ARF1 contrôle la migration des cellules hautement invasives du cancer du sein via Rac1

Dans un contexte où la forte prévalence du cancer du sein chez les femmes demeure depuis plusieurs années un enjeu de société majeur, les nouvelles stratégies visant à réduire la mortalité associée à cette maladie sont le sujet de nombreuses recherches scientifiques. Les facteurs d’ADP-ribosylation sont des petites protéines G monomériques importantes pour la réorganisation du cytosquelette d’actine, le remodelage des lipides membranaires et la formation de vésicules. Notre laboratoire a précédemment montré qu’ARF1 est surexprimée dans les cellules hautement invasives du cancer du sein et contribue à leur phénotype migratoire accru. Dans le cadre de ce mémoire, nous avons défini le rôle de cette GTPase dans la migration de telles lignées cellulaires. Pour ce faire, nous avons étudié le rôle d’ARF1 dans l’activation de Rac1, un membre de la famille des GTPases Rho connu pour son implication dans la formation de lamellipodes ainsi que dans la migration cellulaire. Globalement, nous avons déterminé que l’activation d’ARF1 permet l’activation subséquente de Rac1 ainsi que de la voie de signalisation nécessaire au processus de migration. Par une approche d’interférence à l’ARN dans les cellules MDA-MB-231, nous avons d’abord montré la contribution essentielle de Rac1 la migration dépendante d’ARF1. Puis, de façon à établir le mécanisme derrière cette régulation, nous avons montré que l’inhibition de l’expression endogène d’ARF1 altère l’activation de Rac1 dépendante de l’EGF. Nous avons ensuite examiné les conséquences d’une telle inhibition sur les partenaires d’interaction de Rac1. Nous avons découvert qu’ARF1 et Rac1 forment un complexe constitutif, puis qu’ARF1est nécessaire à l’association de Rac1 à IRSp53, une protéine importante dans la formation de lamellipodes. La translocation dépendante de l’EGF du complexe Rac1/IRSp53 à la membrane plasmique est également sous le contrôle d’ARF1. En conclusion, cette étude fournit un nouveau mécanisme par lequel ARF1 régule la migration cellulaire et identifie cette GTPase en tant que cible pharmacologique prometteuse pour freiner le développement des métastases chez les patients atteints du cancer du sein.

Reconnaissance émotionnelle faciale et psychopathie : un protocole exploratoire à l’aide de personnages virtuels animés

La présente recherche est constituée de deux études. Dans l’étude 1, il s’agit d’améliorer la validité écologique des travaux sur la reconnaissance émotionnelle faciale (REF) en procédant à la validation de stimuli qui permettront d’étudier cette question en réalité virtuelle. L’étude 2 vise à documenter la relation entre le niveau de psychopathie et la performance à une tâche de REF au sein d’un échantillon de la population générale. Pour ce faire, nous avons créé des personnages virtuels animés de différentes origines ethniques exprimant les six émotions fondamentales à différents niveaux d’intensité. Les stimuli, sous forme statique et dynamique, ont été évalués par des étudiants universitaires. Les résultats de l’étude 1 indiquent que les stimuli virtuels, en plus de comporter plusieurs traits distinctifs, constituent un ensemble valide pour étudier la REF. L’étude 2 a permis de constater qu’un score plus élevé à l’échelle de psychopathie, spécifiquement à la facette de l’affect plat, est associé à une plus grande sensibilité aux expressions émotionnelles, particulièrement pour la tristesse. Inversement, un niveau élevé de tendances criminelles est, pour sa part, associé à une certaine insensibilité générale et à un déficit spécifique pour le dégoût. Ces résultats sont spécifiques aux participants masculins. Les données s’inscrivent dans une perspective évolutive de la psychopathie. L’étude met en évidence l’importance d’étudier l’influence respective des facettes de la personnalité psychopathique, ce même dans des populations non-cliniques. De plus, elle souligne la manifestation différentielle des tendances psychopathiques chez les hommes et chez les femmes.

