30 resultados para CA2 ATPASES
Resumo:
La fibrillation auriculaire (FA) est le trouble du rythme le plus frquemment observ en pratique clinique. Elle constitue un risque important de morbi-mortalit. Le traitement de la FA reste un dfi majeur en lien avec les nombreux effets secondaires associs aux approches thrapeutiques actuelles. Dans ce contexte, une meilleure comprhension des mcanismes sous-jacents la FA est essentielle pour le dveloppement de nouvelles thrapies offrant un meilleur rapport bnfice/risque pour les patients. La FA est caractrise par i) un remodelage lectrique dltre associ le plus souvent ii) un remodelage structurel du myocarde favorisant la rcurrence et le maintien de larythmie. La diminution de la priode rfractaire effective au sein du tissu auriculaire est un lment clef du remodelage lectrique. Le remodelage structurel, quant lui, se manifeste principalement par une fibrose tissulaire qui altre la propagation de linflux lectrique dans les oreillettes. Les mcanismes molculaires impliqus dans la mise en place de ces deux substrats restent mal connus. Rcemment, le rle des microARNs (miARNs) a t point du doigt dans de nombreuses pathologies notamment cardiaques. Dans ce contexte les objectifs principaux de ce travail ont t i) d'acqurir une comprhension approfondie du rle des miARNs dans la rgulation de lexpression des canaux ioniques et ii) de mieux comprendre le rle de ces molcules dans linstallation dun substrat favorable a la FA. Nous avons, dans un premier temps, effectu une analyse bio-informatique combine des approches exprimentales spcifiques afin didentifier clairement les miARNs dmontrant un fort potentiel de rgulation des gnes codant pour lexpression des canaux ioniques cardiaques humains. Nous avons identifi un nombre limit de miARNs cardiaques qui possdaient ces proprits. Sur la base de ces rsultats, nous avons dmontr que laltration de l'expression des canaux ioniques, observe dans diverse maladies cardiaques (par exemple, les cardiomyopathies, lischmie myocardique, et la fibrillation auriculaire), peut tre soumise ces miARNs suggrant leur implication dans larythmognse. La rgulation du courant potassique IK1 est un facteur dterminant du remodelage lectrique auriculaire associe la FA. Les mcanismes molculaires sous-jacents sont peu connus. Nous avons mis lhypothse que l'altration de lexpression des miARNs soit corrle laugmentation de lexpression dIK1 dans la FA. Nous avons constat que lexpression de miR-26 est rduite dans la FA et quelle rgule IK1 en modulant lexpression de sa sous-unit Kir2.1. Nous avons dmontr que miR-26 est sous la rpression transcriptionnelle du facteur nuclaire des lymphocytes T activs (NFAT) et que lactivit accrue de NFATc3/c4, aboutit une expression rduite de miR-26. En consquence IK1 augmente lors de la FA. Nous avons enfin dmontr que linterfrence in vivo de miR-26 influence la susceptibilit la FA en rgulant IK1, confirmant le rle prpondrant de miR-26 dans le remodelage auriculaire lectrique. La fibrose auriculaire est un constituant majeur du remodelage structurel associ la FA, impliquant l'activation des fibroblastes et linflux cellulaire du Ca2 +. Nous avons cherch dterminer i) si le canal permable au Ca2+, TRPC3, jouait un rle dans la fibrose auriculaire en favorisant l'activation des fibroblastes et ii) tudi le rle potentiel des miARNs dans ce contexte. Nous avons dmontr que les canaux TRPC3 favorisent linflux du Ca2 +, activant la signalisation Ca2 +-dpendante ERK et en consquence activent la prolifration des fibroblastes. Nous avons galement dmontr que lexpression du TRPC3 est augmente dans la FA et que le blocage in vivo de TRPC3 empche le dveloppement de substrats relis la FA. Nous avons par ailleurs valid que miR-26 rgule les canaux TRPC3 en diminuant leur expression dans les fibroblastes. Enfin, nous avons montr que l'expression rduite du miR-26 est galement due lactivit augmente de NFATc3/c4 dans les fibroblastes, expliquant ainsi laugmentation de TRPC3 lors de la FA, confirmant la contribution de miR-26 dans le processus de remodelage structurel li la FA. En conclusion, nos rsultats mettent en vidence l'importance des miARNs dans la rgulation des canaux ioniques cardiaques. Notamment, miR-26 joue un rle important dans le remodelage lectrique et structurel associ la FA et ce, en rgulant IK1 et lexpression du canal TRPC3. Notre tude dmasque ainsi un mcanisme molculaire de contrle de la FA innovateur associant des miARNs. miR-26 en particulier reprsente apres ces travaux une nouvelle cible thrapeutique prometteuse pour traiter la FA.
