28 resultados para ELECTROSPRAY IONIZATION TANDEM MASS SPECTROMETRY (ESI-MSn)
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Thse ralise en cotutelle avec Michle Prvost (Ph.D), Professeure titulaire au dpartement des gnies civil, gologique et des mines de l'cole Polytechnique de Montral.
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Ce projet de maitrise implique le dveloppement et loptimisation de deux mthodes utilisant la chromatographie liquide haute performance couple la spectromtrie de masse en tandem (HPLC-MS/MS). L'objectif du premier projet tait de sparer le plus rapidement possible, simultanment, 71 mdicaments traitant la dysfonction rectile (ED) et 11 ingrdients naturels parfois retrouvs avec ces mdicaments dans les chantillons suspects dtre adultrs ou contrefaits. L'objectif du deuxime projet tait de dvelopper une mthode de dpistage permettant l'analyse rapide simultane de 24 cannabinodes synthtiques et naturels pour une grande varit d'chantillons tels que les mlanges base de plantes, des btons d'encens, de srums et de cannabis. Dans les deux projets, la sparation a t ralise en moins de 10 min et cela en utilisant une colonne C18 noyau solide 100 x 2,1 mm avec des particules de 2,6 m de diamtre couple un systme MS avec trappe ionique orbitale fonctionnant en lectronbulisation positive. En raison du nombre lev de composs dans les deux mthodes et de lmergence de nouveaux analogues sur le march qui pourraient tre prsents dans les chantillons futurs, une mthode de dpistage LC-MS/MS cible/non-cible a t dveloppe. Pour les deux projets, les limites de dtection taient sous les ng/mL et la variation de la prcision et de lexactitude taient infrieures de 10,5%. Le taux de recouvrement partir des chantillons rels variait entre 92 111%. Linnovation des mthodes LC-MS/MS dveloppes au cours des projets est que le spectre de masse obtenu en mode balayage lors de l'acquisition, fournit une masse exacte pour tous les composs dtects et permet l'identification des composs initialement non-cibls, comme des nouveaux analogues. Cette innovation amne une dimension supplmentaire aux mthodes traditionnellement utilises, en permettant une analyse haute rsolution sur la masse de composs non-cibls.
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In recent years, we observed a significant increase of food fraud ranging from false label claims to the use of additives and fillers to increase profitability. Recently in 2013, horse and pig DNA were detected in beef products sold from several retailers. Mass spectrometry has become the workhorse in protein research and the detection of marker proteins could serve for both animal species and tissue authentication. Meat species authenticity will be performed using a well defined proteogenomic annotation, carefully chosen surrogate tryptic peptides and analysis using a hybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer. Selected mammalian meat samples were homogenized, proteins were extracted and digested with trypsin. The samples were analyzed using a high-resolution mass spectrometer. The chromatography was achieved using a 30 minutes linear gradient along with a BioBasic C8 100 1 mm column at a flow rate of 75 L/min. The mass spectrometer was operated in full-scan high resolution and accurate mass. MS/MS spectra were collected for selected proteotypic peptides. Muscular proteins were methodically analyzed in silico in order to generate tryptic peptide mass lists and theoretical MS/MS spectra. Following a comprehensive bottom-up proteomic analysis, we were able to detect and identify a proteotypic myoglobin tryptic peptide [120-134] for each species with observed m/z below 1.3 ppm compared to theoretical values. Moreover, proteotypic peptides from myosin-1, myosin-2 and -hemoglobin were also identified. This targeted method allowed a comprehensive meat speciation down to 1% (w/w) of undesired product.