La régulation du gène CYP19A1 dans les cellules de granulosa bovine in vitro

L’oestradiol joue un rôle important dans la reproduction en général, particulièrement dans la croissance folliculaire chez la vache. La production de l’œstradiol nécessite l’expression du gène CYP19A1 suite à la stimulation des cellules de granulosa par l’hormone folliculostimulante (FSH) ou le facteur de croissance insulinique de type 1 (IGF-1). Chez la vache, il existe six promoteurs (1.1 ; 1.2 ; 1.3 ; 1.4 ; 1.5 et 2) qui dirigent la transcription du gène CYP19A1 dans les cellules de la granulosa. Le principal promoteur qui dirige la transcription au niveau de l’ovaire (cellules de granulosa) est le promoteur 2 (P2). Cependant, l’effet de la FSH et de l’IGF-1 sur l’activation de ces promoteurs d’aromatase demeure mal connu. De plus, la demi-vie du transcrit CYP19A1 est très courte avec une région 3’UTR relativement longue. L’analyse de la séquence 3’UTR montre la présence des motifs ARE (séquence riche en AU), des études antérieur montrent que ces séquences impliquent dans la régulation de la stabilité ou la dégradation de l’ARNm, ce qui est fort probable que la courte demi-vie de l’ARNm CYP19A1 est sous le contrôle post-transcriptionel. L’objectif de la thèse visait à étudier la régulation de l’expression du gène CYP19A1 chez la vache. Il y a deux thèmes soit étude de la régulation transcriptionnelle ciblant le promoteur et soit étude de la régulation post-transcriptionnelle impliquant la région 3’non traduite (3’UTR). Le premier objectif vise à étudier la régulation transcriptionnelle du gène CYP19A1. Nous avons étudié l'activité du promoteur ovarien bovin dans deux modèles de cellules de la granulosa, les cellules lutéinisées et nonlutéinisées in vitro, suite à une stimulation des cellules par la FSH ou IGF-1. Nous avons également évalué la voie de signalisation impliquée dans la régulation des différents promoteurs en utilisant un RT-PCR et un gène rapporteur (les différents promoteurs d’aromatase ont été insérés dans le vecteur pGL3promoter en amont du gène exprimant la luciférase). Les résultats de RT-PCR démontrent que la FSH et l’IGF-1 augmentent les concentrations d’ARNm provenant des deux promoteurs 2 et 1.1 dans les cellules de la granulosa non lutéinisées. Des expériences subséquentes ont montré que la FSH stimule le promoteur 2 via la voie PKA tandis que l'IGF-1 stimule le promoteur 2 via la voie PKC. La FSH et l’IGF-1 stimulent l’expression du promoteur 1.1 via la voie PI3K. L’analyse de l’activité luciférase démontre que dans les cellules de granulosa lutéinisées, la FSH stimule le promoteur 1.1 de façon dose dépendante et ne semble y avoir aucun effet significatif sur le promoteur 2. Nous avons donc comparé l’activité du promoteur PII/P2 humain, du rat, de la chèvre et de la vache dans les cellules de granulosa bovine lutéinisées. Le résultat le plus significatif est que le promoteur 2 bovine (et caprine) dépend de plusieurs facteurs de transcription (NR5A2, FOXL2) comparé au promoteur PII humain et celui du promoteur proximal du rat qui dépendent principalement de l'AMPc. En effet, nos résultats ont démontré une expression raisonnablement robuste du P2 bovine lorsque les cellules sont traitées à la forskoline, NR5A2 et FOXL2. Le facteur FOXL2 semble déterminer l'activité du promoteur 2 chez le ruminant. Le deuxième objectif vise à étudier la régulation post-transcriptionnelle du gène CYP19A1. Pour ce faire, nous avons déterminé la séquence minimale de l'ARNm CYP19A1 requise pour la régulation de sa demi-vie. Différents séquences de la région 3’UTR ont été insérés dans le vecteur pGL3promoter en aval du gène exprimant la luciférase ou soit dans le vecteur pGEMTeasy. Le vecteur pGL3promoter a été transfecté dans les cellules de granulosa lutéinisées pour évaluer l'impact de la séquence 3'UTR sur l'expression du gène rapporteur de la luciférase, alors que le vecteur pGEMTeasy a été utilisé pour la transcription in vitro afin de générer de l’ARNm. Ce dernier sera utilisé en réaction croisée au UV avec des extraits protéiques pour démontrer l’association du complexe ARNm/protéine. L’analyse de l’activité luciférase a permis d’identifier une séquence de 200 pb située entre 926 et 1134 pb de la région 3'UTR de l’ARNm CYP19A1 qui a réduit significativement l’activité de la luciférase. Selon les analyses de la réaction croisée au UV, une ou plusieurs protéines de 66 et 80 kDA se lient spécifiquement à la séquence de 200 pb qui réduit l’activité de luciférase. Cette protéine s'exprime dans les cellules de granulosa, mais n’a pas été détectée dans d'autres tissus comme le foie et le cœur. Par ailleurs, l’utilisation du gène rapporteur sensible à la FSH a suscité l’intérêt d'une compagnie pharmaceutique qui vend de l’equine chorionic gonadotropin (eCG) pour lui permettre de distinguer facilement l’eCG ayant une forte activité FSH et donc, avoir un produit commercial plus efficace et de meilleure qualité. Dans cette étude, nous avons développé un système de bioessai à la FSH basé sur la transfection des cellules avec un récepteur à la FSH et un gène rapporteur colorimètrique qui permet d’estimer l’activité de la FSH dans le sérum de la jument et qui pourrait être applicable au niveau de la ferme/industrie.

