Analyse du mécanisme de la dégradation du récepteur CD4 par la protéine Vpu du virus de l'immunodéficience humaine-1 (VIH-1)

Le VIH-1 a développé plusieurs mécanismes menant à la dégradation de son récepteur cellulaire, la molécule CD4, dans le but d’augmenter la relâche de particules virales infectieuses et d’éviter que la cellule soit surinfectée. L’un de ces mécanismes est la dégradation, induite par la protéine virale Vpu, du CD4 nouvellement synthétisé au niveau du réticulum endoplasmique (RE). Vpu doit lier CD4 et recruter l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP, via sa liaison à β-TrCP, afin de dégrader CD4. Puisque CD4 doit être retenu au RE pour permettre à Vpu d’induire sa dégradation via le système ubiquitine-protéasome, il a été suggéré que ce processus implique un mécanisme semblable à une voie cellulaire de dégradation des protéines mal-repliées appelée ERAD (« endoplasmic reticulum-associated degradation »). La dégradation par ERAD implique généralement la dislocation des protéines du RE vers le cytoplasme afin de permettre leur poly-ubiquitination et leur dégradation par le protéasome. Nous avons démontré que Vpu induit la poly-ubiquitination de CD4 dans des cellules humaines. Nos résultats suggèrent aussi que CD4 doit subir une dislocation afin d’être dégradé par le protéasome en présence de Vpu. De plus, un mutant transdominant négatif de l’ATPase p97, qui est impliquée dans la dislocation des substrats ERAD, inhibe complètement la dégradation de CD4 par Vpu. Enfin, nos résultats ont montré que l’ubiquitination sur des résidus accepteurs de l’ubiquitine (lysines) de la queue cytoplasmique de CD4 n’était pas essentielle, mais que la mutation des lysines ralentit le processus de dégradation de CD4. Ce résultat suggère que l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 pourrait représenter un événement important dans le processus de dégradation induit par Vpu. L’attachement de l’ubiquitine a généralement lieu sur les lysines de la protéine ciblée. Toutefois, l’ubiquitination sur des résidus non-lysine (sérine, thréonine et cystéine) a aussi été démontrée. Nous avons démontré que la mutation de tous les sites potentiels d’ubiquitination cytoplasmiques de CD4 (K, C, S et T) inhibe la dégradation par Vpu. De plus, la présence de cystéines dans la queue cytoplasmique apparaît suffisante pour rendre CD4 sensible à Vpu en absence de lysine, sérine et thréonine. Afin d’expliquer ces résultats, nous proposons un modèle dans lequel l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 serait nécessaire à sa dégradation et où les sites d’ubiquitination de CD4 seraient sélectionnés de façon non spécifique par l’ubiquitine ligase recrutée par Vpu. Enfin, nous avons observé que la co-expression d’une protéine Vpu incapable de recruter β-TrCP (Vpu S52,56/D) semble stabiliser le CD4 qui est retenu au RE. De plus, d’autres mutants de Vpu qui semblent capables de recruter β-TrCP et CD4 sont toutefois incapables d’induire sa dégradation. Ces résultats suggèrent que l’association de Vpu à CD4 et β-TrCP est essentielle mais pas suffisante pour induire la dégradation de CD4. Par conséquent, ces résultats soulèvent la possibilité que Vpu puisse recruter d’autres facteurs cellulaires pour induire la dégradation de CD4. Les résultats présentés ont permis de mieux définir le mécanisme de dégradation de CD4 par Vpu dans des cellules humaines. De plus, ces résultats nous ont permis d’élaborer un modèle dans lequel l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP démontre de la flexibilité dans le choix des résidus à ubiquitiner afin d’induire la dégradation de CD4. Enfin, ces études jettent un oeil nouveau sur le rôle de Vpu dans ce processus puisque nos résultats suggèrent que Vpu doive recruter d’autres partenaires cellulaires, mis à part β-TrCP, pour induire la dégradation de CD4.

Le remodelage cardiaque lors de la gestation chez la rate : implication du récepteur aux minéralocorticoïdes et altérations par un supplément sodique