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Les cyanobactries ont une place trs importante dans les cosystmes aquatiques et un nombre important despces considr comme nuisible de par leur production de mtabolites toxiques. Ces cyanotoxines possdent des proprits trs varies et ont souvent t associes des pisodes dempoisonnement. Laugmentation des pisodes defflorescence dorigine cyanobactriennes et le potentiel quils augmentent avec les changements climatiques a renchri lintrt de ltude des cyanobactries et de leurs toxines. Considrant la complexit chimique des cyanotoxines, le dveloppement de mthodes de dtection simples, sensibles et rapides est toujours considr comme tant un dfi analytique. Considrant ces dfis, le dveloppement de nouvelles approches analytiques pour la dtection de cyanotoxines dans leau et les poissons ayant t contamins par des efflorescences cyanobactriennes nuisibles a t propos. Une premire approche consiste en lutilisation dune extraction sur phase solide en ligne couple une chromatographie liquide et une dtection en spectromtrie de masse en tandem (SPE-LC-MS/MS) permettant lanalyse de six analogues de microcystines (MC), de lanatoxine (ANA-a) et de la cylindrospermopsine (CYN). La mthode permet une analyse simple et rapide et ainsi que la sparation chromatographique dANA-a et de son interfrence isobare, la phnylalanine. Les limites de dtection obtenues se trouvaient entre 0,01 et 0,02 g L-1 et des concentrations retrouves dans des eaux de lacs du Qubec se trouvaient entre 0,024 et 36 g L-1. Une deuxime mthode a permis lanalyse du b-N-mthylamino-L-alanine (BMAA), dANA-a, de CYN et de la saxitoxine (STX) dans les eaux de lac contamins. Lanalyse de deux isomres de conformation du BMAA a t effectue afin damliorer la slectivit de la dtection. Lutilisation dune SPE manuelle permet la purification et prconcentration des chantillons et une drivatisation base de chlorure de dansyle permet une chromatographie simplifie. Lanalyse effectue par LC couple la spectromtrie de masse haute rsolution (HRMS) et des limites de dtections ont t obtenues entre 0,007 et 0,01 g L-1. Des chantillons rels ont t analyss avec des concentrations entre 0,01 et 0,3 g L-1 permettant ainsi la confirmation de la prsence du BMAA dans les efflorescences de cyanobactries au Qubec. Un deuxime volet du projet consiste en lutilisation dune technologie dintroduction dchantillon permettant des analyses ultra-rapides (< 15 secondes/chantillons) sans tape chromatographique, la dsorption thermique diode laser (LDTD) couple lionisation chimique pression atmosphrique (APCI) et la spectromtrie de masse (MS). Un premier projet consiste en lanalyse des MC totales par lintermdiaire dune oxydation de Lemieux permettant un bris de la molcule et obtenant une fraction commune aux multiples congnres existants des MC. Cette fraction, le MMPB, est analyse, aprs une extraction liquide-liquide, par LDTD-APCI-MS/MS. Une limite de dtection de 0,2 g L-1 a t obtenue et des concentrations entre 1 et 425 g L-1 ont t trouves dans des chantillons deau de lac contamins du Qubec. De plus, une analyse en parallle avec des talons pour divers congnres des MC a permis de suggrer la possible prsence de congnres ou disomres non dtects. Un deuxime projet consiste en lanalyse directe dANA-a par LDTD-APCI-HRMS pour rsoudre son interfrence isobare, la phnylalanine, grce la dtection haute rsolution. La LDTD noffre pas de sparation chromatographique et lutilisation de la HRMS permet de distinguer les signaux dANA-a de ceux de la phnylalanine. Une limite de dtection de 0,2 g L-1 a t obtenue et la mthode a t applique sur des chantillons rels deau avec un chantillon positif en ANA-a avec une concentration de 0,21 g L-1. Finalement, laide de la LDTD-APCI-HRMS, lanalyse des MC totales a t adapte pour la chair de poisson afin de dterminer la fraction libre et lie des MC et comparer les rsultats avec des analyses conventionnelles. Lutilisation dune digestion par hydroxyde de sodium prcdant loxydation de Lemieux suivi dune purification par SPE a permis dobtenir une limite de dtection de 2,7 g kg-1. Des chantillons de poissons contamins ont t analyss, on a retrouv des concentrations en MC totales de 2,9 et 13,2 g kg-1 comparativement aux analyses usuelles qui avaient dmontr un seul chantillon positif 2 g kg-1, indiquant la possible prsence de MC non dtects en utilisant les mthodes conventionnelles.
