Induction d’anticorps anti-idiotypiques contre les protéoglycanes de la matrice extracellulaire dans la réduction des lésions athérosclérotiques

L’athérosclérose est caractérisée par l’accumulation de lipoprotéines de basse densité (LDL) liées aux protéoglycanes de la paroi artérielle. Des anticorps chimériques (ch) qui se lient aux glycosaminoglycanes (GAG) ont été générés. L'hypothèse est que la vaccination avec le chP3R99, un anticorps chimérique mutant de l'hybridome P3, pouvait interférer avec la rétention des LDL par l’induction d’une cascade d’anticorps anti-idiotypiques dirigés contre les GAG. Des souris mâles déficientes en apolipoprotéine E ont été soumises à une diète hypercholestérolémique et ont reçu 5 injections sous-cutanées de 50 μg de vaccin chP3R99 ou de vaccin chP3S98 (un mutant de faible réactivité). Les injections ont été effectuées à chaque semaine ou aux 2 semaines. Au moment du sacrifice, l'aorte perfusée avec du PBS a été excisée et analysée après coloration au Oil Red-O. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de lésions sur la superficie totale de l'aorte. La réactivité contre le chP3R99, chP3S98, l’héparine, le sulfate de dermatane et de chondroïtine des sérums de souris immunisées a été mesurée par ELISA. De plus, la liaison de l'anticorps chP3R99 aux GAG dans la lésion d'athérosclérose a été observée par un appareil de visualisation in vivo.Nos résultats montrent que l’immunogénicité des anticorps chP3R99 est supérieure à celle des anticorps chP3S98 et que le sérum des souris immunisées avec le chP3R99 présente des anticorps anti-idiotypiques dirigés contre les GAG. Cet effet est associé à une réduction de 42 % (p < 0.01) du pourcentage de lésions athérosclérotiques chez les souris vaccinées. L'utilisation d’une immunisation active avec l’anticorps chP3R99 pourrait constituer une approche thérapeutique pour le traitement de l'athérosclérose.

Interpretation of the centromere epigenetic mark to maintain genome stability

Le centromère est la région chromosomique où le kinétochore s'assemble en mitose. Contrairement à certaines caractéristiques géniques, la séquence centromérique n'est ni conservée entre les espèces ni suffisante à la fonction centromérique. Il est donc bien accepté dans la littérature que le centromère est régulé épigénétiquement par une variante de l'histone H3, CENP-A. KNL-2, aussi connu sous le nom de M18BP1, ainsi que ces partenaires Mis18α et Mis18β sont des protéines essentielles pour l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères. Des évidences expérimentales démontrent que KNL-2, ayant un domaine de liaison à l'ADN nommé Myb, est la protéine la plus en amont pour l'incorporation de CENP-A aux centromères en phase G1. Par contre, sa fonction dans le processus d'incorporation de CENP-A aux centromères n'est pas bien comprise et ces partenaires de liaison ne sont pas tous connus. De nouveaux partenaires de liaison de KNL-2 ont été identifiés par des expériences d'immunoprécipitation suivies d'une analyse en spectrométrie de masse. Un rôle dans l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères a été attribué à MgcRacGAP, une des 60 protéines identifiées par l'essai. MgcRacGAP ainsi que les protéines ECT-2 (GEF) et la petite GTPase Cdc42 ont été démontrées comme étant requises pour la stabilité de CENP-A incorporé aux centromères. Ces différentes observations ont mené à l'identification d'une troisième étape au niveau moléculaire pour l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé en phase G1, celle de la stabilité de CENP-A nouvellement incorporé aux centromères. Cette étape est importante pour le maintien de l'identité centromérique à chaque division cellulaire. Pour caractériser la fonction de KNL-2 lors de l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères, une technique de microscopie à haute résolution couplée à une quantification d'image a été utilisée. Les résultats générés démontrent que le recrutement de KNL-2 au centromère est rapide, environ 5 minutes après la sortie de la mitose. De plus, la structure du domaine Myb de KNL-2 provenant du nématode C. elegans a été résolue par RMN et celle-ci démontre un motif hélice-tour-hélice, une structure connue pour les domaines de liaison à l'ADN de la famille Myb. De plus, les domaines humain (HsMyb) et C. elegans (CeMyb) Myb lient l'ADN in vitro, mais aucune séquence n'est reconnue spécifiquement par ces domaines. Cependant, il a été possible de démontrer que ces deux domaines lient préférentiellement la chromatine CENP-A-YFP comparativement à la chromatine H2B-GFP par un essai modifié de SIMPull sous le microscope TIRF. Donc, le domaine Myb de KNL-2 est suffisant pour reconnaître de façon spécifique la chromatine centromérique. Finalement, l'élément reconnu par les domaines Myb in vitro a potentiellement été identifié. En effet, il a été démontré que les domaines HsMyb et CeMyb lient l'ADN simple brin in vitro. De plus, les domaines HsMyb et CeMyb ne colocalisent pas avec CENP-A lorsqu'exprimés dans les cellules HeLa, mais plutôt avec les corps nucléaires PML, des structures nucléaires composées d'ARN. Donc, en liant potentiellement les transcrits centromériques, les domaines Myb de KNL-2 pourraient spécifier l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé uniquement aux régions centromériques.

