Étude de la fonction anti-apoptotique de la sous-unité R1 de la ribonucléotide réductase des virus de l’herpès simplex

L’élimination des cellules infectées par apoptose constitue un mécanisme de défense antivirale. Les virus de l’herpès simplex (HSV) de type 1 et 2 encodent des facteurs qui inhibent l’apoptose induite par la réponse antivirale. La sous-unité R1 de la ribonucléotide réductase d’HSV-2 (ICP10) possède une fonction anti-apoptotique qui protège les cellules épithéliales de l’apoptose induite par les récepteurs de mort en agissant en amont ou au niveau de l’activation de la procaspase-8. Puisqu’une infection avec un mutant HSV-1 déficient pour la R1 diminue la résistance des cellules infectées vis à vis du TNFα, il a été suggéré que la R1 d’HSV-1 (ICP6) pourrait posséder une fonction anti-apoptotique. Le but principal de cette thèse est d’étudier le mécanisme et le potentiel de la fonction anti-apoptotique de la R1 d’HSV-1 et de la R1 d'HSV-2. Dans une première étude, nous avons investigué le mécanisme de la fonction anti-apoptotique de la R1 d’HSV en utilisant le TNFα et le FasL, deux inducteurs des récepteurs de mort impliqués dans la réponse immune anti-HSV. Cette étude a permis d’obtenir trois principaux résultats concernant la fonction anti-apoptotique de la R1 d’HSV. Premièrement, la R1 d’HSV-1 inhibe l’apoptose induite par le TNFα et par le FasL aussi efficacement que la R1 d’HSV-2. Deuxièmement, la R1 d’HSV-1 est essentielle à l’inhibition de l’apoptose induite par le FasL. Troisièmement, la R1 d’HSV interagit constitutivement avec la procaspase-8 d’une manière qui inhibe la dimérisation et donc l’activation de la caspase-8. Ces résultats suggèrent qu’en plus d’inhiber l’apoptose induite par les récepteurs de mort la R1 d’HSV peut prévenir l’activation de la caspase-8 induite par d’autres stimuli pro-apoptotiques. Les ARN double-brins (ARNdb) constituant un intermédiaire de la transcription du génome des HSV et activant l’apoptose par une voie dépendante de la caspase-8, nous avons testé dans une seconde étude l’impact de la R1 d’HSV sur l’apoptose induite par l’acide polyriboinosinique : polyribocytidylique (poly(I:C)), un analogue synthétique des ARNdb. Ces travaux ont montré qu’une infection avec les HSV protège les cellules épithéliales de l’apoptose induite par le poly(I:C). La R1 d’HSV-1 joue un rôle majeur dans l’inhibition de l’activation de la caspase-8 induite par le poly(I:C). La R1 d’HSV interagit non seulement avec la procaspase-8 mais aussi avec RIP1 (receptor interacting protein 1). En interagissant avec RIP1, la R1 d’HSV-2 inhibe l’interaction entre RIP1 et TRIF (Toll/interleukine-1 receptor-domain-containing adapter-inducing interferon β), l’adaptateur du Toll-like receptor 3 qui est un détecteur d’ARNdb , laquelle est essentielle pour signaler l’apoptose induite par le poly(I:C) extracellulaire et la surexpression de TRIF. Ces travaux démontrent la capacité de la R1 d’HSV à inhiber l’apoptose induite par divers stimuli et ils ont permis de déterminer le mécanisme de l’activité anti-apoptotique de la R1 d’HSV. Très tôt durant l’infection, cFLIP, un inhibiteur cellulaire de la caspase-8, est dégradé alors que la R1 d’HSV s’accumule de manière concomitante. En interagissant avec la procapsase-8 et RIP1, la R1 d’HSV se comporte comme un inhibiteur viral de l’activation de la procaspase-8 inhibant l’apoptose induite par les récepteurs de mort et les détecteurs aux ARNdb.

La dihydrofolate réductase R67, comme une cible d’antibiotiques et biocatalyseur potentiel