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Llevage des porcs reprsente une source importante de dversement dantibiotiques dans lenvironnement par lintermdiaire de lpandage du lisier qui contient une grande quantit de ces molcules sur les champs agricoles. Il a t prouv que ces molcules biologiquement actives peuvent avoir un impact toxique sur lcosystme. Par ailleurs, elles sont aussi suspectes dengendrer des problmes sanitaires et de contribuer la rsistance bactrienne pouvant mener des infections difficilement traitables chez les humains. Le contrle de ces substances dans lenvironnement est donc ncessaire. De nombreuses mthodes analytiques sont proposes dans la littrature scientifique pour recenser ces composs dans plusieurs types de matrice. Cependant, peu de ces mthodes permettent lanalyse de ces contaminants dans des matrices issues de llevage agricole intensif. Par ailleurs, les mthodes analytiques disponibles sont souvent sujettes des faux positifs compte tenu de la complexit des matrices tudies et du matriel utilis et ne prennent souvent pas en compte les mtabolites et produits de dgradation. Enfin, les niveaux danalyse atteints avec ces mthodes ne sont parfois plus jour tant donn lvolution de la chimie analytique et de la spectromtrie de masse. Dans cette optique, de nouvelles mthodes danalyses ont t dveloppes pour rechercher et quantifier les antibiotiques dans des matrices drives de llevage intensif des porcs en essayant de proposer des approches alternatives sensibles, slectives et robustes pour quantifier ces molcules. Une premire mthode danalyse base sur une technique dintroduction dchantillon alternative laide dune interface fonctionnant laide dune dsorption thermique par diode laser munie dune source ionisation pression atmosphrique, couple la spectromtrie de masse en tandem a t dveloppe. Lobjectif est de proposer une analyse plus rapide tout en atteignant des niveaux de concentration adapts la matrice tudie. Cette technique danalyse couple un traitement dchantillon efficace a permis lanalyse de plusieurs antibiotiques vtrinaires de diffrentes classes dans des chantillons de lisier avec des temps danalyse courts. Les limites de dtection atteintes sont comprises entre 2,5 et 8,3 g kg-1 et sont comparables avec celles pouvant tre obtenues avec la chromatographie liquide dans une matrice similaire. En vue danalyser simultanment une srie de ttracyclines, une deuxime mthode danalyse utilisant la chromatographie liquide couple la spectromtrie de masse haute rsolution (HRMS) a t propose. Lutilisation de la HRMS a t motive par le fait que cette technique danalyse est moins sensible aux faux positifs que le triple quadriple traditionnel. Des limites de dtection comprises entre 1,5 et 3,6 g kg-1 ont t atteintes dans des chantillons de lisier en utilisant un mode danalyse par fragmentation. Lutilisation de mthodes de quantifications cibles est une dmarche intressante lorsque la prsence de contaminants est suspecte dans un chantillon. Toutefois, les contaminants non intgrs cette mthode danalyse cible ne peuvent tre dtects mme de fortes concentrations. Dans ce contexte, une mthode danalyse non cible a t dveloppe pour la recherche de pharmaceutiques vtrinaires dans des effluents agricoles en utilisant la spectromtrie de masse haute rsolution et une cartouche SPE polymrique polyvalente. Cette mthode a permis lidentification dantibiotiques et de pharmaceutiques couramment utiliss dans llevage porcin. La plupart des mthodes danalyse disponibles dans la littrature se concentrent sur lanalyse des composs parents, mais pas sur les sous-produits de dgradation. Lapproche utilise dans la deuxime mthode danalyse a donc t tendue et applique dautres classes dantibiotiques pour mesurer les concentrations de plusieurs rsidus dantibiotiques dans les sols et les eaux de drainage dun champ agricole exprimental. Les sols du champ renfermaient un mlange dantibiotiques ainsi que leurs produits de dgradation relatifs des concentrations mesures jusqu 1020 g kg-1. Une partie de ces composs ont voyag par lintermdiaire des eaux de drainage du champ ou des concentrations pouvant atteindre 3200 ng L-1 ont pu tre releves.
