles de cette nouvelle famille de composés ont été étudiées par cristallographie aux rayons X et spectroscopie RMN d’un tétrapeptide modèle. L’activité biologique de deux mimes peptidiques, possédant un résidu N-amino-4-méthyl- et 4-benzyl-imidazolin-2-one à la position Trp4 du GHRP-6, a aussi été examinée. L’ensemble de ces travaux devrait contribuer à l’avancement des connaissances au niveau des facteurs structurels et conformationnels requis pour le développement d’azapeptides en tant que ligands du récepteur CD36. De plus, les résultats obtenus devraient encourager davantage l’utilisation d’azapeptides comme peptidomimétiques grâce à leur nouvelle facilité de synthèse et la diversité grandissante au niveau de la chaîne latérale des acides aminés « aza ».

Régulation des hémicanaux de connexine 43 : implication dans la cardioprotection contre les lésions ischémiques

La connexine 43 (Cx43) est l’unité protéique de base dans la formation des canaux des jonctions gap (JG) responsables des échanges intercellulaires. Toutefois, elle forme aussi des canaux non-jonctionnels à large conductance, nommés hémicanaux (Hc), qui fournissent un accès entre l’intérieure des cellules et le milieu extracellulaire. Bien qu’ils soient beaucoup moins étudiés que les JG, on estime que les Hc restent normalement à l’état fermé, et ce, grâce à la phosphorylation des connexines qui les forment. Suite à un stress ischémique, les Cx43 se déphosphorylent et entraînent ainsi l’ouverture des Hc de Cx43 (HcCx43), un effet qui compromet la survie des cellules. La protéine kinase C (PKC) est l’enzyme de phosphorylation qui possède le plus grand nombre de sites de phosphorylation sur la Cx43 en comparaison avec les autres kinases. Ses fonctions dépendent de la mise en jeu d’un répertoire d’au moins 12 isoformes distinctes. Dans les cardiomyocytes, les isoformes de PKC participent au développement des réponses adaptées ou mésadaptées au stress ischémique. Malgré que la régulation des canaux de Cx43 par la PKC lors d’une ischémie soit bien documentée, il n’existe pas à l’heure actuelle de connaissances sur les effets fonctionnels spécifiques qu’exercent des différentes isoformes de PKC sur les HcCx43, ni sur la valeur thérapeutique de la modulation de ses derniers. Dans ce contexte, nous avons proposé que les HcCx43 sont régulés sélectivement et différentiellement par les différentes isoformes de PKC et que l’inhibition spécifique de ces hémicanaux peut protéger le coeur lors d’un événement ischémique. Le présent travail comporte trois études qui ont été entreprises spécialement dans le but de valider ces hypothèses. Dans la première étude, nous avons profité de l’expertise du laboratoire du Dr Baroudi dans la dissection des isoformes de PKC pour étudier le rôle fonctionnel de chacune d’elles dans la régulation des HcCx43 en utilisant une gamme unique de peptides synthétiques inhibiteurs et activateurs spécifiques des isoformes de PKC, en combinaison avec la technique du patch-clamp. Nous avons démontré, entre autre, que les HcCx43 sont particulièrement inhibés par l’isoforme PKC epsilon, connue pour son effet cardioprotecteur contre les dommages ischémiques lors d’un préconditionnement ischémique. Dans la deuxième étude, nous avons caractérisé l’effet d’un peptide synthétique mimétique structural de la Cx43 sur la fonction des HcCx43. En plus d’avoir élucidé ces effets sur les propriétés fonctionnelles du canal, nous avons démontré d’une manière directe et indéniable que le peptide Gap26 inhibe et spécifiquement les HcCx43 et que son administration in vitro (cardiomyocytes isolés) et ex vivo (coeur intact) confère à ces modèles expérimentaux une résistance importante contre le stress ischémique. Dans la troisième étude, nous avons investigué pour la première fois in vivo le potentiel de deux peptides uniques mimétiques structuraux de la Cx43, Gap26 et Gap27, dans la cardioprotection contre les lésions ischémiques lorsqu’ils sont administrés à basse dose sous forme d’un bolus intraveineux unique. Nous avons démontré que l’injection de ces peptides avant ou après la survenue de l’ischémie réduit significativement la taille de l’infarctus qui en résulte.En conclusion, l’ensemble de ces résultats révèlent le rôle bénéfique de l’inhibition des HcCx43 lors d’une ischémie et dévoilent un potentiel thérapeutique prometteux des mimétiques structuraux de Cx43 dans la prévention et le traitement de l’infarctus du myocarde.