La dihyrofolate réductase de type II R67 (DHFR R67) est une enzyme bactérienne encodée par un plasmide donc aisément transmissible. Elle catalyse la réaction de réduction du dihydrofolate (DHF) en tétrahydrofolate (THFA) essentiel pour la prolifération cellulaire. La DHFR R67 est une enzyme qui dépend du cofacteur NADPH. La DHFR R67 est différente, structurellement et génétiquement, de l’enzyme DHFR chromosomale présente chez tous les organismes et elle est résistante au triméthoprime (TMP) qui est largement utilisé dans les traitements antibactériens chez l’Homme. Aucun inhibiteur sélectif contre la DHFR R67 n’est actuellement répertorié. Le but de cette étude a été d’identifier des molécules qui pourront inhiber la DHFR R67 sélectivement, sans affecter la DHFR humaine (DHFRh). La vérification de la qualité des essais enzymatiques en conditions déterminées pour le criblage d’inhibiteurs sur plusieurs lectrices à plaques a identifié des appareils appropriés pour l’analyse. L’étude de l’activité enzymatique de la DHFR R67 et de la DHFRh en présence des solvants organiques et liquides ioniques (LIs), comme des co-solvants pour le criblage rationnel d’inhibiteurs, a montré que certains LIs peuvent servir de milieu alternatif pour les essais enzymatiques. Le criblage rationnel basé sur l’approche du design d’un inhibiteur à partir de petites molécules, a révélé des molécules primaires qui inhibent la DHFR R67 de façon faible, mais sélective. Le test des composés biologiquement actifs qui comprennent des petits fragments, a montré l’augmentation de l’affinité entre la DHFR R67 et les composés testés. Trois composés ont été déterminés comme des inhibiteurs sélectifs prometteurs pour la DHFR R67.

Découverte d'inhibiteurs de la dihydrofolate réductase R67 impliquée dans la résistance au triméthoprime.

Le triméthoprime (TMP) est un antibiotique communément utilisé depuis les années 60. Le TMP est un inhibiteur de la dihydrofolate réductase (DHFR) bactérienne chromosomale. Cette enzyme est responsable de la réduction du dihydrofolate (DHF) en tétrahydrofolate (THF) chez les bactéries, qui lui, est essentiel à la synthèse des purines et ainsi, à la prolifération cellulaire. La résistance bactérienne au TMP est documentée depuis plus de 30 ans. Une des causes de cette résistance provient du fait que certaines souches bactériennes expriment une DHFR plasmidique, la DHFR R67. La DHFR R67 n'est pas affectée par le TMP, et peut ainsi remplacer la DHFR chromosomale lorsque celle-ci est inhibée par le TMP. À ce jour, aucun inhibiteur spécifique de la DHFR R67 est connu. En découvrant des inhibiteurs contre la DHFR R67, il serait possible de lever la résistance au TMP que la DHFR R67 confère aux bactéries. Afin de découvrir des inhibiteurs de DHFR R67, les approches de design à base de fragments et de criblage virtuel ont été choisies. L'approche de design à base de fragments a permis d'identifier sept composés simples et de faible poids moléculaire (fragments) inhibant faiblement la DHFR R67. À partir de ces fragments, des composés plus complexes et symétriques, inhibant la DHFR R67 dans l'ordre du micromolaire, ont été élaborés. Des études cinétiques ont montré que ces inhibiteurs sont compétitifs et qu'au moins deux molécules se lient simultanément dans le site actif de la DHFR R67. L'étude d'analogues des inhibiteurs micromolaires de la DHFR R67 a permis de déterminer que la présence de groupements carboxylate, benzimidazole et que la longueur des molécules influencent la puissance des inhibiteurs. Une étude par arrimage moléculaire, appuyée par les résultats in vitro, a permis d'élaborer un modèle qui suggère que les résidus Lys32, Gln67 et Ile68 seraient impliqués dans la liaison avec les inhibiteurs. Le criblage virtuel de la librairie de 80 000 composés de Maybridge avec le logiciel Moldock, et les essais d'inhibition in vitro des meilleurs candidats, a permis d'identifier quatre inhibiteurs micromolaires appartenant à des familles distinctes des composés précédemment identifiés. Un second criblage virtuel, d'une banque de 6 millions de composés, a permis d'identifier trois inhibiteurs micromolaires toujours distincts. Ces résultats offrent la base à partir de laquelle il sera possible de développer iv des composés plus efficaces et possédant des propriétés phamacologiquement acceptables dans le but de développer un antibiotique pouvant lever la résistance au TMP conféré par la DHFR R67.

New insights into small molecules inhibitors and protein-protein interactions of VirB8 : a critical conserved component of the type IV secretion system.