La grossesse induit de profonds changements hémodynamiques et métaboliques de l’organisme maternel qui ont des conséquences sur le cœur. L’adaptation du cœur à cette condition physiologique nécessite un remodelage de sa structure et par conséquent des ajustements de sa fonction. Les mécanismes responsables de ces adaptations sont en grande partie inconnus. Cependant, ces connaissances sont essentielles pour la compréhension des complications cardiovasculaires, telle que l’hypertension gestationnelle (HG), qui constituent un risque pour la santé de la mère et du fœtus. Afin de caractériser les adaptations du cœur lors de la grossesse, l’originalité de notre approche expérimentale consistait à étudier le remodelage à l’échelle des cardiomyocytes du ventricule gauche. Ainsi, notre premier objectif était de déterminer les modifications structurales et fonctionnelles des cardiomyocytes chez la rate en vue d’identifier les altérations lors de l’HG. Chez les rates gestantes, le remodelage structural des cardiomyocytes se caractérise par une hypertrophie cellulaire avec une augmentation proportionnelle des dimensions. L’HG a été induite par un supplément sodique (0.9% NaCl) dans la diète. L’inadaptation structurale lors de l’HG se traduit par une diminution du volume cellulaire. L’étude des modifications fonctionnelles a révélé que lors de la gestation le fonctionnement contractile des cellules est dépendant de l’adaptation du métabolisme maternel. En effet, les substrats énergétiques, lactate et pyruvate, induisent une augmentation de la contractilité des cardiomyocytes. Cet effet est plus faible dans les cellules des rates hypertendues, ce qui suggère des anomalies du couplage excitation-contraction, dans lequel les courants calciques de type L (ICa-L) jouent un rôle important. Paradoxalement, le lactate et le pyruvate ont induit une augmentation de la densité des courants ICa-L seulement chez les rates hypertendues. Le récepteur aux minéralocorticoïdes (RM) est connu pour son implication dans le remodelage structuro-fonctionnel du cœur dans les conditions pathologiques mais pas dans celui induit par la grossesse. Notre deuxième objectif était donc de déterminer le rôle du RM dans l’adaptation de la morphologie et de la contractilité des cardiomyocytes. Des rates gestantes ont été traitées avec le canrénoate de potassium (20 mg/kg/jr), un antagoniste des RM. L’inhibition des RM pendant la gestation empêche l’hypertrophie cellulaire. De plus, l’inhibition des RM bloque l’effet du lactate et du pyruvate sur la contractilité. Chez la femme, la grossesse est associée à des changements des propriétés électriques du cœur. Sur l’électrocardiogramme, l’intervalle QTc est plus long, témoignant de la prolongation de la repolarisation. Les mécanismes régulant cette adaptation restent encore inconnus. Ainsi, notre troisième objectif était de déterminer le rôle du RM dans l’adaptation de la repolarisation. Chez la rate gestante, l’intervalle QTc est prolongé ce qui est corroboré par la diminution des courants potassiques Ito et IK1. L’inhibition des RM pendant la gestation empêche la prolongation de l’intervalle QTc et la diminution des courants Ito. Les travaux exposés dans cette thèse apportent une vision plus précise du remodelage cardiaque induit par la grossesse, qui est permise par l’étude à l’échelle cellulaire. Nos résultats montrent que lors de la gestation et de l’HG les cardiomyocytes subissent des remodelages morphologiques contrastés. Notre étude a aussi révélé que lors de la gestation, la fonction contractile est tributaire des adaptations métaboliques et que cette relation est altérée lors de l’HG. Nos travaux montrent que la régulation de ces adaptations gestationnelles fait intervenir le RM au niveau de la morphologie, de la relation métabolisme/fonctionnement contractile et de la repolarisation. En faisant avancer les connaissances sur l’hypertrophie de la grossesse, ces travaux vont permettre d’améliorer la compréhension des complications cardiovasculaires gestationnelles.

Étude de la pharmacologie de ligands du récepteur EP4 de prostaglandine E2

La prostaglandine E2 est une hormone lipidique produite abondamment dans le corps, incluant dans le rein où elle agit localement pour réguler les fonctions rénales. Un couplage à la protéine Gαs menant à une production d’AMPc a classiquement été attribué au récepteur EP4 de PGE2. La signalisation d’EP4 s’est cependant avérée plus complexe et implique aussi un couplage aux protéines sensibles à la PTX Gαi et des effets reliés aux β-arrestines. Il y a maintenant plusieurs exemples de l’activation sélective de voies de signalisation indépendantes par des ligands des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), et ce concept désigné sélectivité fonctionnelle pourrait être exploité dans le développement de nouveaux médicaments plus spécifiques et efficaces. Dans une première étude, la puissance et l’activité intrinsèque d’une série de ligands d’EP4 pour l’activation de Gαs, Gαi et de la ß-arrestine ont été systématiquement déterminées relativement au ligand endogène PGE2. Dans ce but, trois essais de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) ont été adaptés pour évaluer les différentes voies dans des cellules vivantes. Nos résultats montrent une sélectivité fonctionnelle importante parmi les agonistes évalués et ont une implication pour l’utilisation d’analogues de la PGE2 dans un contexte expérimental et possiblement clinique, puisque leur spectre d’activité diffère de l’agoniste naturel. La méthodologie basée sur le BRET utilisée lors de cette première évaluation systématique d’une série d’agonistes d’EP4 devrait être applicable à l’étude d’autres RCPG. Dans une deuxième étude, des peptides reproduisant des régions juxtamembranaires extracellulaires du récepteur EP4 ont été conçus selon le raisonnement que des peptides ciblant des régions éloignées du site de liaison du ligand naturel ont le potentiel de ne moduler qu’une partie des activités du récepteur. L’insuffisance rénale aiguë est une complication médicale grave caractérisée par un déclin brusque et soutenu de la fonction rénale et pour laquelle il n’y a pas de traitement efficace à l’heure actuelle. Nos résultats montrent que le peptidomimétique dérivé d’EP4 optimisé (THG213.29) améliore significativement les fonctions rénales et les changements histologiques dans une insuffisance rénale aiguë induite par cisplatine ou par occlusion des artères rénales dans des rats Sprague-Dawley. Le THG213.29 ne compétitionnait pas la liaison de la PGE2 à EP4, mais modulait la cinétique de dissociation de la PGE2, suggérant une liaison à un site allostérique d’EP4. Le THG213.29 démontrait une sélectivité fonctionnelle, puisqu’il inhibait partiellement la production d’AMPc induite par EP4 mais n’affectait pas l’activation de Gαi ou le recrutement de la ß-arrestine. Nos résultats indiquent que le THG213.29 représente une nouvelle classe d’agent diurétique possédant les propriétés d’un modulateur allostérique non-compétitif des fonctions du récepteur EP4 pour l’amélioration des fonctions rénales suite à une insuffisance rénale aiguë.