Étude du système dopaminergique pré- et postsynaptique : régulation de l'autorécepteur D2 par la neurotensine et formation des synapses excitatrices dans le striatum

La dopamine (DA) est un neurotransmetteur impliqué dans la modulation de fonctions essentielles du cerveau telles que le contrôle des mouvements volontaires, le système de récompense et certains aspects de la cognition. Depuis sa découverte, la DA a attiré énormément d'attention scientifique en partie à cause des pathologies majeures associées aux dysfonctions du système DAergique, comme la maladie de Parkinson, la schizophrénie et la toxicomanie. On retrouve la majorité des neurones qui synthétisent la DA au niveau du mésencéphale ventral, dans les noyaux de la substance noire compacte (SNc) et de l'aire tegmentaire ventrale (ATV). Ces neurones projettent leurs axones dans un très dense réseau de fibres qui s'organisent en trois voies DAergiques classiques: la voie nigrostriée, la voie mésolimbique et la voie mésocorticale. La transmission DAergique s'effectue par l'activation de récepteurs de la DA qui font partie de la grande famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs). Les récepteurs de la DA sont abondamment exprimés aussi bien par les neurones DAergiques que par les neurones des régions cibles, ce qui implique que la compréhension de la signalisation et des fonctions particulières des récepteurs de la DA pré- et postsynaptiques représente un enjeu crucial dans l'étude du système DAergique. Cette thèse de doctorat se sépare donc en deux volets distincts: le premier s'intéresse à la régulation du récepteur D2 présynaptique par la neurotensine (NT), un neuropeptide intimement lié à la modulation du système DAergique; le deuxième s'intéresse au côté postsynaptique du système DAergique, plus particulièrement à la ségrégation de l'expression des récepteurs de la DA dans le striatum et aux fonctions de ces récepteurs dans l'établissement des circuits neuronaux excitateurs prenant place dans cette région. Dans la première partie de cette thèse, nous démontrons que l'activation du récepteur à haute affinité de la NT, le NTR1, provoque une internalisation hétérologue du récepteur D2, avec une amplitude et une cinétique différente selon l'isoforme D2 observé. Cette internalisation hétérologue dépend de la protéine kinase C (PKC), et nous montrons que la surexpression d'un récepteur D2 muté sur des sites de phosphorylation par la PKC ii ainsi que l'inhibition de l'expression de β-arrestine1 par ARNs interférents dans des neurones DAergiques bloquent complètement l'interaction fonctionnelle entre le NTR1 et le D2. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous démontrons d'abord que la ségrégation de l'expression des récepteurs D1 et D2 dans le striatum est déjà bien établie dès le 18e jour embryonnaire, bien qu'elle progresse encore significativement aux jours 0 et 14 postnataux. Nos résultats témoignent aussi d'un maintien complet de cette ségrégation lorsque les neurones striataux sont mis en culture aussi bien en présence ou en absence de neurones corticaux et/ou mésencéphaliques. Ensuite, nous montrons que la présence de neurones mésencéphaliques stimule la formation d’épines et de synapses excitatrices sur les neurones striataux épineux exprimant le récepteur D2 (MSN-D2). Le co-phénotype glutamatergique des neurones dopaminergiques semble nécessaire à une grande partie de cet effet. Par ailleurs, le nombre total de terminaisons excitatrices formées sur les MSN-D2 par les neurones corticaux et mésencéphaliques apparaît être régit par un équilibre dynamique. Finalement, nous démontrons que le blocage de la signalisation des récepteurs D1 et D2 de la DA n'est pas nécessaire pour la formation des synapses excitatrices des MSN-D2, alors que l'antagonisme des récepteurs glutamatergiques ionotropes diminue la densité d'épines dendritiques et contrôle de façon opposée le nombre de terminaisons excitatrices corticales et mésencéphaliques. Globalement, ce travail représente une contribution significative pour une meilleure compréhension du fonctionnement normal du système DAergique. Ces découvertes sont susceptibles d’être utiles pour mieux comprendre les dysfonctions de ce système dans le cadre de pathologies du cerveau comme la maladie de Parkinson.