Voies de signalisation non-canoniques du récepteur V2 de la vasopressine

Le récepteur V2 (V2R) de la vasopressine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG), jouant un rôle fondamental dans le maintien de l’homéostasie hydrosodique. À l’instar de nombreux RCPGs, il est capable d’interagir avec plusieurs types de protéines G hétérotrimériques et possède des voies de signalisation peu explorées aux mécanismes mal compris. Ces voies non canoniques font l’objet des travaux exposés dans ce mémoire. Il s’agit d’explorer les caractéristiques et mécanismes de la signalisation de V2R via G12, et de la voie d’activation d’ERK 1/2 par transactivation du récepteur de l’insulin-like growth factor 1, IGF1R. Par des études de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), nous exposons la capacité de V2R à interagir avec la sous-unité Gα12 ainsi que la modulation de la conformation de l’hétérotrimère G12 par l’agoniste de V2R, l’arginine-vasopressine. Ces travaux dévoilent également la modulation de l’interaction entre Gα12 et son effecteur classique RhoA, suggérant un engagement de RhoA, ainsi que la potentialisation via Gα12 de la production d’AMP cyclique. À l’aide de diverses méthodes d’inhibition sélective, nos résultats précisent les mécanismes de la transactivation. Ils supportent notamment le rôle initiateur de l’activation de Src par V2R et l’absence d’implication des ligands connus d’IGF1R dans la transactivation. La métalloprotéase MMP 3 apparaît par ailleurs comme un bon candidat pour réguler la transactivation. Ce projet met en lumière des modes de signalisation peu explorés de V2R, dont l’implication physiologique et physiopathologique pourrait s’avérer significative, au-delà d’un apport fondamental dans la compréhension de la signalisation des RCPGs.