Régulation de l'activité transcriptionnelle du récepteur nucléaire FXR par la ghréline et les modifications post-traductionnelles

Le récepteur X des farnésoïdes (FXR) fait partie de la superfamille des récepteurs nucléaires et agit comme un facteur de transcription suite à la liaison d’un ligand spécifique. Le récepteur FXR, activé par les acides biliaires, joue un rôle essentiel dans le métabolisme des lipides et du glucose en plus de réguler l’homéostasie des acides biliaires. Notre laboratoire a récemment mis en évidence une nouvelle voie de régulation du récepteur PPARγ en réponse au récepteur de la ghréline. En effet, la ghréline induit l’activation transcriptionnelle de PPARγ via une cascade de signalisation impliquant les kinases Erk1/2 et Akt, supportant un rôle périphérique de la ghréline dans les pathologies associées au syndrome métabolique. Il est de plus en plus reconnu que la cascade métabolique impliquant PPARγ fait également intervenir un autre récepteur nucléaire, FXR. Dans ce travail, nous montrons que la ghréline induit l’activation transcriptionnelle de FXR de manière dose-dépendante et induit également la phosphorylation du récepteur sur ses résidus sérine. En utilisant des constructions tronquées ABC et CDEF de FXR, nous avons démontré que la ghréline régule l’activité de FXR via les domaines d’activation AF-1 et AF-2. L’effet de la ghréline et du ligand sélectif GW4064 sur l’induction de FXR est additif. De plus, nous avons démontré que FXR est la cible d’une autre modification post-traductionnelle, soit la sumoylation. En effet, FXR est un substrat cellulaire des protéines SUMO-1 et SUMO-3 et la sumoylation du récepteur est ligand-indépendante. SUMO-1 et SUMO-3 induisent l’activation transcriptionnelle de FXR de façon dose-dépendante. Nos résultats indiquent que la lysine 122 est le site prédominant de sumoylation par SUMO-1, quoiqu’un mécanisme de coopération semble exister entre les différents sites de sumoylation de FXR. Avec son rôle émergeant dans plusieurs voies du métabolisme lipidique, l’identification de modulateurs de FXR s’avère être une approche fort prometteuse pour faire face à plusieurs pathologies associées au syndrome métabolique et au diabète de type 2.

Rôle et localisation intraspinale du récepteur B1 des kinines dans la douleur neuropathique

Le récepteur B1 des kinines (RB1) joue un rôle important dans l'inflammation et la nociception. Les sites de liaison du RB1 sont augmentés dans la moelle épinière et le ganglion de la racine dorsale (GRD) chez le rat après la ligature partielle du nerf sciatique (LPNS). Dans ce modèle classique de douleur neuropathique, le traitement aigu avec des antagonistes sélectifs du RB1 renverse l'hyperalgésie thermique mais non pas l’allodynie. Cette étude vise à définir dans ce modèle de LPNS: 1- les effets de traitements aigu et chronique avec des antagonistes du RB1 sur l’hyperalgésie thermique et les allodynies tactile et au froid; 2- la contribution du TRPV1 et du stress oxydatif dans la composante de la douleur neuropathique associée au RB1; 3- l’expression du RB1 au niveau de la moelle épinière lombaire, le GRD et le nerf sciatique par RT-PCR quantitatif (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction); 4- la localisation cellulaire du RB1 dans la moelle épinière lombaire par microscopie confocale. L’hyperalgésie thermique et les allodynies tactile et au froid ont été mesurées par le réflexe de retrait de la patte arrière après l’application à la surface plantaire d’une source radiante de chaleur (méthode Hargreaves), de filaments de Von Frey et d’une goutte d’acétone qui produit une sensation de froid par évaporation. Nous avons montré, dans un premier temps, que l'hyperalgésie thermique et les allodynies tactile et au froid sont renversées par un traitement chronique avec l’antagoniste du RB1, SSR240612, administré par gavage à raison de 10 mg /kg/jr entre le 15 e et le 20 e jour après la ligature du nerf sciatique et par un traitement antioxydant, la N-acétyl-L-cystéine, administrée par gavage à la dose de 1g/kg/jr, 4jours précédant la ligature et pendant les 2 semaines après la ligature. Un traitement aigu avec le ii SSR240612 (10 mg/kg) ou avec un antagoniste du RB1 qui ne traverse pas la barrière hémato-encéphalique, le R-954 (2mg/kg, s.c.), n’a bloqué que l’hyperalgésie thermique. Dans un second temps, l’antagoniste du TRPV1, le SB366791, administré à raison de 1 mg/kg/jr par voie sous-cutanée du j-1 au j-14 a renversé l’allodynie tactile et l’hyperalgésie thermique. De plus, nous avons noté deux semaines après la LPNS, des augmentations significatives des niveaux d'ARNm du RB1 dans la moelle épinière lombaire, le nerf sciatique et le GRD du côté ipsilatéral à la ligature. Ces augmentations ont été renversées par le traitement avec la N-acétyl-L-cystéine et l’antagoniste du TRPV1. Le RB1 a été localisé au niveau des fibres de type C avec le marquage au CGRP (Calcitonin Gene-Related Peptide) et au niveau de la microglie utilisant le marquage au Iba-1 dans la moelle épinière lombaire des rats ayant subi une LPNS, 2 semaines plus tôt. Au terme de cette étude, nous avons suggéré que la surexpression du RB1 sur les fibres de type C contribuerait à l’hyperalgésie thermique alors que le RB1 sur la microglie dans la moelle épinière contribuerait aux allodynies tactile et au froid dans le modèle LPNS chez le rat. Le stress oxydatif pourrait être impliqué dans l’induction du RB1. Bien que le rôle du TRPV1 semble plutôt limité à la douleur thermique, il pourrait cependant agir via le RB1 sur les fibres de type C.