Resumo:
Hyperammonemia is a key factor in the pathogenesis of hepatic encephalopathy (HE) as well as other metabolic encephalopathies, such as those associated with inherited disorders of urea cycle enzymes and in Reye's syndrome. Acute HE results in increased brain ammonia (up to 5 mM), astrocytic swelling, and altered glutamatergic function. In the present study, using fluorescence imaging techniques, acute exposure (10 min) of ammonia (NH4+/NH3) to cultured astrocytes resulted in a concentration-dependent, transient increase in [Ca2+]i. This calcium transient was due to release from intracellular calcium stores, since the response was thapsigargin-sensitive and was still observed in calcium-free buffer. Using an enzyme-linked fluorescence assay, glutamate release was measured indirectly via the production of NADH (a naturally fluorescent product when excited with UV light). NH4+/NH3 (5 mM) stimulated a calcium-dependent glutamate release from cultured astrocytes, which was inhibited after preincubation with 1,2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid acetoxymethyl ester but unaffected after preincubation with glutamate transport inhibitors dihydrokainate and DL-threo-beta-benzyloxyaspartate. NH4+/NH3 (5 mM) also induced a transient intracellular alkaline shift. To investigate whether the effects of NH4+/NH3 were mediated by an increase in pH(i), we applied trimethylamine (TMA+/TMA) as another weak base. TMA+/TMA (5 mM) induced a similar transient increase in both pH(i) and [Ca2+]i (mobilization from intracellular calcium stores) and resulted in calcium-dependent release of glutamate. These results indicate that an acute exposure to ammonia, resulting in cytosolic alkalinization, leads to calcium-dependent glutamate release from astrocytes. A deregulation of glutamate release from astrocytes by ammonia could contribute to glutamate dysfunction consistently observed in acute HE.
Resumo:
Le tamoxifne, un modulateur slectif des rcepteurs oestrogniques, est un mdicament largement utilis depuis plus de vingt ans pour le traitement et la prvention du cancer du sein. Plusieurs tudes ont rapport que ladministration aigu du tamoxifne pouvait rduire certains courants K+ cardiaques. Cette observation suggre que les femmes traites de faon chronique avec le tamoxifne risquent davoir une prolongation de leur intervalle QT, favorisant ainsi le dveloppement de torsades de pointes. Puisque in vivo, le tamoxifne est largement mtabolis et son effet est attribu celui du 4hydroxy-tamoxifne (4OH-tamoxifne), nous avons d'abord vrifi si les effets du tamoxifne sur la repolarisation pouvaient tre dus au 4OH-tamoxifne. l'aide de la mthode de patch-clamp, nous avons tudi leffet aigu du 4OH-tamoxifne sur les courants K+ prsents au niveau ventriculaire chez la souris femelle. En premier lieu, nous avons dmontr que les souris traites avec le 4OH-tamoxifne prsentaient une diminution des courants K+ comparativement aux souris intactes. Fait intressant, le prtraitement des myocytes avec lantagoniste des rcepteurs oestrogniques, le ICI 182,780, ou linhibiteur de la synthse protique, l'actinomycine D, na pas modifi les effets du 4OH-tamoxifne. Ces rsultats suggraient que les effets du 4OH-tamoxifne sur les courants potassiques ne soient pas lis la transcription gnomique et nimplique pas les rcepteurs aux strognes. Bien que ladministration aigu du 4OH-tamoxifne diminue les courants K+ cardiaques, labsence de troubles au niveau