Pro-inflammatory and angiogenic activities of VEGF and angiopoietins in murine sponge/Matrigel model

La dérégulation de la formation et l'intégrité des vaisseaux sanguins peut conduire à un état pathologique tel qu’observé dans de nombreuses maladies ischémiques telles que: la croissance de tumeur solide, l’arthrite rhumatoïde, le psoriasis, les rétinopathies et l'athérosclérose. Par conséquent, la possibilité de moduler l'angiogenèse régionale chez les patients souffrant d'ischémie est cliniquement pertinente. Un élément clé dans l'induction de l'angiogenèse pathologique est une inflammation qui précède et accompagne la formation des nouveaux vaisseaux. Ce phénomène est démontré par l'augmentation de la perméabilité vasculaire et le recrutement de monocytes/ macrophages et cellules polynucléaires (neutrophiles). En collaboration avec d'autres groupes, nous avons montré que différents facteurs de croissance tels que le facteur de croissance endothélial vasculaire et les angiopoïétines peuvent non seulement promouvoir l'angiogenèse mais aussi induire diverses étapes connexes au processus de la réaction inflammatoire, y compris la synthèse et la libération des médiateurs inflammatoires et la migration des neutrophiles. Les objectifs de notre étude étaient d'adresser si le vascular endothelial growth factor (VEGF) et les angiopoïétines (Ang1 et Ang2) sont capables de promouvoir la formation des nouveaux vaisseaux sanguins au fil du temps et d'identifier la présence de différentes cellules inflammatoires dans ce processus. Des éponges d'alcool polyvinylique stérilisées et imbibées de Matrigel appauvri en facteur de croissance (contenant PBS, VEGF, Ang1 ou Ang2 (200 ng/200 μl)) ont été insérées sous la peau de souris C57/Bl6 anesthésiées. Les éponges ont ensuite été retirées aux jours 4, 7, 14 ou 21 après la procédure pour des analyses histologiques, immunohistologiques et cytométriques. La formation des nouveaux vaisseaux a été validée par la coloration au Trichrome de Masson et des analyses histologiques et immunohistologiques contre les cellules endothéliales (anti-CD31). De plus, la maturation des vaisseaux a été démontrée par la coloration séquentielle contre les cellules endothéliales (anti-CD31) et musculaires lisses (anti-alpha-actine). Nous avons effectué la même procédure pour caractériser le recrutement de neutrophiles (anti-MPO), et de macrophages (anti-F4/80). Afin de mieux délimiter la présence de différents sous-ensembles de leucocytes recrutés dans les éponges, nous avons utilisé une technique de cytométrie en flux sur des préparations de cellules isolées à partir de ces éponges. Nous avons observé que le VEGF et les angiopoïétines favorisent le recrutement de cellules endothéliales et la formation de nouveaux vaisseaux plus rapidement qu’en présence de PBS. Une fois formé au jour 7, ces nouveaux vaisseaux restent stables en nombre, et ne subissent pas une réorganisation importante de leur surface. Ces vaisseaux maturent grâce au recrutement et au recouvrement par les cellules musculaires lisses des néovaisseaux. En outre, le microenvironnement angiogénique est composé de cellules inflammatoires, principalement de neutrophiles, macrophages et quelques cellules de type B et T. Donc, le VEGF, l’Ang1 et l’Ang2 induisent séparément la formation et la stabilisation de nouveaux vaisseaux sanguins, ainsi que le recrutement de cellules inflammatoires avec des puissances différentes et une action temps-dépendante dans un modèle d’éponge/Matrigel.