Modulation de la signalisation du récepteur de type 2 du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGFR-2) par l’ubiquitination

Résumé L’angiogenèse est l’un des processus les plus importants pour le maintien de l’homéostasie de l’oxygène dans les tissus. Le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire, VEGF, joue un rôle primordial dans la réponse angiogénique. Ce facteur de croissance mène à l’activation du récepteur de type 2 du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire, VEGFR-2. Suite à une activation du VEGFR-2, plusieurs cascades de signalisation sont activées dans les cellules endothéliales. Afin d’atténuer cette signalisation, le VEGFR-2 est multi-ubiquitiné sur des résidus lysine et de cette manière, il est amené aux voies de dégradation, principalement dans les lysosomes. Cette ubiquitination est induite par l’association de l’ubiquitine ligase (E3) c-Cbl à un résidu tyrosine phosphorylé du domaine C-terminal du récepteur. Dans cette étude, nous avons identifié la tyrosine 1319 comme étant nécessaire pour l’association de c-Cbl au VEGFR-2 et son ubiquitination. Nos résultats démontrent aussi que dans des cellules endothéliales aortiques bovines, BAEC, la surexpression du récepteur mutant Y1319F ralentit la dégradation du VEGFR-2 et induit une activation plus forte et prolongée de la synthétase endothéliale du monoxyde d’azote (eNOS). Ces résultats nous permettent de mieux comprendre le déroulement de la régulation de la signalisation du VEGFR-2 au niveau intracellulaire. Mots-clés: [Angiogenèse, VEGFR-2, VEGF, c-Cbl, Ubiquitination, Tyrosine 1319, Dégradation]

Conséquences fonctionnelles de mutations affectant le récepteur de la vasopressine de type 2 et implications thérapeutiques