The Role of MicroRNA Regulation of Cardiac Ion Channel in Arrhythmia

La fibrillation auriculaire (FA) est le trouble du rythme le plus fréquemment observé en pratique clinique. Elle constitue un risque important de morbi-mortalité. Le traitement de la FA reste un défi majeur en lien avec les nombreux effets secondaires associés aux approches thérapeutiques actuelles. Dans ce contexte, une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à la FA est essentielle pour le développement de nouvelles thérapies offrant un meilleur rapport bénéfice/risque pour les patients. La FA est caractérisée par i) un remodelage électrique délétère associé le plus souvent ii) à un remodelage structurel du myocarde favorisant la récurrence et le maintien de l’arythmie. La diminution de la période réfractaire effective au sein du tissu auriculaire est un élément clef du remodelage électrique. Le remodelage structurel, quant à lui, se manifeste principalement par une fibrose tissulaire qui altère la propagation de l’influx électrique dans les oreillettes. Les mécanismes moléculaires impliqués dans la mise en place de ces deux substrats restent mal connus. Récemment, le rôle des microARNs (miARNs) a été pointé du doigt dans de nombreuses pathologies notamment cardiaques. Dans ce contexte les objectifs principaux de ce travail ont été i) d'acquérir une compréhension approfondie du rôle des miARNs dans la régulation de l’expression des canaux ioniques et ii) de mieux comprendre le rôle de ces molécules dans l’installation d’un substrat favorable a la FA. Nous avons, dans un premier temps, effectué une analyse bio-informatique combinée à des approches expérimentales spécifiques afin d’identifier clairement les miARNs démontrant un fort potentiel de régulation des gènes codant pour l’expression des canaux ioniques cardiaques humains. Nous avons identifié un nombre limité de miARNs cardiaques qui possédaient ces propriétés. Sur la base de ces résultats, nous avons démontré que l’altération de l'expression des canaux ioniques, observée dans diverse maladies cardiaques (par exemple, les cardiomyopathies, l’ischémie myocardique, et la fibrillation auriculaire), peut être soumise à ces miARNs suggérant leur implication dans l’arythmogénèse. La régulation du courant potassique IK1 est un facteur déterminant du remodelage électrique auriculaire associée à la FA. Les mécanismes moléculaires sous-jacents sont peu connus. Nous avons émis l’hypothèse que l'altération de l’expression des miARNs soit corrélée à l’augmentation de l’expression d’IK1 dans la FA. Nous avons constaté que l’expression de miR-26 est réduite dans la FA et qu’elle régule IK1 en modulant l’expression de sa sous-unité Kir2.1. Nous avons démontré que miR-26 est sous la répression transcriptionnelle du facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT) et que l’activité accrue de NFATc3/c4, aboutit à une expression réduite de miR-26. En conséquence IK1 augmente lors de la FA. Nous avons enfin démontré que l’interférence in vivo de miR-26 influence la susceptibilité à la FA en régulant IK1, confirmant le rôle prépondérant de miR-26 dans le remodelage auriculaire électrique. La fibrose auriculaire est un constituant majeur du remodelage structurel associé à la FA, impliquant l'activation des fibroblastes et l’influx cellulaire du Ca2 +. Nous avons cherché à déterminer i) si le canal perméable au Ca2+, TRPC3, jouait un rôle dans la fibrose auriculaire en favorisant l'activation des fibroblastes et ii) étudié le rôle potentiel des miARNs dans ce contexte. Nous avons démontré que les canaux TRPC3 favorisent l’influx du Ca2 +, activant la signalisation Ca2 +-dépendante ERK et en conséquence activent la prolifération des fibroblastes. Nous avons également démontré que l’expression du TRPC3 est augmentée dans la FA et que le blocage in vivo de TRPC3 empêche le développement de substrats reliés à la FA. Nous avons par ailleurs validé que miR-26 régule les canaux TRPC3 en diminuant leur expression dans les fibroblastes. Enfin, nous avons montré que l'expression réduite du miR-26 est également due à l’activité augmentée de NFATc3/c4 dans les fibroblastes, expliquant ainsi l’augmentation de TRPC3 lors de la FA, confirmant la contribution de miR-26 dans le processus de remodelage structurel lié à la FA. En conclusion, nos résultats mettent en évidence l'importance des miARNs dans la régulation des canaux ioniques cardiaques. Notamment, miR-26 joue un rôle important dans le remodelage électrique et structurel associé à la FA et ce, en régulant IK1 et l’expression du canal TRPC3. Notre étude démasque ainsi un mécanisme moléculaire de contrôle de la FA innovateur associant des miARNs. miR-26 en particulier représente apres ces travaux une nouvelle cible thérapeutique prometteuse pour traiter la FA.