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Dynorphins are important neuropeptides with a central role in nociception and pain alleviation. Many mechanisms regulate endogenous dynorphin concentrations, including proteolysis. Proprotein convertases (PCs) are widely expressed in the central nervous system and specifically cleave at C-terminal of either a pair of basic amino acids, or a single basic residue. The proteolysis control of endogenous Big Dynorphin (BDyn) and Dynorphin A (Dyn A) levels has a profound impact on pain perception and the role of PCs remain unclear. The objective of this study was to decipher the role of PC1 and PC2 in the proteolysis control of BDyn and Dyn A levels using cellular fractions of spinal cords from wild type (WT), PC1-/+ and PC2-/+ animals and mass spectrometry. Our results clearly demonstrate that both PC1 and PC2 are involved in the proteolysis regulation of BDyn and Dyn A with a more important role for PC1. C-terminal processing of BDyn generates specific peptide fragments Dynorphin 1-19, Dynorphin 1-13, Dynorphin 1-11 and Dynorphin 1-7 and C-terminal processing of Dyn A generates Dynorphin 1-13, Dynorphin 1-11 and Dynorphin 1-7, all these peptide fragments are associated with PC1 or PC2 processing. Moreover, proteolysis of BDyn leads to the formation of Dyn A and Leu-Enk, two important opioid peptides. The rate of formation of both is significantly reduced in cellular fractions of spinal cord mutant mice. As a consequence, even partial inhibition of PC1 or PC2 may impair the endogenous opioid system.
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Dans les dernires annes, les perturbateurs endocriniens ont t observs dans les rivires qui reoivent des entres importantes deaux uses. Parmi les perturbateurs endocriniens, les hormones strodiennes naturelles et synthtiques sont des composs dont le potentiel d'imiter ou d'interfrer avec les fonctions hormonales normales (dveloppement, croissance et reproduction), est reconnu mme au niveau ultra-traces (ng L-1). Bien que les hormones conjugues soient moins actives que les hormones libres, elles peuvent tre clives et redevenir libres une fois exposes aux processus microbiens avant ou pendant le traitement des eaux uses. En raison de la ncessit d'identifier et de quantifier ces composs dans l'eau, une nouvelle mthode, entirement automatise, a t dveloppe pour la dtermination simultane des deux formes de plusieurs hormones strodiennes (conjugues et libres) dans les matrices d'eau et dans lurine des femmes. La mthode est base sur l'extraction en phase solide couple en ligne la chromatographie liquide et la spectromtrie de masse en tandem (SPE-LC-MS/MS). Plusieurs paramtres ont t valus dans le but d'optimiser l'efficacit de la mthode, tels que le type et le dbit de la phase mobile, des diffrentes colonnes de SPE et de chromatographie, ainsi que diffrentes sources et modes d'ionisation des chantillons pour la MS. La mthode dmontre une bonne linarit (R2 > 0.993), ainsi qu'une prcision avec un coefficient de variance infrieure 10%. Les limites de quantification varient dun minimum de 3 15 ng L-1 pour un volume d'injection entre 1 mL et 5 mL et le recouvrement des composs varie de 72 % 117 %.
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Thse numrise par la Direction des bibliothques de l'Universit de Montral.