Regulation of BAP1 tumor suppressor complex by post-translational modifications

Le régulateur transcriptionnel BAP1 est une déubiquitinase nucléaire (DUB) dont le substrat est l’histone H2A modifiée par monoubiquitination au niveau des residus lysines 118 et 119 (K118/K119). Depuis les dernières années, BAP1 emerge comme un gene suppresseur de tumeur majeur. En effet, BAP1 est inactivé dans un plethore de maladies humaines héréditaires et sporadiques. Cependant, malgré l’accumulation significative des connaissances concernant l’occurrence, la pénétrance et l’impact des défauts de BAP1 sur le développement de cancers, ses mécanismes d’action et de régulation restent très peu compris. Cette étude est dédiée à la caractérisation moléculaire et fonctionnelle du complexe multi-protéique de BAP1 et se présente parmi les premiers travaux décrivant sa régulation par des modifications post-traductionnelles. D’abord, nous avons défini la composition du corps du complexe BAP1 ainsi que ses principaux partenaires d’interaction. Ensuite, nous nous sommes spécifiquement intéressés a investiguer d’avantage deux principaux aspects de la régulation de BAP1. Nous avons d’abord décrit l’inter-régulation entre deux composantes majeures du complexe BAP1, soit HCF-1 et OGT. D’une manière très intéressante, nous avons trouvé que le cofacteur HCF-1 est un important régulateur des niveaux protéiques d’OGT. En retour, OGT est requise pour la maturation protéolytique de HCF-1 en promouvant sa protéolyse par O-GlcNAcylation, un processus de régulation très important pour le bon fonctionnement de HCF-1. D’autre part, nous avons découvert un mécanisme unique de régulation de BAP1 médiée par l’ubiquitine ligase atypique UBE2O. en effet, UBE2O se caractérise par le fait qu’il s’agit aussi bien d’une ubiquitine conjuratrice et d’une ubiquitine ligase. UBE2O, multi-monoubiquitine BAP1 au niveau de son domaine NLS et promeut son exclusion du noyau, le séquestrant ainsi dans le cytoplasme. De façon importante, nos travaux ont permis de mettre de l’emphase sur le rôle de l’activité auto-catalytique de chacune de ces enzymes, soit l’activité d’auto-déubiquitination de BAP1 qui est requise pour la maintenance de sa localisation nucléaire ainsi que l’activité d’auto-ubiquitination d’UBE2O impliquée dans son transport nucléo-cytoplasmique. De manière significative, nous avons trouvé que des défauts au niveau de l’auto-déubiquitination de BAP1 due à des mutations associées à certains cancers indiquent l’importance d’une propre regulation de cette déubiquitinase pour les processus associés à la suppression de tumeurs.

Facteurs de risque d’insuffisance rénale chronique chez les greffés cardiaques : du phénotype aux tests pharmacogénomiques

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est un problème majeur fréquemment rencontré chez les greffés cardiaques. Les inhibiteurs de la calcineurine, pierre angulaire de l’immunosuppression en transplantation d’organes solides, sont considérés comme une des principales causes de dysfonction rénale postgreffe. Plusieurs autres éléments tels que les caractéristiques démographiques, cliniques et génétiques du receveur contribuent également au phénomène, mais il demeure plutôt difficile de déterminer quels sont les patients les plus à risque de développer une IRC après la transplantation. Ainsi, la découverte de nouveaux marqueurs génétiques de dysfonction rénale pourrait un jour mener à l’individualisation de la thérapie immunosuppressive selon le profil génétique de chaque patient. Or, on ne connaît pas les opinions des greffés à l’égard des tests pharmacogénomiques et l’on ne sait pas si celles-ci diffèrent des opinions exprimées par les individus en bonne santé. Cette thèse de doctorat a donc pour objectifs : 1- De décrire l’évolution de la fonction rénale à très long terme après la transplantation et d’identifier les marqueurs démographiques et phénotypiques associés à l’IRC postgreffe cardiaque; 2- D’identifier les marqueurs génétiques associés à la néphrotoxicité induite par les inhibiteurs de la calcineurine; 3- D’évaluer et de comparer les attitudes des patients et des individus en bonne santé par rapport à l’intégration clinique potentielle des marqueurs pharmacogénomiques. Trois projets ont été réalisés pour répondre à ces questions. Le premier repose sur une analyse rétrospective de l’évolution de la fonction rénale chez les patients greffés au sein de notre établissement entre 1983 et 2008. Nous y avons découvert que le déclin de la fonction rénale se poursuit jusqu’à 20 ans après la transplantation cardiaque et que les facteurs de risque d’IRC incluent entre autres l’âge avancé, le sexe féminin, la dysfonction rénale prégreffe, l’hypertension, l’hyperglycémie et l’utilisation de la prednisone. Le deuxième projet est une étude pharmacogénomique s’intéressant aux déterminants génétiques de la néphrotoxicité induite par les inhibiteurs de la calcineurine. Elle nous a permis d’illustrer pour la première fois qu’un polymorphisme génétique lié à PRKCB (gène codant pour la protéine kinase C-β) est associé avec la fonction rénale des patients greffés cardiaques, alors que cela n’est probablement pas le cas pour les polymorphismes de TGFB1 (gène codant pour le transforming growth factor-β1). La troisième section de cette thèse rapporte les résultats d’un questionnaire dont le but était de comparer les attitudes envers les tests pharmacogénomiques parmi un groupe de personnes en bonne santé, de patients greffés cardiaques et de patients souffrant d’insuffisance cardiaque. Cette étude a démontré que, bien que l’enthousiasme pour la pharmacogénomique soit partagé par tous ces individus, les craintes liées à la confidentialité et aux répercussions potentielles sur l’emploi et les assurances sont plus prononcées chez les personnes en bonne santé. En résumé, les travaux issus de cette thèse ont révélé que l’identification précoce des patients greffés cardiaques les plus susceptibles de présenter une détérioration de la fonction rénale ainsi que l’adoption d’une approche thérapeutique individualisée reposant notamment sur les applications cliniques de la pharmacogénomique pourraient éventuellement permettre de freiner cette complication postgreffe.