Les systèmes bactériens de sécrétion de type IV (T4SS) sont constitués d’un ensemble de 8 à 12 protéines conservées. Ces dernières sont utilisées lors de la translocation de protéines, la translocation de complexes ADN-protéines mais aussi pour le transport de ces derniers au travers de la membrane cellulaire. Les T4SS, en tant que facteurs de virulence pour beaucoup de pathogènes comme Brucella suis, sont donc d’excellents modèles cibles pour le développement de médicaments d’antivirulence. Ces médicaments, en privant le pathogène de son facteur essentiel de virulence : le T4SS, constituent une alternative ou encore une amélioration des traitements antibiotiques utilisés actuellement. VirB8, un facteur d’assemblage conservé dans le T4SS, forme des dimères qui sont importants pour la fonction des T4SS dans ces pathogènes. De par ses interactions multiples, VirB8 est un excellent modèle pour l’analyse des facteurs d’assemblage mais aussi en tant que cible de médicaments qui empêcheraient son interaction avec d’autres protéines et qui, in fine, désarmeraient les bactéries en les privant de leur fonctions essentielles de virulence. À ce jour, nous savons qu’il existe un équilibre monomère-dimère et un processus d’homodimerization de VirB8 dont l’importance est vitale pour la fonctionnement biologique des T4SSs. En se basant sur des essais quantitatifs d’interaction, nous avons identifié (i) des sites potentiels d’interaction avec d’autres protéines VirB du T4SS mais aussi (ii) isolé des petites molécules inhibitrices afin de tester la fonction protéique de VirB8. Afin de déterminer les acides aminés importants pour l’hétérodimérization de VirB8 avec VirB10, nous avons effectué des expériences de mutagenèse aléatoire, de phage display et d’arrimage moléculaire in silico. Ces expériences ont démontré l’importance de trois acides aminés localisés sur le feuillet β : R160, S162, T164 et I165. Ces derniers seraient importants pour l’association de VirB8 avec VirB10 étant donné que leur mutagenèse entraine une diminution de la formation du complexe VirB8-VirB10. L’objectif actuel de notre projet de recherche est de pouvoir mieux comprendre mais aussi d’évaluer le rôle de VirB8 dans l’assemblage du T4SS. Grace à un méthode de criblage adaptée à partir de la structure de VirB8, nous avons pu identifié une petite molécule inhibitrice BAR-068, qui aurait un rôle prometteur dans l’inhibition du T4SS. Nous avons utilisé la spectroscopie par fluorescence, l’essai à deux hybrides, le cross-linking et la cristallographie afin de déterminer le mécanisme d'interaction existant entre VirB8 et BAR-068. Ces travaux pourraient permettre de nombreuses avancées, notamment en termes de compréhension des mécanismes d’inhibition du T4SS. Notre objectif ultime est de pouvoir caractériser la séquence d’évènements essentiels à l’assemblage et au fonctionnement du T4SS. De manière globale, notre projet de recherche permettrait de révéler les grands principes d’assemblage des protéines membranaires, les processus de sécrétion de protéines chez les bactéries mais aussi de proposer une nouvelle stratégie lors du développement de drogues antimicrobiennes.

Implicating the mechanisms of ADP-ribosylation factor activation in the resistance of invasive breast cancer cells to EGFR tyrosine kinase inhibitors

ADP-ribosylation factor-1 (ARF1) est une petite GTPase principalement connue pour son rôle dans la formation de vésicules au niveau de l’appareil de Golgi. Récemment, dans des cellules de cancer du sein, nous avons démontré qu’ARF1 est aussi un médiateur important de la signalisation du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) contrôlant la prolifération, la migration et l'invasion cellulaire. Cependant, le mécanisme par lequel l’EGFR active la GTPase ainsi que le rôle de cette dernière dans la régulation de la fonction du récepteur demeure inconnue. Dans cette thèse, nous avions comme objectifs de définir le mécanisme d'activation de ARF1 dans les cellules de cancer du sein hautement invasif et démontrer que l’activation de cette isoforme de ARF joue un rôle essentiel dans la résistance de ces cellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nos études démontrent que les protéines d’adaptatrices Grb2 et p66Shc jouent un rôle important dans l'activation de ARF1. Alors que Grb2 favorise le recrutement d’ARF1 à l'EGFR ainsi que l'activation de cette petite GTPase, p66Shc inhibe le recrutement du complexe Grb2-ARF1 au récepteur et donc contribue à limiter l’activation d’ARF1. De plus, nous démontrons que ARF1 favorise la résistance aux inhibiteurs des tyrosines kinases dans les cellules de cancer du sein hautement invasif. En effet, une diminution de l’expression de ARF1 a augmenté la sensibilité descellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nous montrons également que de hauts niveaux de ARF1 contribuent à la résistance des cellules à ces médicaments en améliorant la survie et les signaux prolifératifs à travers ERK1/2, Src et AKT, tout en bloquant les voies apoptotiques (p38MAPK et JNK). Enfin, nous mettons en évidence le rôle de la protéine ARF1 dans l’apoptose en réponse aux traitements des inhibiteurs de l’EGFR. Nos résultats indiquent que la dépletion d’ARF1 promeut la mort cellulaire induite par gefitinib, en augmentant l'expression de facteurs pro-apoptotiques (p66shc, Bax), en altérant le potentiel de la membrane mitochondriale et la libération du cytochrome C. Ensemble, nos résultats délimitent un nouveau mécanisme d'activation de ARF1 dans les cellules du cancer du sein hautement invasif et impliquent l’activité d’ARF1 comme un médiateur important de la résistance aux inhibiteurs EGFR.