Uncovering the role of misfolded SOD1 in the pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis

La sclérose latérale amyothrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative charactérisée par la perte des neurones moteurs menant à la paralysie et à la mort. Environ 20% des cas familiaux de la SLA sont causés par des mutations de la superoxyde dismutase 1 (SOD1), conduisant vers un mauvais repliement de la protéine SOD1, ce qui a comme conséquence un gain de fonction toxique. Plusieurs anticorps spécifiques pour la forme mal repliée de la protéine ont été générés et utilisés comme agent thérapeutique dans des modèles précliniques. Comment le mauvais repliement de SOD1 provoque la perte sélective des neurones moteurs demeure non résolu. La morphologie, le bilan énergétique et le transport mitochondrial sont tous documentés dans les modèles de la SLA basés sur SOD1, la détérioration des mitochondries joue un rôle clé dans la dégénération des neurones moteurs. De plus, la protéine SOD1 mal repliée s’associe sélectivement sur la surface des mitochondries de la moelle épinière chez les modèles de rongeurs de la SLA. Notre hypothèse est que l’accumulation de la protéine SOD1 mal repliée sur les mitochondries pourrait nuire aux fonctions mitochondriales. À cette fin, nous avons développé un nouvel essai par cytométrie de flux afin d’isoler les mitochondries immunomarquées avec des anticorps spécifiques à la forme malrepliée de SOD1 tout en évaluant des aspects de la fonction mitochondriale. Cette méthode permettra de comparer les mitochondries portant la protéine SOD1 mal repliée à celles qui ne la portent pas. Nous avons utilisé un anticorps à conformation spécifique de SOD1, B8H10, pour démontrer que la protéine mal repliée SOD1 s’associe avec les mitochondries de la moelle épinière des rat SOD1G93A d’une manière dépendante du temps. Les mitochondries avec la protéine mal repliée SOD1 B8H10 associée à leur surface (B8H10+) ont un volume et une production excessive de superoxyde significativement plus grand, mais possèdent un potentiel transmembranaire comparable aux mitochondries B8H10-. En outre, la présence de la protéine mal repliée SOD1 reconnue par B8H10 coïncide avec des niveaux plus élevés de la forme pro-apoptotique de Bcl-2. L’immunofluorescence de sections de moelle épinière du niveau lombaire avec l’anticorps spécifique à la conformation B8H10 et AMF7-63, un autre anticorps conformationnel spécifique de SOD1, démontre des motifs de localisations distincts. B8H10 a été trouvé principalement dans les neurones moteurs et dans plusieurs points lacrymaux dans tout le neuropile. Inversement, AMF7-63 a marqué les neurones moteurs ainsi qu’un réseau fibrillaire distinctif concentré dans la corne antérieure. Au niveau subcellulaire, SOD1 possèdant la conformation reconnu par AMF7-63 est aussi localisée sur la surface des mitochondries de la moelle épinière d’une manière dépendante du temps. Les mitochondries AMF7-63+ ont une augmentation du volume comparé aux mitochondries B8H10+ et à la sous-population non marquée. Cependant, elles produisent une quantité similaire de superoxyde. Ensemble, ces données suggèrent qu’il y a plusieurs types de protéines SOD1 mal repliées qui convergent vers les mitochondries et causent des dommages. De plus, différentes conformations de SOD1 apportent une toxicité variable vers les mitochondries. Les protéines SOD1 mal repliées réagissant à B8H10 et AMF7-63 sont présentes en agrégats dans les fractions mitochondriales, nous ne pouvons donc pas prendre en compte leurs différents effets sur le volume mitochondrial. Les anticorps conformationnels sont des outils précieux pour identifier et caractériser le continuum du mauvais repliement de SOD1 en ce qui concerne les caractéristiques biochimiques et la toxicité. Les informations présentes dans cette thèse seront utilisées pour déterminer le potentiel thérapeutique de ces anticorps.