Caractérisation du gène de l'enzyme de conversion de l'angiotensine-2 dans le rein diabétique et implication dans le développement de la néphropathie diabétique et de l'hypertension

De nombreuses études ont bien démontré que l’activation du système rénine-angiotensine (RAS) joue un rôle important dans le développement de l’hypertension et de la néphropathie diabétique (DN). La découverte de l’enzyme de conversion de l’angiotensine-2 (ACE2) et l’identification du récepteur MAS, spécifique pour l’angiotensine 1-7 (Ang 1-7), ont permis d’identifier deux nouveaux membres du RAS. L’axe ACE2/Ang 1-7/MAS contrebalance les effets de l’axe ACE/Ang II/AT1. Plusieurs évidences impliquent la contribution du RAS intrarénal dans la DN. Des études réalisées dans notre laboratoire avec des souris transgéniques surexprimant l’angiotensinogène de rat dans les cellules de leurs tubules proximaux rénaux (RPTCs) ont permis de démontrer l’importance du RAS intrarénal dans l’induction de l’hypertension et les dommages rénaux. Nous avons également observé que l’expression rénale de l’ACE2 et les niveaux urinaires d’ANG 1-7 sont plus faibles chez les souris Akita (diabète de type 1) et qu’un traitement avec des bloqueurs du RAS permet de normaliser l’expression de l’ACE2 et de prévenir le développement de l’hypertension dans le modèle des souris Akita. Dans un milieu diabétique, à la fois la glycémie et l’angiotensine II (Ang II) peuvent induire la génération des espèces réactives de l’oxygène (ROS), contribuant ainsi aux dommages rénaux. Afin d’explorer la relation entre les ROS, ACE2 et la DN, nous avons créé des souris Akita transgéniques surexprimant la catalase (Cat) dans les RPTCs, en croisant des souris Akita diabétique de type 1 à notre modèle de souris transgéniques surexprimant la Cat de rat dans les RPTCs. Dans une seconde étude, des souris Akita ont été traitées avec l’Ang 1-7 ou une combinaison d’Ang 1-7 et de son antagoniste, A779, afin d’étudier la relation entre l’action de l’Ang 1-7, l’hypertension systolique (sHTN), le stress oxydatif, les dommages rénaux, ACE2 et l’expression du récepteur Mas. Nos résultats ont montré que la surexpression de Cat atténue le stress oxydatif rénal; prévient l’hypertension, améliore le taux de filtration glomérulaire, l’albuminurie, l’hypertrophie rénale, la fibrose tubulo-interstitielle et l’apoptose tubulaire; et supprime l’expression des gènes profibrotiques et proapoptotiques dans les RPTCs des souris Akita Cat-Tg lorsque comparées aux souris Akita. De plus, la surexpression de Cat dans les RPTC des souris Akita normalise l’expression rénale de l’ACE2 et les niveaux urinaires d’Ang 1-7. D’autre part, l’administration d’Ang 1-7 prévient l’hypertension systémique, normalise le ratio albumine/créatinine urinaire et atténue l’hyperfiltration glomérulaire des souris Akita, sans affecter la glycémie sanguine. De plus, le traitement avec l’Ang 1-7 atténue aussi le stress oxydatif et l’expression de la NADPH oxydase, Agt, ACE, TGF-β1 (transforming growth factor-β1) et collagène IV, tout en augmentant l’expression de l’ACE2 et du récepteur Mas dans les reins des souris Akita. Ces effets sont renversés par la co-admininstration d’A779. Ces résultats démontrent que la surexpression de Cat prévient l’hypertension et la progression de la néphropathie, en plus de mettre en lumière l’importance du stress oxydatif intrarénal et l’expression de l’ACE2 comme facteurs contribuant à l’hypertension et les dommages rénaux observés dans le diabète. En outre, nos données suggèrent que l’Ang 1-7 joue un rôle protecteur dans l’hypertension et les dommages aux RPTC dans le diabète, principalement en réduisant les voies de signalisations du stress oxydatif dans les reins et en normalisant l’expression de l’ACE2 et du récepteur Mas. Nos résultats indiquent aussi que l’Ang 1-7 pourrait agir comme un agent thérapeutique potentiel dans le traitement de l’hypertension systémique et les dommages rénaux observés dans le diabète. En conséquence, l’Ang 1-7 est responsable du rôle protecteur de l’ACE2 dans l’hypertension et la DN.