Le récepteur de la vasopressine de type 2 (V2R) joue un rôle crucial dans l’homéostasie hydrique. Exprimé principalement au niveau du rein, son activation par l’hormone antidiurétique arginine-vasopressine (AVP) favorise la réabsorption d’eau, participant ainsi à diminuer la diurèse. Plus de 200 mutations dans le gène du V2R ont été associées au diabète néphrogénique insipide congénital (DINc), une maladie causée par une perte de fonction du récepteur. À l’opposé, trois mutations découvertes récemment induisent un gain de fonction du V2R, et sont la cause du syndrome néphrogénique de l’anti-diurèse inappropriée (NSIAD). Les travaux de cette thèse visent à mieux comprendre les bases moléculaires responsables de la perte ou du gain de fonction des récepteurs mutants associés à ces deux maladies. Dans plus de 50% des cas, les mutations faux-sens affectent négativement l’adoption d’une conformation native par le V2R, provoquant la reconnaissance et la rétention intracellulaire des mutants par le système de contrôle de qualité du réticulum endoplasmique. Nos résultats ont démontré que l’interaction entre les récepteurs mutants et le chaperon moléculaire calnexine est dépendante de N-glycosylation et que sa durée varie en fonction de la mutation. De plus, l’importance de cette modification co-traductionnelle et des interactions lectines-sucres dans le processus de maturation d’un mutant donné s’est avérée une caractéristique intrinsèque, puisque l’absence de N-glycosylation n’a pas affecté le mutant Y128S (phénotype léger) tandis que la maturation du mutant W164S (phénotype sévère) a été totalement abolie. Nos résultats suggèrent aussi que l’action des chaperons pharmacologiques (CP), molécules favorisant la maturation des mutants du V2R, peut survenir à différentes étapes au cours du processus de maturation, selon le mutant réchappé. Ces différences entre muta nts suggèrent des processus biosynthétiques ‘personnalisés’ dictés par la nature de la mutation impliquée et pourraient expliquer la différence de sévérité des manifestations cliniques chez les patients porteurs de ces mutations. Bien qu’une récupération de fonction ait été obtenue pour les mutants Y128S et W164S par un traitement au CP, il n’en est pas de même pour toutes les mutations occasionnant un défaut conformationnel. C’est ce que nous avons démontré pour le mutant V88M, affligé de deux défauts, soit une faible efficacité de maturation combinée à une basse affinité pour l’AVP. Dans ce cas, et malgré une augmentation du nombre de récepteurs mutants la surface cellulaire, la diminution de l’affinité apparente du récepteur mutant pour l’AVP a été exacerbée par la présence résiduelle de CP à son site de liaison, rendant impossible l’activation du récepteur aux concentrations physiologiques d’AVP. Les mutants R137C et R137L ont une activité constitutive élevée et mènent au NSIAD tandis que la substitution de cette même arginine par une histidine (R137H) mène au DINc. Ces trois mutants se sont avéré partager plusieurs caractéristiques, dont une efficacité de maturation réduite et une désensibilisation spontanée élevée. La seule différence iden tifiée entre ces mutants est leur niveau d’activité constitutive. Le CP utilisé dans nos études possède aussi la propriété d’agoniste inverse, mais n’a pourtant pas diminué l’activité constitutive des mutants R137C/L, suggérant une conformation active ‘figée’. Seul l’effet chaperon a été observé, entraînant la hausse de récepteurs à la surface cellulaire, qui se traduit par une augmentation de la production de second messager. Nous avons par contre suggéré l’utilisation d’AVP puisqu’il favorise l’endocytose des récepteurs R137/L sans promouvoir leur activation, diminuant ainsi le nombre de récepteurs actifs à la surface cellulaire. Nous avons identifié la première mutation occasionnant un gain de fonction du V2R qui n’implique pas l’arginine 137. Le mutant F229V a une activité constitutive élevée et, contrairement aux R137C et R137L, il n’est pas sujet à une désensibilisation spontanée accrue. L’observation que des agonistes inverses sont aptes à inhiber l’activité constitutive de ce nouveau mutant est une découverte importante puisque l’insuccès obtenu avec les mutations précédentes suggérait que ces molécules n’étaient pas utiles pour le traitement du NSIAD. Considérés globalement, ces travaux illustrent le caractère particulier des formes mutantes du V2R et l’importance de bien cerner les conséquences fonctionnelles des mutations afin d’apporter aux patients atteints de DINc ou NSIAD une thérapie personnalisée, et de développer de nouveaux agents thérapeutiques adaptés aux besoins.

La sélectivité fonctionnelle des ligands du récepteur delta opiacé

Les récepteurs couplés aux protéines GRCPG sont une des plus grandes familles de récepteur membranaire codifié par le génome humain et certainement la plus grande famille de récepteurs. Localisés au niveau des membranes plasmiques, ils sont responsables d’une grande variété de réponses cellulaires. L’activation de ces derniers par des ligands était traditionnellement associée à un changement de conformation de la protéine, passant d’un état inactif à un état actif. Toutefois, certaines observations entraient en contradiction avec cette théorie et laissaient supposer la présence de plusieurs conformations actives du récepteur. Ces différentes conformations pouvaient être actives pour certaines voies de signalisation ou de régulation et inactives pour d’autres. Ce phénomène, initialement appelé agoniste dirigé ou « biased agonism », est maintenant décrit comme étant la sélectivité fonctionnelle des ligands des RCPG. Cette sélectivité des voies de signalisation et de régulation permettrait en théorie de développer des ligands capables de cibler seulement les voies de signalisation et de régulation responsable des effets thérapeutiques sans activer les voies responsables des effets secondaires ou indésirables. Le récepteur delta opiacé (DOR) est un RCPG impliqué dans la gestion de la douleur chronique. L’action analgésique de ses ligands est toutefois soumise à un effet de tolérance produite lors de leur utilisation à long terme. Cet effet secondaire limite l’utilisation thérapeutique de ces médicaments. Cette thèse s’est donc intéressée à la sélectivité fonctionnelle des ligands du DOR afin d’évaluer la possibilité de réduire les effets de tolérance produits par ces molécules. En premier lieu, nous avons déterminé que le DOR peut être stabilisé dans plusieurs conformations actives dépendantes du ligand qui le lie et ces conformations possèdent différents profils d’activation des voies de signalisation et de régulation. En deuxième lieu, nous avons déterminé que les différents ligands du DOR stabilisent des conformations du complexe récepteur/protéine G qui ne concordent pas avec la théorie des récepteurs à deux états, suggérant plutôt la présence d’une multitude de conformations actives. Finalement, nous avons démontré que ces différentes conformations interagissaient de façon distincte avec les protéines de régulation des RCPG; le ligand favorisant le retour du récepteur à la membrane produisant moins de désensibilisation et moins de tolérance aiguë à l’analgésie que le ligand favorisant la séquestration du récepteur à l’intérieur de la cellule. Les résultats de cette thèse démontrent que la sélectivité fonctionnelle des ligands opiacés pourrait être utilisée dans le développement de nouveau analgésique produisant moins de tolérance.