Évaluation de l’ototoxicité secondaire au bleu de méthylène chez le cochon d’Inde : étude animale prospective

INTRODUCTION: Le bleu de méthylène est un colorant grandement utilisé dans le domaine médical, notamment pour ses propriétés de coloration histologique. Il est également utilisé comme agent photosensibilisant dans la thérapie photodynamique antimicrobienne, qui une fois photoactivé devient efficace pour l’éradication de plusieurs germes multirésistants. L’objectif de cette étude est d’investiguer le potentiel ototoxique du bleu de méthylène. MÉTHODES: Vingt cochons d’Inde divisés en deux groupes, ont reçu une solution de bleu de méthylène et de gentamicine dans l’oreille testée. L’oreille controlatérale a reçu une solution saline contrôle. Nous avons procédés à des potentiels évoqués auditifs du tronc cérébral avant et une semaine suivant la série d’injections. À la suite des dissections, des analyses histologiques et immunohistochimiques ont été réalisées. RÉSULTATS: La différence moyenne de perte auditive dans le groupe gentamicine comparativement au groupe normal salin était de 66.25 dB (p<0.001). Toutefois, la différence moyenne de perte auditive dans le groupe ayant reçu du bleu de méthylène comparativement à celui ayant reçu des injections de la solution saline était de 1.50 dB, et n’a pas été démontré comme étant statistiquement significative (p=0.688). De plus, la captation de caspase-3 en immunohistochimie (marqueur d’apoptose) n’a pas été significative dans le groupe recevant le bleu de méthylène. CONCLUSION: À la lumière de nos résultats, les injections intratympaniques de bleu de méthylène n’ont pas démontrées de potentiel ototoxique. Nous recommandons des études supplémentaires afin d’en préciser son utilisation sécuritaire dans le domaine otologique.

Les cellules endothéliales peuvent acquérir un phénotype mésenchymateux associé avec l’expression de la protéine nestine dans un modèle d’hypertrophie cardiaque et de fibrose réactive