Impact de la maladie du greffon contre l’hôte sur la reconstitution immunitaire suite à une transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques

La transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques (ASCT) est couramment utilisée pour traiter différents cancers hématologiques. Malheureusement, l’effet bénéfique de cette technique est limité par la réaction du greffon contre l’hôte (GVHD) qui demeure la cause principale de mortalité post-greffe. La GVHD endommage différents organes et retarde la reconstitution immunitaire des lymphocytes T (LT) ce qui augmente les risques d’infection et de rechute. Le développement de nouveaux traitements permettant d’accélérer la reconstitution immunitaire augmenterait donc les chances de survie des patients greffés. Il existe deux façons de régénérer des LT: via la thymopoïèse qui consiste à produire de nouveaux LT, ou par la prolifération homéostatique (PH) qui implique l’expansion rapide des LT matures retrouvés dans le greffon. La PH requiert deux signaux essentiels: l’interleukine-7 (IL-7) et la présentation d’antigènes du soi par les cellules dendritiques (DC) via le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) I pour les LT CD8+ et le CMH II pour les LT CD4+. Dans un contexte d’ASCT, la chimiothérapie et la GVHD endommagent le thymus rendant la thymopoïèse inefficace. Par conséquent, la reconstitution immunitaire repose presque entièrement sur la PH des LT. L’objectif de cette thèse était de comprendre comment la GVHD affecte la reconstitution des LT. Grâce à un modèle murin, nous avons démontré que la PH des LT CD4+ est absente durant la GVHD et ce, dû à de faibles niveaux d’IL-7 et une diminution du nombre de DC. La perte des DC est en grande partie causée par des niveaux réduits de stromal derived factor-1α (SDF-1α) et par l’absence de progéniteurs de DC dans la moelle osseuse des souris en GVHD. Le traitement des souris en GVHD avec du SDF-1α permet d’augmenter le nombre de DC, et lorsqu’administré avec l’IL-7, améliore significativement la PH des LT CD4+. Contrairement aux LT CD4+, l’administration d’IL-7 seule est suffisante pour restaurer la PH des LT CD8+ durant la GVHD et ce, même en absence des DC. Ces différences s’expliquent pour deux raisons : 1) l’expression du CMH I, contrairement au CMH II, n’est pas limitée aux DC mais est également exprimée par les cellules stromales du receveur ce qui est suffisant pour induire la PH des LT CD8+ et 2) les LT CD8+ répondent à des concentrations plus faibles d’IL-7 systémique comparativement aux LT CD4+. En conclusion, l’ensemble de ces résultats permettra de mettre en place des études translationnelles sur le potentiel thérapeutique du SDF-1α et de l’IL-7 dans la reconstitution immunitaire des patients greffés.

Quantitative proteomics methods for the analysis of histone post-translational modifications