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Les agents anti-infectieux sont utiliss pour traiter ou prvenir les infections chez les humains, les animaux, les insectes et les plantes. Lapparition de traces de ces substances dans les eaux uses, les eaux naturelles et mme leau potable dans plusieurs pays du monde soulve linquitude de la communaut scientifique surtout cause de leur activit biologique. Le but de ces travaux de recherche a t dtudier la prsence danti-infectieux dans les eaux environnementales contamines (c.--d. eaux uses, eaux naturelles et eau potable) ainsi que de dvelopper de nouvelles mthodes analytiques capables de quantifier et confirmer leur prsence dans ces matrices. Une mta-analyse sur loccurrence des anti-infectieux dans les eaux environnementales contamines a dmontr quau moins 68 composs et 10 de leurs produits de transformation ont t quantifis ce jour. Les concentrations environnementales varient entre 0.1 ng/L et 1 mg/L, selon le compos, la matrice et la source de contamination. Daprs cette tude, les effets nuisibles des anti-infectieux sur le biote aquatique sont possibles et ces substances peuvent aussi avoir un effet indirect sur la sant humaine cause de sa possible contribution la dissmination de la rsistance aux anti-infecteiux chez les bactries. Les premiers tests prliminaires de dveloppement dune mthode de dtermination des anti-infectieux dans les eaux uses ont montr les difficults surmonter lors de lextraction sur phase solide (SPE) ainsi que limportance de la slectivit du dtecteur. On a dcrit une nouvelle mthode de quantification des anti-infectieux utilisant la SPE en tandem dans le mode manuel et la chromatographie liquide couple la spectromtrie de masse en tandem (LC-MS/MS). Les six anti-infectieux cibls (sulfamthoxazole, trimthoprime, ciprofloxacin, levofloxacin, clarithromycin et azithromycin) ont t quantifis des concentrations entre 39 et 276 ng/L dans les chantillons daffluent et deffluent provenant dune station dpuration appliquant un traitement primaire et physico- chimique. Les concentrations retrouves dans les effluents indiquent que la masse moyenne totale de ces substances, dverses hebdomadairement dans le fleuve St. Laurent, tait de ~ 2 kg. En vue de rduire le temps total danalyse et simplifier les manipulations, on a travaill sur une nouvelle mthode de SPE couple-LC-MS/MS. Cette mthode a utilis une technique de permutation de colonnes pour prconcentrer 1.00 mL dchantillon dans une colonne de SPE couple. La performance analytique de la mthode a permis la quantification des six anti-infectieux dans les eaux uses municipales et les limites de dtection taient du mme ordre de grandeur (13-60 ng/L) que les mthodes bases sur la SPE manuelle. Ensuite, lapplication des colonnes de SPE couple de chromatographie dbit turbulent pour la prconcentration de six anti-infectieux dans les eaux uses a t explore pour diminuer les effets de matrice. Les rsultats obtenus ont indiqu que ces colonnes sont une solution de rchange intressante aux colonnes de SPE couple traditionnelles. Finalement, en vue de permettre lanalyse des anti-infectieux dans les eaux de surface et leau potable, une mthode SPE couple-LC-MS/MS utilisant des injections de grand volume (10 mL) a t dveloppe. Le volume de fuite de plusieurs colonnes de SPE couple a t estim et la colonne ayant la meilleure rtention a t choisie. Les limites de dtection et de confirmation de la mthode ont t entre 1 6 ng/L. Lanalyse des chantillons rels a dmontr que la concentration des trois anti-infectieux cibls (sulfamthoxazole, trimthoprime et clarithromycine) tait au dessous de la limite de dtection de la mthode. La mesure des masses exactes par spectromtrie de masse temps denvol et les spectres des ions produits utilisant une pente dnergie de collision inverse dans un spectromtre de masse triple quadriple ont t explors comme des mthodes de confirmation possibles.