Functional Analysis of Nuclear beta-Adrenergic Receptors in the Myocardium

Récemment plusieurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ont été caractérisés au niveau des membranes intracellulaires, dont la membrane nucléaire. Notre objectif était de déterminer si les sous-types de récepteurs β-adrénergiques (βAR) et leurs machineries de signalisation étaient fonctionnels et localisés à la membrane nucléaire des cardiomyocytes. Nous avons démontré la présence des β1AR et β3AR, mais pas du β2AR à la membrane nucléaire de myocytes ventriculaires adultes par immunobuvardage, par microscopie confocale, et par des essais fonctionnels. De plus, certains partenaires de signalisation comme les protéines GαS, Gαi, l’adénylate cyclase II, et V/VI y étaient également localisés. Les sous-types de βAR nucléaires étaient fonctionnels puisqu'ils pouvaient lier leurs ligands et activer leurs effecteurs. En utilisant des noyaux isolés, nous avons observé que l'agoniste non-sélectif isoprotérénol (ISO), et que le BRL37344, un ligand sélectif du β3AR, stimulaient l'initiation de la synthèse de l’ARN, contrairement à l'agoniste sélectif du β1AR, le xamotérol. Cette synthèse était abolie par la toxine pertussique (PTX). Cependant, la stimulation des récepteurs nucléaires de type B de l’endothéline (ETB) causaient une réduction de l'initiation de la synthèse d’ARN. Les voies de signalisations impliquées dans la régulation de la synthèse d’ARN par les RCPGs ont ensuite été étudiées en utilisant des noyaux isolés stimulés par des agonistes en présence ou absence de différents inhibiteurs des voies MAP Kinases (proteines kinases activées par mitogènes) et de la voie PI3K/PKB. Les protéines impliquées dans les voies de signalisation de p38, JNK, ERK MAP Kinase et PKB étaient présents dans les noyaux isolés. L'inhibition de PKB par la triciribine, inhibait la synthèse d’ARN. Nous avons ensuite pu mettre en évidence par qPCR que la stimulation par l’ISO entrainait une augmentation du niveau d'ARNr 18S ainsi qu’une diminution de l'expression d’ARNm de NFκB. En contraste, l’ET-1 n’avait aucun effet sur le niveau d’expression de l’ARNr 18S. Nous avons ensuite montré que la stimulation par l’ISO réduisait l’expression de plusieurs gènes impliqués dans l'activation de NFκB, tandis que l’inhibition de ERK1/2 et PKB renversait cet effet. Un microarray global nous a ensuite permis de démontrer que les βARs et les ETRs nucléaires régulaient un grand nombre de gènes distincts. Finalement, les βARs et ETRs nucléaires augmentaient aussi une production de NO de noyaux isolés, ce qui pouvait être inhibée par le LNAME. Ces résultats ont été confirmés dans des cardiomyocytes intacts en utilisant des analogues cagés et perméables d’ISO et de l'ET-1: l'augmentation de NO nucléaire détectée par DAF2-DA, causée par l'ET-1 et l'ISO, pouvait être prévenue par le LNAME. Finalement, l’augmentation de l’initiation de la transcription induite par l'ISO était aussi bloquée par le L-NAME ou par un inbitheur de PKG, le KT5823, suggérant que la voie NO-GC-PKG est impliquée dans la régulation de la transcription par les βAR. En conclusion, les βARs et les ETRs nucléaires utilisent des voies de signalisation différentes et exercent ainsi des effets distincts sur l’expression des gènes cardiaques. Ils représentent donc une avenue intéressante pour le développement de drogues pharmacologiques.