du rythme cardiaque chez les femmes traites long terme exclu la possibilit de conclure que le traitement chronique avec le tamoxifne augmente la dure de lintervalle QT. L'accs des souris femelles et des cobayes nous a permis de dmontrer que contrairement au traitement en aigu, les courants et les canaux K+ cardiaques sont augments en chronique. Les oestrognes associs une diminution des courants K+ dune part et nos rsultats obtenus avec le tamoxifne dautre part suggrent quen bloquant les rcepteurs oestrogniques, le tamoxifne puisse prvenir les effets inhibiteurs des oestrognes sur les courants K+. Cette association strognes- tamoxifne- rcepteurs oestrogniques et courants K+ nous a encourages approfondir encore nos tudes et vrifier linfluence des hormones sexuelles fminines sur la repolarisation ventriculaire. Une troisime tude a t ainsi ralise chez des souris femelles ovariectomises et des souris dficientes en rcepteurs oestrogniques ou afin de vrifier le rle des oestrognes et des rcepteurs oestrogniques sur la repolarisation ventriculaire. Nos rsultats ont rvl clairement que labsence des oestrognes entrane une augmentation de la densit du courant K+ transitoire indpendant du Ca2+ (Ito) et de lexpression du canal Kv4.3 et ces effets sont mdis par les RE. Ces donnes soutiennent davantage notre conclusion que linhibition des rcepteurs oestrogniques est responsable de laugmentation des courants/canaux K+ et suggrent fortement quils jouent un rle dans la rgulation de la repolarisation ventriculaire. Elles soulignent aussi l'importance de vrifier le statut hormonal des animaux utiliss pour des tudes touchant l'lectrophysiologie cardiaque. Dans la dernire partie de cette thse nous avons vrifi les effets de la grossesse et du systme nerveux autonome sur les diffrents paramtres lectrocardiographiques et plus particulirement sur le rythme cardiaque chez la souris. Nos donnes ont montr que, comme chez la femme enceinte, la grossesse est associe une augmentation du rythme cardiaque. De plus, l'augmentation des niveaux des hormones fminines pourrait affecter lautomatisme et lactivit lectrique cardiaque. Ces diffrentes tudes ont augment les connaissances sur la rgulation hormonale de l'lectrophysiologie cardiaque et aideront aux avancements des recherches chez les femmes.
Resumo:
Les rcepteurs coupls aux protines G (RCPGs) reprsentent la plus grande famille de cibles thrapeutiques pour le traitement dune panoplie de pathologies humaines. Bien que plusieurs dcennies de recherche aient permis de faonner nos connaissances sur ces protines membranaires, notre comprhension des dterminants molculaires de leur activit signaltique reste encore limite. De ces domaines de recherche, une avance rcente a mis jour un nouveau phnomne, appel slectivit fonctionnelle des ligands, qui a boulevers les paradigmes dcrivant leu fonctionnement de ces rcepteurs. Ce concept mane dobservations montrant que lactivit pharmacologique de certains ligands nest pas ncessairement conserve sur tout le rpertoire signaltiques connu du rcepteur et peu se restreindre l'activation slective dun sous-groupe de voies de signalisation.Ce nouveau modle pharmacologique de l'activation des RCPG ouvre de nouvelles possibilits pour la dcouverte de mdicaments plus efficace et sr, ciblant les RCPGs. En effet, il permet la conception de molcules modulant spcifiquement les voies signaltiques dintrt thrapeutique, sans engager les autres voies qui pourraient mener des effets