L’hypertrophie cardiaque représente la réponse primaire du cœur dans le but d’améliorer la fonction cardiaque qui est compromise suite à un accident ischémique ou une surcharge hémodynamique. Cependant, l’hypertrophie cardiaque a pour conséquence pathologique la fibrose réactive, qui est caractérisée par la synthèse incontrôlée et le dépôt du collagène par les myofibroblastes. Ainsi, l’accumulation accrue du collagène dans le cœur hypertrophié mène à l’augmentation de la rigidité cardiaque et la détérioration progressive de la fonction contractile du cœur. Plusieurs études ont démontré que la protéine nestine, appartenant à la famille des filaments intermédiaires, est ré-exprimée dans les myofibroblastes durant la fibrose réparative et est impliquée dans la prolifération cellulaire. Basée sur ces observations, cette étude teste l’hypothèse selon laquelle nestine est induite dans les myofibroblastes suivant le développement de la fibrose réactive dans le cœur des rats ayant subi une constriction aortique supra-rénale. Deux semaines suivant une constriction aortique supra-rénale chez le rat, un patron d’hypertrophie concentrique cardiaque a été observé et associé avec une réponse de fibrose réactive caractérisée par le dépôt accru de collagène dans le tissu interstitiel et la région péri-vasculaire de nombreux vaisseaux sanguins cardiaques. De plus, les niveaux de la protéine nestine sont augmentés significativement dans les cœurs des rats hypertrophiés, et ce, de façon corrélative avec la pression artérielle moyenne et la pression systolique du ventricule gauche. Les techniques d’immunofluorescences ont révélé une apparition accrue des cellules immunoréactives à nestine, qui présentent un phénotype mésenchymateux caractérisé par la co-expression de collagène dans le tissu interstitiel et la région péri-vasculaire des cœurs hypertrophiés. Ces données suggèrent que les fibroblastes résidents peuvent exprimer la protéine nestine ou que l’expression de nestine est induite en réponse aux facteurs pro-fibrotiques impliqués dans la fibrose réactive. En effet, l’exposition des myofibroblastes normaux et des myofibroblastes isolés des cœurs hypertrophiés à l’AII, TGF-B1 et EGF augmente significativement l’expression de la protéine nestine, tandis que l’expression de l’α-SMA demeure inchangée. De plus, de manière prédominante dans le cœur hypertrophié, des cellules non-vasculaires CD31(+) ont été détectées dans le tissu interstitiel et la région péri-vasculaire. Ces cellules co-expriment nestine et collagène suggérant une transition des cellules endothéliales vers un phénotype mésenchymateux. Finalement, la protéine nestine, sous sa forme filamenteuse, a été détectée dans les cellules endothéliales de l’artère coronaire humaine et leur exposition au TGF-B1, induit l’expression de collagène. En revanche, l’expression de collagène a été détectée dans les cellules microvasculaires de rats CD31(+), alors que l’expression de nestine est absente. En réponse aux traitements de TGF-B1 et EGF, l’expression de nestine, sous sa forme non-filamenteuse, est détectée dans les cellules microvasculaires de rats. Collectivement, ces données supportent la prémisse selon laquelle la réponse de fibrose réactive dans les cœurs hypertrophiés, suite à une constriction aortique supra-rénale, est attribuée en partie à l’augmentation de l’apparition des cellules mésenchymateuses positives à l’expression de nestine qui proviennent des fibroblastes résidents du ventricule. De plus, les données in vivo et in vitro suggèrent que les cellules endothéliales déplacées représentent une source additionnelle des cellules mésenchymateuses nestine(+) dans le cœur hypertrophié et contribuent au développement de la fibrose réactive. Cibler la protéine nestine peut représenter une approche thérapeutique afin d’atténuer la réponse de fibrose réactive indépendamment de l’origine des cellules mésenchymateuses.

La jeunesse comme enjeu politique au cinéma états-unien contemporain : pour une polis audiovisuelle

Cette recherche s’intéresse aux propriétés politiques du médium audiovisuel, et plus spécifiquement de la pratique cinématographique, devant un problème concret : la marginalisation de la jeunesse dans la société américaine contemporaine, symptomatique d’une perte d’espoir en l’avenir. Guidé par la théorie politique de Hannah Arendt, l’argumentaire consiste d’abord en deux analyses filmiques : une première de Kids (1995), réalisé par Larry Clark, porte sur l’invisibilité sociale de la jeunesse et la faculté du médium audiovisuel à confronter le spectateur. La seconde se penche sur le pouvoir systématisé auquel sont soumis les jeunes dans une institution scolaire bureaucratique, tel qu’il est mis en scène dans Elephant (2003) de Gus Van Sant, et interroge la capacité du médium à susciter la pensée chez le spectateur. Dans un troisième temps, une réflexion plus globale sur la situation actuelle de la culture cinématographique au sein du domaine audiovisuel dominé par le divertissement de masse explore la possibilité d’une polis audiovisuelle. Cette troisième et dernière partie reprend les thèmes soulevés dans les précédentes dans une perspective politique basée directement sur la pensée d’Arendt : ils donnent lieu aux questions de l’apparaître et de la durabilité du monde, qui sont les principales fonction de la polis, ainsi qu’à la question du rôle du spectateur.