Exploration du rôle du fragment LG3 sur les cellules souches mésenchymateuses dans le contexte du rejet vasculaire

La vasculopathie du greffon est une pathologie caractérisée par un rétrécissement progressif et oblitérant des vaisseaux sanguins menant à une ischémie et une perte de fonction du greffon. Le rétrécissement vasculaire est dû à une accumulation de matrice extracellulaire (MEC) et de cellules mononuclées positives pour l’actine musculaire lisse alpha (alphaSMA) dont les cellules souches mésenchymateuses, le tout formant une néointima oblitérante. Cette pathologie est la cause principale de la perte des greffons rénaux et cardiaques à long terme. Le rejet vasculaire aigu est un prédicteur de la vasculopathie du greffon. L’équipe du Dr Hébert a démontré que l’apoptose endothéliale, qui joue un rôle important dans le développement du rejet vasculaire, initie la libération de LG3, un fragment du protéoglycan perlécan. Les taux sanguins et urinaires de LG3 sont augmentés chez les receveurs d’allogreffe rénale avec rejet vasculaire et vasculopathie du greffon. Les résultats obtenus en laboratoire durant ma maîtrise ont permis de mieux caractériser l’impact du LG3 sur un type cellulaire important participant à la formation de néointima : les cellules souches mésenchymateuses. Mes travaux ont démontré que le LG3 induit à la fois la migration horizontale des MSC et la transmigration des MSC. Cette migration est dépendante de la voie de signalisation d’ERK1/2, précédemment identifiée comme voie centrale dans la formation de néointima. De plus, nos résultats démontrent que la kinase Src est activée en amont de l’activation de la voie MAPK. La migration horizontale et la transmigration induites par le LG3 sont aussi dépendantes des intégrines alpha2beta1, ainsi que l’activation de la voie MAPK. Dans un modèle de transplantation murin, nous avons également démontré que l’injection sérique de LG3 recombinant favorise l’accumulation de cellules positives pour alphaSMA dans la néointima. En outre, lorsque le receveur est déficient pour l’intégrine alpha2, mais que le greffon est sauvage, la formation de néointima induite par l’injection de LG3 est diminuée dans le greffon suggérant que les cellules du receveur jouent un rôle important dans la formation de la néointima. Enfin, nous avons démontré que l’injection de LG3 augmente aussi le nombre de cellules positives pour la forme phosphorylée d’ERK1/2 (p-ERK1/2) dans la néointima du greffon et que cette accumulation est dépendante de la présence des intégrines 2 1 chez les cellules du receveur.Lorsque le receveur est sauvage, il y a une augmentation du nombre de cellules positives pour p-ERK1/2. L’investigation de ces mécanismes dans le remodelage vasculaire expose de nouvelles opportunités pour inhiber la réponse cellulaire qui mène au remodelage inadapté lors d’un dommage vasculaire chronique et ainsi prolonger la survie du greffon.

Caractérisation pharmacologique et moléculaire des dyskinésies tardives chez un modèle de primate non humain