Les histones sont des protéines nucléaires hautement conservées chez les cellules des eucaryotes. Elles permettent d’organiser et de compacter l’ADN sous la forme de nucléosomes, ceux-ci representant les sous unités de base de la chromatine. Les histones peuvent être modifiées par de nombreuses modifications post-traductionnelles (PTMs) telles que l’acétylation, la méthylation et la phosphorylation. Ces modifications jouent un rôle essentiel dans la réplication de l’ADN, la transcription et l’assemblage de la chromatine. L’abondance de ces modifications peut varier de facon significative lors du developpement des maladies incluant plusieurs types de cancer. Par exemple, la perte totale de la triméthylation sur H4K20 ainsi que l’acétylation sur H4K16 sont des marqueurs tumoraux spécifiques a certains types de cancer chez l’humain. Par conséquent, l’étude de ces modifications et des événements determinant la dynamique des leurs changements d’abondance sont des atouts importants pour mieux comprendre les fonctions cellulaires et moléculaires lors du développement de la maladie. De manière générale, les modifications des histones sont étudiées par des approches biochimiques telles que les immuno-buvardage de type Western ou les méthodes d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Cependant, ces approches présentent plusieurs inconvénients telles que le manque de spécificité ou la disponibilité des anticorps, leur coût ou encore la difficulté de les produire et de les valider. Au cours des dernières décennies, la spectrométrie de masse (MS) s’est avérée être une méthode performante pour la caractérisation et la quantification des modifications d’histones. La MS offre de nombreux avantages par rapport aux techniques traditionnelles. Entre autre, elle permet d’effectuer des analyses reproductibles, spécifiques et facilite l’etude d’un large spectre de PTMs en une seule analyse. Dans cette thèse, nous présenterons le développement et l’application de nouveaux outils analytiques pour l’identification et à la quantification des PTMs modifiant les histones. Dans un premier temps, une méthode a été développée pour mesurer les changements d’acétylation spécifiques à certains sites des histones. Cette méthode combine l’analyse des histones intactes et les méthodes de séquençage peptidique afin de déterminer les changements d’acétylation suite à la réaction in vitro par l’histone acétyltransférase (HAT) de levure Rtt109 en présence de ses chaperonnes (Asf1 ou Vps75). Dans un second temps, nous avons développé une méthode d’analyse des peptides isomériques des histones. Cette méthode combine la LC-MS/MS à haute résolution et un nouvel outil informatique appelé Iso-PeptidAce qui permet de déconvoluer les spectres mixtes de peptides isomériques. Nous avons évalué Iso-PeptidAce avec un mélange de peptides synthétiques isomériques. Nous avons également validé les performances de cette approche avec des histones isolées de cellules humaines érythroleucémiques (K562) traitées avec des inhibiteurs d’histones désacétylases (HDACi) utilisés en clinique, et des histones de Saccharomyces cerevisiae liées au facteur d’assemblage de la chromatine (CAF-1) purifiées par chromatographie d’affinité. Enfin, en utilisant la méthode présentée précédemment, nous avons fait une analyse approfondie de la spécificité de plusieurs HATs et HDACs chez Schizosaccharomyces pombe. Nous avons donc déterminé les niveaux d’acétylation d’histones purifiées à partir de cellules contrôles ou de souches mutantes auxquelles il manque une HAT ou HDAC. Notre analyse nous a permis de valider plusieurs cibles connues des HATs et HDACs et d’en identifier de nouvelles. Nos données ont également permis de définir le rôle des différentes HATs et HDACs dans le maintien de l’équilibre d’acétylation des histones. Dans l’ensemble, nous anticipons que les méthodes décrites dans cette thèse permettront de résoudre certains défis rencontrés dans l’étude de la chromatine. De plus, ces données apportent de nouvelles connaissances pour l’élaboration d’études génétiques et biochimiques utilisant S. pombe.

Les ligands du récepteur au CNTF dans le système immunitaire

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mechanisms underlying activation of neural stem cells in the adult central nervous system