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Les biomarqueurs plasmatiques constituent des outils essentiels, mais rares, utiliss pour diagnostiquer les maladies, comme les maladies cardiovasculaires (MCV), et stratifier le niveau de risque associ. Lidentification de nouveaux biomarqueurs plasmatiques susceptibles damliorer le dpistage et le suivi des MCV reprsente ainsi un enjeu majeur en termes dconomie et de sant publique. Le projet vise identifier de nouveaux biomarqueurs plasmatiques prdictifs ou diagnostiques des MCV, dterminer le profil protomique plasmatique de patients atteints de MCV et dvelopper des mthodes innovantes danalyse dchantillon plasmatique. Ltude a t effectue sur une large banque de plasma provenant de 1006 individus de souche Canadienne-Franaise recruts diffrents stades de la MCV et qui ont t suivis sur une priode de 5 ans. Des sries de dpltions ont t ralises afin de dplter les 14 protines majoritaires (colonne IgY14TM) de lchantillon avant son analyse par trois approches effectues en parallle: 1) Une chromatographie liquide (LC) en 2 dimensions qui fractionne les protines selon le point isolectrique puis selon le degr dhydrophobicit, via le systme PF2D, suivie par une chromatographie liquide couple avec une spectromtrie de masse en tandem (LC-MS/MS). 2) Une sparation classique sur gel 1D-SDS-PAGE suivie dune LC-MS/MS; 3) Par une dpltion plus pousse du plasma avec lutilisation en tandem avec la colonne IgY14TM dune colonne SupermixTM permettant de dplter galement les protines de moyenne abondance, suivie dune sparation sur gel 1D-SDS-PAGE et dune analyse LC-MS/MS de la portion dplte (3a) et de la portion lie la SupermixTM (3b). Les rsultats montrent que le systme PF2D permet didentifier plusieurs profils protiques spcifiques au groupe MCV. Sur un total de 1156 fractions (quivalent 1172 pics protiques pour le groupe contrle et 926 pics pour le groupe MCV) recueillies, 15 fractions (23 pics protiques) prsentaient des diffrences quantitativement significatives (p<0,05) entre les 2 groupes. De plus, 6 fractions (9 pics) sont uniquement prsentes dans un groupe, reprsentant dautres signatures protomiques et biomarqueurs potentiellement intressants. Les mthodes 2, 3a et 3b ont permis lidentification de 108, 125 et 91 protines respectivement avec des chevauchements partiels (31% entre la mthode 2 et 3a, 61% entre 2 et 3b et 19% entre 3a et 3b). Les mthodes 2 et 3 ont permis lidentification de 12 protines qui prsentaient des diffrences quantitatives significatives entre les 2 groupes. Lutilisation de plusieurs approches protomiques complmentaires nous ont dores et dj permis didentifier des candidats biomarqueurs des angines instables avec rcidive dinfarctus du myocarde (IM).
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Mmoire numris par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Universit de Montral
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Le mthotrexate (MTX), un agent anti-cancreux frquemment utilis en chimiothrapie, requiert gnralement un suivi thrapeutique de la mdication (Therapeutic Drug Monitoring, TDM) pour surveiller son niveau sanguin chez le patient afin de maximiser son efficacit tout en limitant ses effets secondaires. Malgr la fentre thrapeutique troite entre lefficacit et la toxicit, le MTX reste, ce jour, un des agents anti-cancreux les plus utiliss au monde. Les techniques analytiques existantes pour le TDM du MTX sont coteuses, requirent temps et efforts, sans ncessairement fournir promptement les rsultats dans le dlai requis. Afin dacclrer le processus de dosage du MTX en TDM, une stratgie a t propose base sur un essai comptitif caractris principalement par le couplage plasmonique dune surface mtallique et de nanoparticules dor. Plus prcisment, lessai quantitatif exploite la raction de comptition entre le MTX et une nanoparticule dor fonctionnalise avec lacide folique (FA-AuNP) ayant une affinit pour un rcepteur molculaire, la rductase humaine de dihydrofolate (hDHFR), une enzyme associe aux maladies prolifratives. Le MTX libre mix avec les FA-AuNP, entre en comptition pour les sites de liaison de hDHFR immobiliss sur une surface active en SPR ou libres en solution. Par la suite, les FA-AuNP lies au hDHFR fournissent une amplification du signal qui est inversement proportionnelle la concentration de MTX. La rsonance des plasmons de surface (SPR) est gnralement utilise comme une technique spectroscopique pour linterrogation des interactions biomolculaires. Les instruments SPR commerciaux sont gnralement retrouvs dans les