secondaires indsirables ou de la tolrance. Cette thse dcrit l'utilisation d'une nouvelle approche sans marquage, base sur la mesure du changement l'impdance cellulaire. Par la mesure des changements cellulaires, comme la morphologie, ladhsion et/ou la redistribution des macromolcules, cette approche permet de mesurer de faon simultane l'activit de plusieurs voies de signalisation impliqus dans ces rponses. Utilisant le rcepteur 2-adrnergique (2AR) comme modle, nous avons dmontr que les variations dans limpdance cellulaire taient directement lies lactivation de multiples voies de signalisation suite la stimulation du rcepteur par son ligand. Lagoniste type du 2AR, lisoprotrnol, sest avr induire une rponse dimpdance dose-dpendante constitue, dans le temps, de plusieurs caractristiques distinctes pouvant tre bloques de faon comptitive par lantagoniste ICI118,551 Par lutilisation dinhibiteurs slectifs, nous avons t en mesure de dterminer la contribution de plusieurs voies signaltiques canoniques, comme les voies dpendantes de Gs et Gi, la production dAMPc et lactivation de ERK1/2, sur ces changements. De plus, la dissection de la rponse dimpdance a permis didentifier une nouvelle voie de mobilisation du Ca2+ contribuant la rponse globale des changements initis par la stimulation du 2AR. Dans une autre tude, nous avons rapport que la rponse calcique induite par le 2AR serait attribuable une transactivation Gs-dpendant du rcepteur purinergique P2Y11, lui-mme coupl la protine Gq. La mesure dimpdance permettant de distinguer et de dcrire une pliade dactivits signaltiques, nous avons mis lhypothse que des ligands arborant des profils signaltiques diffrents gnreraient des rponses dimpdance distinctes. Le criblage dune librairie de ligands spcifiques au 2AR a rvl une grande varit de signatures dimpdance. Grce au dveloppement dune approche computationnelle innovatrice, nous avons t en mesure de regrouper ces signatures en cinq classes de composs, un regroupement qui sest avr hautement corrl avec le profil signaltique des diffrents ligands. Nous avons ensuite combin le criblage de composs par impdance avec lutilisation dinhibiteurs slectifs de voies signaltiques afin daugmenter la rsolution du regroupement. En valuant limpact dune voie signaltique donne sur la signature dimpdance, nous avons t en mesure de rvler une plus grande varit de textures parmi les ligands. De plus, cette mthode sest avre efficace pour prdire le profil signaltique dune librairie de composs non caractriss, ciblant le 2AR. Ces travaux ont men llaboration dune mthode permettant dexprimer visuellement la slectivit fonctionnelle de ligands et ont rvl de nouvelles classes de composs pour ce rcepteur. Ces nouvelles classes de composs ont ensuite t testes sur des cardiomyocytes humains, confirmant que les composs regroups dans diffrentes classes produisent des effets distincts sur la contractilit de ces cellules. Globalement, ces travaux dmontrent la pertinence de lutilisation de limpdance cellulaire pour une valuation prcise des diffrences fonctionnelles parmi les composs ciblant les RCPGs. En fournissant une reprsentation pluridimensionnelle de la signalisation manant des RCPGs laide dun seul essai ne requrant pas de marquage, les signatures dimpdance reprsentent une stratgie simple et innovante pour lvaluation de la fonctionnalit slective des ligands. Cette mthode pourrait tre dune grande utilit dans le processus de dcouverte de nouveaux mdicaments.