Les dyskinésies tardives (DT) sont des troubles moteurs associés à l’utilisation chronique des antagonistes des récepteurs dopaminergiques D2 tels que les antipsychotiques et le métoclopramide. Ces dyskinésies correspondent à une incoordination motrice portant préférentiellement sur la musculature oro-faciale. La gestion des DT s'est imposée comme défi de santé publique surtout en l’absence d’une alternative thérapeutique efficace et abordable. L’hypothèse classiquement avancée pour expliquer la physiopathologie des DT inhérente au traitement par les antipsychotiques s’articule autour de l’hypersensibilité des récepteurs dopaminergiques D2, cibles principales de ces molécules. Néanmoins, plusieurs données remettent la véracité de cette hypothèse en question. Hypothèse: nous proposons que le blocage chronique des récepteurs dopaminergiques soit effectivement responsable d’un phénomène d’hypersensibilisation mais contrairement à l’hypothèse classique, cette hypersensibilisation porterait sur des paramètres de la transmission dopaminergique autres que les récepteurs D2. De même nous postulons que cette hypersensibilisation se traduirait par des altérations des cascades signalétiques au niveau des cellules du striatum. Ces altérations aboutissent à des changements portant sur le récepteur nucléaire (Nur77), qui est hautement associé au système dopaminergique; l’induction de ces récepteurs déclencherait des cascades associées à la compensation ou à la genèse des DT. Matériels et méthodes: 23 femelles Cebus apella, réparties en 3 groupes: groupe halopéridol, groupe clozapine, et groupe contrôle, ont été exposées aux traitements respectifs pendant 6-36 mois. Après l’analyse comportementale, les animaux ont été décapités et leurs cerveaux isolés pour fin d’analyse. Hybridation in situ: nous avons fait appel à cette technique pour mesurer l’expression de l’ARNm de Nur77 et du neuropeptide enképhaline. Hybridation in situ double: nous avons exploités cette technique pour identifier les populations neuronales exprimant les récepteurs dopaminergiques D3 et localiser leur éventuelle induction. Autoradiographies des récepteurs dopaminergiques D1, D2 et D3 et autoradiographies des récepteurs i glutamatergiques mGluR5. Ces autoradiographies avaient pour objectif d’évaluer l’expression de ces différents récepteurs. Mutagenèse dirigée et transfection cellulaire: nous faisons appel à ces techniques pour reproduire le polymorphisme identifié au niveau de la région 3’UTR de l’ARNm Nur77 et évaluer l’impact que pourrait avoir ce polymorphisme sur la stabilité de l’ARNm Nur77 sinon sur l’expression de la protèine Nur77. Western Blot des kinases ERK 1 et 2: cette technique nous a servi comme moyen pour quantifier l’expression globale de ces kinases. Analyses statistiques: l’expression de l’ARNm Nur77 a été évaluée en utilisant l’analyse de la variance à un seul facteur (One way ANOVA). Nous avons procédé de la même façon pour mesurer l’expression des récepteurs D2, D3 et mGluR5. Résultats: le groupe des animaux traités par l’halopéridol montre une plus forte expression des récepteurs D3 par rapport aux sujets des autres groupes. Cette expression se produit au niveau des neurones de la voie directe. De plus, cette augmentation corrèle positivement avec la sévérité des DT. L’expression des récepteurs D2 et mGluR5 reste relativement inchangée entre les différents groupes, alors qu’un gradient d’expression a été observé pour le récepteur D1. Par ailleurs, Nur77 est induit par l’halopéridol, alors que son expression semble baisser chez les animaux traités par la clozapine. L’induction de l’expression de Nur77 par l’halopéridol est plus accrue chez les animaux non dyskinétiques. Les animaux traités par la clozapine démontrent une expression amoindrie de l’ARNm de Nur77 qui tend à être plus faible que l’expression de base. D’autre part, la présence du polymorphisme au niveau de la région 3’UTR semble affecter l’expression cellulaire de Nur77. Conclusion: ces résultats confortent notre hypothèse concernant l’existence d’un phénomène d’hypersensibilisation prenant place suite un traitement chronique par les antipsychotiques. Ce phénomène s’est traduit par une augmentation de l’expression des récepteurs D3 sans porter sur les récepteurs D2 tel que prôné classiquement. Cette hypersensibilisation des récepteurs D3 implique également l’existence d’un débalancement des voies striatales pouvant ainsi sous tendre l’apparition des DT. Ces résultats dévoilent ainsi un nouveau mécanisme qui pourrait contribuer à l’apparition des DT et pourraient permettre une meilleure gestion, nous l’espérons, des DT à l’échelle clinique.

Les mécanismes de régulation du métabolisme lipidique par les peptides QRFP (pyroglutamylated RF-amide peptides)