La contribution du récepteur B1 des kinines dans les complications diabétiques chez le rat traité au glucose, un modèle de résistance à l'insuline

Les kinines agissent sur deux types de récepteurs couplés aux protéines G, nommés B1 et B2, lesquels jouent un rôle important dans le contrôle cardiovasculaire, la nociception et l’inflammation. Nous considérons l’hypothèse que le récepteur B1 des kinines est induit et contribue aux complications diabétiques, incluant l’hypertension artérielle, les polyneuropathies sensorielles, l’augmentation du stress oxydatif vasculaire, l’inflammation vasculaire et l’obésité chez le rat traité au D-glucose (10% dans l’eau de boisson) pendant 8 ou 12 semaines. Dans ce modèle de résistance à l’insuline, nous avons évalué les effets d’un traitement pharmacologique d’une semaine avec un antagoniste du récepteur B1 des kinines, le SSR240612 (10 mg/kg/jr). Les résultats montrent que le SSR240612 renverse l’hypertension, l’allodynie tactile et au froid, la production de l’anion superoxyde et la surexpression de plusieurs marqueurs inflammatoires dans l’aorte (iNOS, IL-1β, macrophage (CD68, CD11), ICAM-1, E-selectine, MIF ainsi que le B1R) et dans les adipocytes (iNOS, IL-1β, TNF-α et macrophage CD68). De plus, le SSR240612 corrige la résistance à l’insuline, les anomalies du profil lipidique plasmatique et le gain de poids et de masse adipeuse. Ces données supportent l’implication des kinines dans les complications diabétiques dans un modèle animal de résistance à l’insuline et suggèrent que le récepteur B1 est une cible thérapeutique potentielle dans le diabète et l’obésité.

Développement d'une lignée basophilique de rat exprimant une chaîne a[alpha] chimérique du récepteur Fc[epsilon]RI pour la mesure d'une sensibilisation à des agents professionnels

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Méthodologie pour la synthèse combinatoire d’azapeptides: application à la synthèse d’analogues aza-GHRP-6 en tant que ligands du récepteur CD36

Les azapeptides sont des mimes peptidiques où le carbone alpha d’un ou de plusieurs acides aminés est remplacé par un atome d’azote. Cette modification tend à stabiliser une conformation en repliement beta en raison de la répulsion électronique entre les paires d’électrons libres des atomes d’azote adjacents et de la géométrie plane de l’urée. De plus, le résidu semicarbazide a une meilleure résistance face aux protéases en plus d’être chimiquement plus stable qu’une liaison amide. Bien que les propriétés des azapeptides en fassent des mimes peptidiques intéressants, leurs méthodes de synthèses font appel à la synthèse laborieuse d’hydrazines substituées en solution. Le peptide sécréteur d’hormone de croissance 6 (GHRP-6, His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2) est un hexapeptide synthétique qui possède une affinité pour deux récepteurs distincts: les récepteurs GHS-R1a et CD36. Les travaux effectués au cours de mon doctorat qui seront détaillés dans cet ouvrage visent à atteindre deux objectifs: (1) le développement d’analogues du peptide GHRP-6 sélectif à un seul récepteur et (2) la mise au point d’une nouvelle méthodologie pour la synthèse combinatoire d’azapeptides. En réponse au premier objectif, la synthèse parallèle de 49 analogues aza-GHRP-6 a été effectuée et certains candidats sélectifs au récepteur CD36 ont été identifiés. L’étude de leurs propriétés anti-angiogéniques, effectuée par nos collaborateurs, a également permis d’identifier des candidats intéressants pour le traitement potentiel de la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Une nouvelle approche pour la synthèse combinatoire d’azapeptides, faisant appel à l’alkylation et la déprotection chimiosélective d’une sous-unité semicarbazone ancrée sur support solide, a ensuite été développée. La portée de cette méthodologie a été augmentée par la découverte de conditions permettant l’arylation régiosélective de cette sous-unité semicarbazone, donnant accès à treize nouveaux dérivés aza-GHRP-6 possédant des résidus aza-arylglycines aux positions D-Trp2 et Trp4. L’élaboration de conditions propices à l’alkylation et la déprotection chimiosélective de la semicarbazone a donné accès à une variété de chaînes latérales sur l’acide aminé « aza » préalablement inaccessibles. Nous avons, entre autres, démontré qu’une chaîne latérale propargyl pouvait être incorporée sur l’acide aminé « aza ». Tenant compte de la réactivité des alcynes, nous avons ensuite élaboré des conditions réactionnelles permettant la formation in situ d’azotures aromatiques, suivie d’une réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire sur support solide, dans le but d’obtenir des mimes de tryptophane. Sept analogues du GHRP-6 ont été synthétisés et testés pour affinité au récepteur CD36 par nos collaborateurs. De plus, nous avons effectué une réaction de couplage en solution entre un dipeptide possédant un résidu aza-propargylglycine, du paraformaldehyde et une variété d’amines secondaires (couplage A3) afin d’accéder à des mimes rigides d’aza-lysine. Ces sous-unités ont ensuite été incorporées sur support solide afin de générer sept nouveaux azapeptides avec des dérivés aza-lysine à la position Trp4 du GHRP-6. Enfin, une réaction de cyclisation 5-exo-dig a été développée pour la synthèse de N-amino imidazolin-2-ones en tant que nouveaux mimes peptidiques. Leur fonctionnalisation par une série de groupements benzyliques à la position 4 de l’hétérocycle a été rendue possible grâce à un couplage Sonogashira précédant la réaction de cyclisation. Les propriétés conformationnelles de cette nouvelle famille de composés ont été étudiées par cristallographie aux rayons X et spectroscopie RMN d’un tétrapeptide modèle. L’activité biologique de deux mimes peptidiques, possédant un résidu N-amino-4-méthyl- et 4-benzyl-imidazolin-2-one à la position Trp4 du GHRP-6, a aussi été examinée. L’ensemble de ces travaux devrait contribuer à l’avancement des connaissances au niveau des facteurs structurels et conformationnels requis pour le développement d’azapeptides en tant que ligands du récepteur CD36. De plus, les résultats obtenus devraient encourager davantage l’utilisation d’azapeptides comme peptidomimétiques grâce à leur nouvelle facilité de synthèse et la diversité grandissante au niveau de la chaîne latérale des acides aminés « aza ».