À la fin du 19e siècle, Dr. Ramón y Cajal, un pionnier scientifique, a découvert les éléments cellulaires individuels, appelés neurones, composant le système nerveux. Il a également remarqué la complexité de ce système et a mentionné l’impossibilité de ces nouveaux neurones à être intégrés dans le système nerveux adulte. Une de ses citations reconnues : “Dans les centres adultes, les chemins nerveux sont fixes, terminés, immuables. Tout doit mourir, rien ne peut être régénérer” est représentative du dogme de l’époque (Ramón y Cajal 1928). D’importantes études effectuées dans les années 1960-1970 suggèrent un point de vue différent. Il a été démontré que les nouveaux neurones peuvent être générés à l’âge adulte, mais cette découverte a créé un scepticisme omniprésent au sein de la communauté scientifique. Il a fallu 30 ans pour que le concept de neurogenèse adulte soit largement accepté. Cette découverte, en plus de nombreuses avancées techniques, a ouvert la porte à de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour les maladies neurodégénératives. Les cellules souches neurales (CSNs) adultes résident principalement dans deux niches du cerveau : la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux et le gyrus dentelé de l’hippocampe. En condition physiologique, le niveau de neurogenèse est relativement élevé dans la zone sous-ventriculaire contrairement à l’hippocampe où certaines étapes sont limitantes. En revanche, la moelle épinière est plutôt définie comme un environnement en quiescence. Une des principales questions qui a été soulevée suite à ces découvertes est : comment peut-on activer les CSNs adultes afin d’augmenter les niveaux de neurogenèse ? Dans l’hippocampe, la capacité de l’environnement enrichi (incluant la stimulation cognitive, l’exercice et les interactions sociales) à promouvoir la neurogenèse hippocampale a déjà été démontrée. La plasticité de cette région est importante, car elle peut jouer un rôle clé dans la récupération de déficits au niveau de la mémoire et l’apprentissage. Dans la moelle épinière, des études effectuées in vitro ont démontré que les cellules épendymaires situées autour du canal central ont des capacités d’auto-renouvellement et de multipotence (neurones, astrocytes, oligodendrocytes). Il est intéressant de noter qu’in vivo, suite à une lésion de la moelle épinière, les cellules épendymaires sont activées, peuvent s’auto-renouveller, mais peuvent seulement ii donner naissance à des cellules de type gliale (astrocytes et oligodendrocytes). Cette nouvelle fonction post-lésion démontre que la plasticité est encore possible dans un environnement en quiescence et peut être exploité afin de développer des stratégies de réparation endogènes dans la moelle épinière. Les CSNs adultes jouent un rôle important dans le maintien des fonctions physiologiques du cerveau sain et dans la réparation neuronale suite à une lésion. Cependant, il y a peu de données sur les mécanismes qui permettent l'activation des CSNs en quiescence permettant de maintenir ces fonctions. L'objectif général est d'élucider les mécanismes sous-jacents à l'activation des CSNs dans le système nerveux central adulte. Pour répondre à cet objectif, nous avons mis en place deux approches complémentaires chez les souris adultes : 1) L'activation des CSNs hippocampales par l'environnement enrichi (EE) et 2) l'activation des CSNs de la moelle épinière par la neuroinflammation suite à une lésion. De plus, 3) afin d’obtenir plus d’information sur les mécanismes moléculaires de ces modèles, nous utiliserons des approches transcriptomiques afin d’ouvrir de nouvelles perspectives. Le premier projet consiste à établir de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires à travers lesquels l’environnement enrichi module la plasticité du cerveau adulte. Nous avons tout d’abord évalué la contribution de chacune des composantes de l’environnement enrichi à la neurogenèse hippocampale (Chapitre II). L’exercice volontaire promeut la neurogenèse, tandis que le contexte social augmente l’activation neuronale. Par la suite, nous avons déterminé l’effet de ces composantes sur les performances comportementales et sur le transcriptome à l’aide d’un labyrinthe radial à huit bras afin d’évaluer la mémoire spatiale et un test de reconnaissante d’objets nouveaux ainsi qu’un RNA-Seq, respectivement (Chapitre III). Les coureurs ont démontré une mémoire spatiale de rappel à court-terme plus forte, tandis que les souris exposées aux interactions sociales ont eu une plus grande flexibilité cognitive à abandonner leurs anciens souvenirs. Étonnamment, l’analyse du RNA-Seq a permis d’identifier des différences claires dans l’expression des transcripts entre les coureurs de courte et longue distance, en plus des souris sociales (dans l’environnement complexe). iii Le second projet consiste à découvrir comment les cellules épendymaires acquièrent les propriétés des CSNs in vitro ou la multipotence suite aux lésions in vivo (Chapitre IV). Une analyse du RNA-Seq a révélé que le transforming growth factor-β1 (TGF-β1) agit comme un régulateur, en amont des changements significatifs suite à une lésion de la moelle épinière. Nous avons alors confirmé la présence de cette cytokine suite à la lésion et caractérisé son rôle sur la prolifération, différentiation, et survie des cellules initiatrices de neurosphères de la moelle épinière. Nos résultats suggèrent que TGF-β1 régule l’acquisition et l’expression des propriétés de cellules souches sur les cellules épendymaires provenant de la moelle épinière.