Plusieurs cibles thérapeutiques dans le développement de médicaments contre l’obésité visent une diminution de l’appétit et de la masse adipeuse et à augmenter la dépense énergétique. L’appétit et le métabolisme énergétique sont régulés par certains neuropeptides qui agissent au niveau du système nerveux central, notamment dans l’hypothalamus. Parmi ces neuropeptides, les peptides RF-amide ou QRFP (pyroglutamylated RF-amide peptides), ainsi nommés par la présence du motif conservé Arg-Phe-NH2 dans le domaine C-terminal, induisent une hyperphagie et une augmentation de la masse adipeuse lorsqu’administrés par voie centrale. Les formes bioactives de ces peptides comprennent principalement 43 (QRFP-43) et 26 (QRFP-26) acides aminés. Outre les peptides QRFP, leurs récepteurs, les GPR103 de la famille des récepteurs à 7 passages transmembranaires couplés aux protéines G, sont exprimés dans l’hypothalamus. Plus récemment, des études ont montré la sécrétion de ces neuropeptides, et la présence du GPR103, dans le tissu adipeux. Cependant, le rôle de la voie signalétique (QRFP/GPR103) dans la régulation du métabolisme lipidique au niveau périphérique est peu connu. Les travaux de cette thèse ont porté sur la caractérisation des effets adipogéniques périphériques des neuropeptides QRFP. En premier lieu, nos travaux ont montré que les adipocytes 3T3-L1 et les adipocytes murins isolés des dépôts adipeux blancs expriment le prépro-QRFP et uniquement le récepteur GPR103B, un des deux sous-types de récepteurs présents chez la souris. De plus, nous avons montré que l’expression du récepteur est régulée par une diète riche en lipides réduisant l’expression du prépro-QRFP, mais augmentant celle du GPR103B dans les dépôts lipidiques. Chez l’humain, les adipocytes de l’omentum expriment autant le GPR103 que le prépro-QRFP. Nous avons de plus étudié la fonctionnalité du GPR103B dans les adipocytes 3T3-L1 par l’utilisation d’ARN interférents. Nous avons observé que ce récepteur médie les effets adipogéniques des QRFPs en augmentant l’expression du récepteur nucléaire PPAR-gamma (peroxisome proliferator-activated receptor gamma) et le facteur de transcription C/EBP-alpha (CCAAT-enhancer binding protein alpha) résultant en une accumulation des triglycérides. Nous avons aussi mis en évidence les effets anti-lipolytiques des QRFPs. En effet, les QRFP inhibent fortement la lipolyse induite avec l’isoprotérénol. L’étude des mécanismes moléculaires à l’origine des effets anti-lipolytiques du QRFP-43 a montré l’activation de la voie de signalisation PI3-K/PKB (phosphatidylinositol 3-kinase/protéine kinase B) en réponse à la stimulation du GPR103B. La réponse anti-lipolytique induite par le QRFP-43 est associée à une diminution de la phosphorylation de la périlipine A (PLIN1a) et de la lipase hormono-sensible (HSL). Nos études ont élucidé les mécanismes conduisant à l’inhibition de la phosphorylation de la PLIN1a en réponse à l’activation du GPR103B, impliquant l’inhibition de la migration de la cavéoline 1 et de la sous unité catalytique de la protéine kinase A (PKA) au niveau des gouttelettes lipidiques, ainsi que l’inhibition de l’activité des Src kinases et de la protéine kinase C (PKC). En conclusion, nos travaux ont montré que les QRFP-43 et -26 exercent un effet adipogénique et anti-lipolytique dans les adipocytes, mettant ainsi en évidence le rôle des neuropeptides QRFPs dans la régulation du métabolisme lipidique au niveau adipocytaire.

L'expression de nestine est associée à l'entrée des cardiomyocytes de rats néonataux dans le cycle cellulaire.

L’infarctus du myocarde est une des conséquences possibles de l’ischémie cardiaque; il se traduit par la mort des cardiomyocytes se situant en aval du blocus coronaire, puis par la formation d’une cicatrice formée essentiellement de dépôts de matrices extracellulaires sécrétées par les myofibroblastes. Nestine est une protéine filamenteuse intermédiaire de classe VI couramment associée à la prolifération et à la migration cellulaire. Chez l’homme et les rongeurs, à la suite d’un infarctus du myocarde, une sous-population de cardiomyocytes localisée à la zone infarcie/péri-infarcie exprimait la forme striée de nestine. Le but principal de cette étude était de déterminer la source cellulaire des cardiomyocytes nestine (+) observée dans le cœur infarci ainsi que le mécanisme de signalisation cellulaire sous-jacent impliqué dans l’expression de nestine. L’utilisation de souris transgénique a révélé que l’augmentation des cardiomyocytes nestine (+) dans le cœur infarci des souris n’était pas attribuable à la différenciation de cellules souches/progénitrices nestine (+) en cardiomyocytes nestine (+). Le traitement des cardiomyocytes ventriculaires de rats néonataux avec l’activateur des protéines kinases C PDBu et l’inhibition concomitante des voies p38 MAPK a mené à l’augmentation du nombre de ces cellules exprimant nestine. De plus, une population importante de cardiomyocytes ventriculaires de rats néonataux a incorporé la bromodéxoxyuridine, signe d’une capacité à réentrer dans le cycle cellulaire et à synthétiser de l’ADN. Sur la base de ces observations, l’apparition de cardiomyocytes nestine (+) dans le cœur infarci des rongeurs et des hommes pourrait possiblement refléter une sous-population de cardiomyocytes en prolifération tentant de régénérer le cœur infarci.