Rôle du récepteur aux cannabinoïdes CB2 sur la synaptogenèse

Lors de cette étude, nous avons d’abord localisé les récepteurs CB1 et CB2 sur les structures neuronales. Nous avons montré que les récepteurs CB1 et CB2 sont présents sur les dendrites et les axones et les filopodes. Dans le même ordre d’idée, nous avons localisé le récepteur DCC sur les structures neuronales. Celui-ci est aussi présent sur les dendrites, les axones et les filopodes. Ces résultats suggèrent que le récepteur DCC serait impliqué non seulement dans le processus de synaptogenèse médié par le récepteur CB1, comme cela a été montré dans le laboratoire du professeur Bouchard, mais aussi dans celui, éventuellement, médié par le récepteur CB2. Nous avons ensuite évalué l’effet des ligands du récepteur CB2. Nous n’avons détecté aucun effet clair des agonistes inverses (AM630 et JTE907) et des agonistes (JWH015 et JWH133) quant à la médiation du processus de synaptogenèse en terme de variation de la densité des filopodes et des points de contacts synaptiques. Nous avons obtenu des résultats variables. Ceux-ci furent non reproductibles. Nous avons obtenu des résultats différents des résultats originaux lorsque nous avons requantifié visuellement les mêmes photos à deux reprises Nous avons développé une méthode informatisée de quantification qui nous a permis d’obtenir des résultats reproductibles. Cependant, nous n’avons toujours pas détecté d’effets sur la synaptogenèse médiés par le récepteur CB2. Ces résultats préliminaires ne nous permettent ni d’infirmer, ni de confirmer d’éventuels effets sur la synaptogenèse médiés par le récepteur CB2. Une étude exhaustive serait nécessaire pour le déterminer.

Rôle du récepteur EphA4 dans la plasticité structurale neurono-gliale du noyau supraoptique à la suite d’un régime à l’eau salée

Les noyaux supraoptiques (NSO) et paraventriculaires (NPV) de l’hypothalamus montrent un phénomène réversible de plasticité structurale neurono-gliale dans diverses conditions physiologiques telles que la parturition, l’allaitement ou lors d’une surcharge en sel. En effet, les feuillets astrocytaires qui enveloppent normalement les somas et dendrites des neurones à ocytocine (OT) ou à vasopressine (AVP) se rétractent alors, autour des neurones à OT, laissant place à la formation de nouvelles synapses, surtout GABAergiques. Nous avons émis l’hypothèse voulant que ces mouvements cellulaires soient régulés par des molécules connues pour leurs rôles dans l’adhérence et la motilité cellulaires, notamment les récepteurs Eph et les éphrines (Efn). Nous avons étudié le rôle de l’un de ces récepteurs, EphA4, un récepteur à tyrosine kinase reconnaissant l’ensemble des Efn, A ou B, puis tenté d’identifier les Efn partenaires dans le NSO, à la suite d’une surcharge en sel. Pour démontrer la présence d’EphA4 dans le NSO et déterminer l’effet d’une surcharge en sel sur son expression et sa localisation, nous avons utilisé l’hybridation in situ et l’immunohistochimie en microscopie électronique, sur des coupes de cerveaux de souris ou rats traités ou non à l’eau salée pendant 1-7 j, avec des ribosondes ou des anticorps spécifiques pour EphA4. Ces travaux ont démontré une augmentation de l’expression d’EphA4 dans le NSO, notamment dans des dendrites, après le régime salé. La distribution de cette expression correspondait à celle des neurones OT et était absente de la glia limitans. Nous avons ensuite déterminé l’effet d’une absence d’EphA4 sur les mouvements astrocytaires et la synaptogènese autour des dendrites à OT et AVP, en utilisant des souris EphA4 knockouts et des souris de type sauvage des mêmes portées. Nous avons ainsi mesuré la couverture astrocytaire des dendrites OT ou AVP, identifiées par immunocytochimie anti-OT ou anti-AVP, en microscopie électronique. Ces mesures ont confirmé la rétraction des feuillets astrocytaires et la synaptogenèse autour des dendrites OT, mais pas autour des dendrites AVP, chez les souris de type sauvage, et démontré que la rétraction des feuillets astrocytaires et la synaptogenèse sur les dendrites OT ne se produisait pas chez les souris knockouts soumises à la surcharge en sel. L’ensemble de ces résultats démontre un rôle d’EphA4 dans cette plasticité structurale neurono-gliale. Afin d’identifier l’Efn partenaire d’EphA4 dans cette fonction, nous avons utilisé l’hybridation in situ et l’immunohistochimie pour les EfnB3 et -A3. L’hybridation in situ n’a pas démontré d’expression de l’EfnB3 dans le NSO, tandis que les résultats pour l’EfnA3 restent à quantifier. Cependant, l’immunohistochimie anti-EfnA3 montre un marquage d’astrocytes dans le NSO et la glia limitans, marquage qui semble augmenter après surcharge en sel, mais il reste à démontrer que l’anticorps anti-EfnA3 est bien spécifique et à quantifier les éventuels changements sur un plus grand nombre d’animaux. L’ensemble de ces observations démontre un rôle du récepteur EphA4 dans les mécanismes à la base des changements structuraux neurono-gliaux du NSO et pointe vers l’EfnA3 comme partenaire d’EphA4 dans ce modèle.