Identification des résidus essentiels à l’interaction du récepteur CXCR7 avec ses ligands SDF-1 et ITAC

Les chimiokines sont des petites protéines secrétées dont la fonction principale est la stimulation de la migration de cellules immunitaires vers différents organes et tissus. Elles sont souvent impliquées lors des maladies inflammatoires, auto-immunes et des cancers. Ainsi, les chimiokines et leurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont la cible pharmacologique de plusieurs molécules, actuellement testées en essais cliniques. Nous avons pris comme modèle, lors de notre étude, le récepteur atypique CXCR7. Ce récepteur est dit atypique, car il ne signalise pas via la voie classique des protéines G, mais plutôt via la voie de la β-arrestine. CXCR7 est impliqué dans de nombreux cancers, favorise la progression métastatique et est un co-récepteur pour le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Cependant, aucune donnée sur son mode de liaison avec ses ligands CXCL11/ITAC et CXCL12/SDF-1 n’existe à date. Nous pensons que cette information est essentielle pour le développement efficace d’agonistes et d’antagonistes, et nous nous sommes intéressés à identifier les résidus essentiels à la liaison des deux ligands de CXCR7 et à son activation par ces derniers. Pour cela, nous avons créé une série de mutants par substitution ou délétion d’acides aminés de la partie N-terminale, des boucles extracellulaires et des domaines transmembranaires du récepteur. Nous avons testé leur marquage en surface cellulaire par cytométrie en flux, leur liaison des deux ligands par expériences de radio-liaison, et leur capacité à recruter la β-arrestine en réponse aux ligands par essais BRET. Les résultats obtenus ont permis d’identifier des résidus importants à l’interaction des systèmes CXCR7/SDF-1 et CXCR7-ITAC et suggèrent des modes de liaison à CXCR7 différents entre ITAC et SDF-1. Tout comme la liaison d’ITAC à son autre récepteur CXCR3, sa liaison à CXCR7 suivrait le mode conventionnel de liaison en deux étapes des récepteurs de chimiokines. Cependant, la liaison de SDF-1 à CXCR7 suivrait un autre mode de liaison, contrairement à sa liaison à son autre récepteur, CXCR4.

Étude du potentiel cytotoxique des nanotubes de carbone simple-paroi chez les cellules épithéliales alvéolaires humaines A549

Il existe un grand intérêt pour le développement et les applications des nanotubes de carbone (NTC) car ils ont un énorme potentiel dans diverses applications industrielles. Cependant, leur dimension nanométrique et leur composition chimique peuvent constituer un risque sur la santé humaine. Les mécanismes responsables de la toxicité des NTC restent encore à définir. L’objectif de ce projet était de déterminer la toxicité potentielle de deux types de nanotubes de carbone simple-paroi (NTCSP): RN 000 et RN 003 chez une lignée cellulaire de pneumocytes de type II, les cellules A549. Méthodologie: Les essais MTS et PrestoBlue®, le test d’exclusion au bleu de trypan, la coloration HT-IP et l’Apoptotic Blebs ont été utilisés pour déterminer la toxicité potentielle de ces NTCSP. Résultats: Suite à une exposition de courte durée (24h), l’essai MTS a montré une diminution de la viabilité cellulaire significative de 20% pour [NTCSP] à 50 et 100 µg/ml et 74% pour [NTCSP] à 1000 µg/mL. Le PrestoBlue® a indiqué une mortalité cellulaire d’environ 45% et de 85% pour des concentration de 500 et 1000 µg/ml de NTCSP. Cependant, les données de l’essai d’exclusion du bleu de trypan ont montré que les NTCSP n’altèrent pas la viabilité cellulaire. L’absence d’une altération de la viabilité cellulaire a été confirmée avec la coloration HT-IP et l’Apoptotic Blebs. Cependant, l’interaction des NTCSP avec les cellules A549 a induit un changement de la morphologie cellulaire ; une diminution de la taille ainsi une augmentation de la structure interne des cellules A549. À une exposition à longue durée (72h), les données ont confirmé les résultats d’exposition à 24h. En effet, il n’y a de pas de mortalité cellulaire, mais une diminution de la prolifération cellulaire. En conclusion, notre étude indique que le RN 000 et le RN 003 interagissent avec les cellules A549 sans altérer leur viabilité, mais en induisant une dysfonction mitochondriale qui pourrait avoir plusieurs conséquences sur la fonction cellulaire.