grands laboratoires danalyse. Ils sont galement encombrants, coteux et manquent de slectivit dans les analyses en matrice complexe. De plus, ceux-ci nont pas encore dmontr de ladaptabilit en milieu clinique. Par ailleurs, les analyses SPR des petites molcules comme les mdicaments nont pas t explors de manire intensive d au dfi pos par le manque de la sensibilit de la technique pour cette classe de molcules. Les dveloppements rcents en science des matriaux et chimie de surfaces exploitant lintgration des nanoparticules dor pour lamplification de la rponse SPR et la chimie de surface peptidique ont dmontr le potentiel de franchir les limites poses par le manque de sensibilit et ladsorption non-spcifique pour les analyses directes dans les milieux biologiques. Ces nouveaux concepts de la technologie SPR seront incorpors un systme SPR miniaturis et compact pour excuter des analyses rapides, fiables et sensibles pour le suivi du niveau du MTX dans le srum de patients durant les traitements de chimiothrapie. Lobjectif de cette thse est dexplorer diffrentes stratgies pour amliorer lanalyse des mdicaments dans les milieux complexes par les biocapteurs SPR et de mettre en perspective le potentiel des biocapteurs SPR comme un outil utile pour le TDM dans le laboratoire clinique ou au chevet du patient. Pour atteindre ces objectifs, un essai comptitif colorimtrique bas sur la rsonance des plasmons de surface localise (LSPR) pour le MTX fut tabli avec des nanoparticules dor marques avec du FA. Ensuite, cet essai comptitif colorimtrique en solution fut adapt une plateforme SPR. Pour les deux essais dvelopps, la sensibilit, slectivit, limite de dtection, loptimisation de la gamme dynamique et lanalyse du MTX dans les milieux complexes ont t inspects. De plus, le prototype de la plateforme SPR miniaturise fut valid par sa performance quivalente aux systmes SPR existants ainsi que son utilit pour analyser les chantillons cliniques des patients sous chimiothrapie du MTX. Les concentrations de MTX obtenues par le prototype furent compares avec des techniques standards, soit un essai immunologique bas sur la polarisation en fluorescence (FPIA) et la chromatographie liquide couple avec de la spectromtrie de masse en tandem (LC-MS/MS) pour valider lutilit du prototype comme un outil clinique pour les tests rapides de quantification du MTX. En dernier lieu, le dploiement du prototype un laboratoire de biochimie dans un hpital dmontre lnorme potentiel des biocapteurs SPR pour utilisation en milieux clinique.
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La transglutaminase tissulaire est une enzyme dpendante du calcium qui catalyse la formation de liens isopeptidiques, entre les chanes latrales de rsidus glutamine et lysine, permettant, par le fait mme, la rticulation des protines dans les systmes biologiques. Elle joue un rle, entre autres, dans lendocytose, la rgulation du dveloppement des cellules, et mme dans lapoptose. Nanmoins, une drgulation de lactivit biologique de cette enzyme peut entrainer diffrentes pathologies, comme la formation de cataractes, de plaques amylodes dans la maladie dAlzheimer, ou encore peut mener au dveloppement de la maladie cliaque. Cest pourquoi une meilleure connaissance du mcanisme daction de cette enzyme et la possibilit de rguler son action laide de substrats ou dinhibiteurs sont ncessaires. Dans cette optique, une mthode dexpression et de purification de la transglutaminase humaine a t dveloppe, permettant de travailler directement avec la cible pharmacologique dsire. De plus, une tude du mode dinhibition et de liaison dune classe dinhibiteurs rversibles prcdemment dcouverte dans le groupe, soit la famille des trans-cinnamoyles, a permis didentifier que la puissance de ces molcules est influence par la prsence du calcium et quune inhibition dpendante du temps est observe, en lien avec un potentiel quilibre conformationnel lent de la transglutaminase. Dun autre ct, la susceptibilit une attaque nuclophile par des thiols de cette classe de molcule rend leur potentiel pharmacologique grandement diminu, et cest pourquoi une nouvelle famille de molcules a t identifie, base sur un squelette ynone, avec une valeur dIC50 trs prometteuse de 2,6 M, en faisant un des meilleurs inhibiteurs rversibles de la transglutaminase dvelopps ce jour. Finalement, une stratgie de photomarquage jumele une analyse de spectromtrie de masse en tandem a t dveloppe pour la dcouverte du site de liaison du substrat driv de la lysine, dans le but de mieux comprendre le mcanisme complexe de cette enzyme.