Le rôle du récepteur B1 des kinines dans le développement de la rétinopathie diabétique

La rétinopathie diabétique est associée à plusieurs changements pathologiques du lit vasculaire rétinien, incluant l’ouverture de la barrière hémato-rétinienne, l’inflammation vasculaire et la modification du débit sanguin. Récemment, il a été proposé que le récepteur B1 des kinines, qui est surexprimé dans la rétine diabétique, puisse être impliqué dans le développement de ces altérations vasculaires. Ainsi, cette thèse présente les effets de traitements pharmacologiques avec des antagonistes du récepteur B1 sur la perfusion rétinienne, la perméabilité vasculaire, l’infiltration des leucocytes (leucostasie), l’expression de médiateurs de l’inflammation et la production d’anion superoxyde dans la rétine du rat rendu diabétique avec la streptozotocine (STZ). Les résultats obtenus montrent que l’application oculaire (10 µl d’une solution à 1%, deux fois par jour pendant 7 jours) de LF22-0542, un antagoniste hydrosoluble du récepteur B1, bloque significativement l’hyperperméabilité vasculaire, la leucostasie, le stress oxydatif et l’expression génique de médiateurs de l’inflammation (B1R, iNOS, COX-2, VEGF-R2, IL-1β et HIF-1α) dans la rétine chez le rat à 2 semaines de diabète. L’administration orale (3 mg/kg) d’un antagoniste non-peptidique et sélectif pour le récepteur B1, le SSR240612, entraîne une diminution du débit sanguin rétinien 4 jours après l’induction du diabète mais n’a aucun effet sur la réduction de la perfusion rétinienne à 6 semaines. Le récepteur B1 joue donc un rôle protecteur au tout début du diabète en assurant le maintien d’un débit sanguin normal dans la rétine; un effet qui n’est toutefois pas maintenu pendant la progression du diabète. Ces données présentent ainsi la dualité du récepteur B1 avec des effets à la fois protecteurs et délétères. Elles suggèrent aussi un rôle important pour le récepteur B1 dans l’inflammation rétinienne et le développement des altérations vasculaires. Le récepteur B1 pourrait donc représenter une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la rétinopathie diabétique.

Voies de signalisation non-canoniques du récepteur V2 de la vasopressine

Le récepteur V2 (V2R) de la vasopressine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG), jouant un rôle fondamental dans le maintien de l’homéostasie hydrosodique. À l’instar de nombreux RCPGs, il est capable d’interagir avec plusieurs types de protéines G hétérotrimériques et possède des voies de signalisation peu explorées aux mécanismes mal compris. Ces voies non canoniques font l’objet des travaux exposés dans ce mémoire. Il s’agit d’explorer les caractéristiques et mécanismes de la signalisation de V2R via G12, et de la voie d’activation d’ERK 1/2 par transactivation du récepteur de l’insulin-like growth factor 1, IGF1R. Par des études de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), nous exposons la capacité de V2R à interagir avec la sous-unité Gα12 ainsi que la modulation de la conformation de l’hétérotrimère G12 par l’agoniste de V2R, l’arginine-vasopressine. Ces travaux dévoilent également la modulation de l’interaction entre Gα12 et son effecteur classique RhoA, suggérant un engagement de RhoA, ainsi que la potentialisation via Gα12 de la production d’AMP cyclique. À l’aide de diverses méthodes d’inhibition sélective, nos résultats précisent les mécanismes de la transactivation. Ils supportent notamment le rôle initiateur de l’activation de Src par V2R et l’absence d’implication des ligands connus d’IGF1R dans la transactivation. La métalloprotéase MMP 3 apparaît par ailleurs comme un bon candidat pour réguler la transactivation. Ce projet met en lumière des modes de signalisation peu explorés de V2R, dont l’implication physiologique et physiopathologique pourrait s’avérer significative, au-delà d’un apport fondamental dans la compréhension de la signalisation des RCPGs.