Implications physiopathologiques de la Nestine lors du remodelage pulmonaire et cardiaque à la suite de l’infarctus du myocarde, du diabète et de l’hypertension pulmonaire

Il est reconnu que la protéine filamenteuse intermédiaire Nestine est exprimée lors du processus de cicatrisation et du remodelage fibrotique. De plus, nous avons identifié l’expression de la Nestine au sein de deux populations distinctes qui sont directement impliquées dans les réponses de fibroses réparative et réactive. Ainsi, une population de cellules souches neurales progénitrices résidentes du coeur de rat adulte exprime la Nestine et a été identifiée à titre de substrat de l’angiogenèse et de la neurogenèse cardiaque. Également, la Nestine est exprimée par les myofibroblastes cicatriciels cardiaques et il a été établi que la protéine filamenteuse intermédiaire joue un rôle dans la prolifération de ces cellules. Ainsi, l’objectif général de cette thèse était de mieux comprendre les évènements cellulaires impliqués dans la réponse neurogénique des cellules souches neurales progénitrices résidentes cardiaques Nestine(+) (CSNPRCN(+)) lors de la fibrose réparative cardiaque et d’explorer si l’apparition de fibroblastes Nestine(+) est associée avec la réponse de fibrose réactive secondaire du remodelage pulmonaire. Une première publication nous a permis d’établir qu’il existe une régulation à la hausse de l’expression de la GAP43 (growth associated protein 43) et que cet événement transitoire précède l’acquisition d’un phénotype neuronal par les CSNPRCN(+) lors du processus de cicatrisation cardiaque chez le rat ayant subi un infarctus du myocarde. De plus, la surimposition de la condition diabétique de type 1, via l’injection unique de Streptozotocine chez le rat, abolit la réponse neurogénique des CSNPRCN(+), qui est normalement induite à la suite de l’ischémie cardiaque ou de l’administration de 6-hydroxydopamine. Le second article a démontré que le développement aigu de la fibrose pulmonaire secondaire de l’infarctus du myocarde chez le rat est associé avec une augmentation de l’expression protéique de la Nestine et de l’apparition de myofibroblastes pulmonaires Nestine(+). Également, le traitement de fibroblastes pulmonaires avec des facteurs de croissances peptidiques pro-fibrotiques a augmenté l’expression de la Nestine par ces cellules. Enfin, le développement initial de la condition diabétique de type 1 chez le rat est associé avec une absence de fibrose réactive pulmonaire et à une réduction significative des niveaux protéiques et d’ARN messager de la Nestine pulmonaire. Finalement, la troisième étude représentait quant à elle un prolongement de la deuxième étude et a alors examiné le remodelage pulmonaire chronique chez un modèle établi d’hypertension pulmonaire. Ainsi, les poumons de rats adultes mâles soumis à l’hypoxie hypobarique durant 3 semaines présentent un remodelage vasculaire, une fibrose réactive et une augmentation des niveaux d’ARN messager et de la protéine Nestine. De plus, nos résultats ont démontré que la Nestine, plutôt que l’alpha-actine du muscle lisse, est un marqueur plus approprié des diverses populations de fibroblastes pulmonaires activés. Également, nos données suggèrent que les fibroblastes pulmonaires activés proviendraient en partie de fibroblastes résidents, ainsi que des processus de transition épithélio-mésenchymateuse et de transition endothélio-mésenchymateuse. Collectivement, ces études ont démontré que des populations distinctes de cellules Nestine(+) jouent un rôle majeur dans la fibrose réparative cardiaque et la fibrose réactive pulmonaire.