Resumo:
Lexplosion de la nanotechnologie a permis lintgration dune multitude de nanoparticules dans des produits de consommation. Les nanoparticules dargent (nAg) sont les plus utilises ces fins, selon les derniers recensements disponibles. La plupart des tudes toxicologiques, ce jour, ont fait tat de limplication trs vidente de lion Ag+ dans la toxicit aige des nAg; cependant, quelques tudes ont mis en vidence des effets toxicologiques dus aux nAg. Il y a un certain consensus propos dun risque de contamination des eaux douces via leur rejet par les effluents des rseaux daqueducs. Puisque les concentrations en Ag+ sont gnralement trs faibles dans les eaux douces (de lordre du pg L-1), de par la formation de complexes non-labiles avec des thiols (organiques et inorganiques) et des sulfures, la toxicit inhrente aux nAg pourrait ne pas tre ngligeable- comparativement aux tests en laboratoires. Cette tude sintressait donc aux mcanismes de bioaccumulation dargent par lalgue verte C. reinhardtii suite lexposition des nAg de 5 nm (enrobage dacide polyacrylique). La bioaccumulation dargent pour lexposition Ag+ servait de point de comparaison; galement, les abondances de lARNm de lisocitrate lyase 1 (ICL1) et de lARNm de Copper Transporter 2 (CTR2) taient mesures comme tmoins biologiques de la bioaccumulation de Ag+. Les expriences ont t menes en prsence dun tampon organique (NaHEPES, 2 x 10-2 M; Ca2+, 5x 10-5 M) pH de 7,00. Pour des expositions temps fixe de 2 heures, la bioaccumulation dargent pour nAg tait suprieure ce qui tait prdit par sa concentration initiale en Ag+; cependant, il ny avait pas de diffrence dabondance des ARNm de ICL1 et de CTR2 entre nAg et Ag+. Dun autre ct, pour une exposition temps variables, la bioaccumulation dargent pour nAg tait suprieure ce qui tait prdit par sa concentration initiale en Ag+ et une augmentation de labondance de lARNm de ICL1 tait note pour nAg. Cependant, il ny avait aucune diffrence significative au niveau de labondance de lARNm de CTR2 entre nAg et une solution quivalente en Ag+. Lajout dun fort ligand organique (L-Cystine; log K= 11,5) une solution de nAg en diminuait radicalement la bioaccumulation dargent par rapport nAg-sans ajout de ligand. Par contre, labondance des ARNm de ICL1 et de CTR2 taient stimules significativement par rapport une solution contrle non-expose nAg, ni Ag+. Les rsultats suggraient fortement que les nAg gnraient des ions Ag+ au contact de C. reinhardtii.
Resumo:
Le Costimulateur Inductible (ICOS) est un rcepteur exprim la surface des cellules T CD4 auxiliaires et T CD8 cytotoxiques. Il fut dmontr laide de modles murins de transplantation de moelle osseuse que ICOS joue un rle important dans linduction de la maladie du greffon contre lhte aigue (GVHD). ICOS potentialise deux signaux mdis par le rcepteur de cellules T (TCR) : lactivation de la phosphoinositide 3-kinase (PI3K) ainsi que la mobilisation interne de calcium. En conditions in vitro, dans les cellules CD4 et CD8, ICOS russi potentialiser le flux de calcium mdi par le TCR indpendamment de PI3K. La voie de signalisation de ICOS implique dans la GVHD demeure inconnue. Cependant, en utilisant une ligne de souris knock-in nomme ICOS-Y181F, dans laquelle le cellules T ont slectivement perdu la capacit dactiver PI3K par lentremise dICOS, nous avons dmontr que les cellules T peuvent utiliser un mcanisme ICOS indpendant de PI3K afin dinduire la GVHD. La mobilisation interne du Ca2+ mne lactivation de NFAT, un facteur de transcription cl rgulant des gnes comme IFN-, qui exprime une des cytokines cls impliques dans la GVHD. Nous mettons comme hypothse que la capacit pathognique intacte des cellules T ICOSY181F induire la GVHD, repose sur la signalisation du Ca2+ indpendante de PI3K. Le but de mon projet est didentifier les rsidus responsables de cette signalisation de Ca2+ mdie par ICOS ainsi que le mcanisme par lequel ce rcepteur fonctionne. laide de la mutagnse dirige, jai gnr des mutants dICOS et jai analys par cytomtrie en flux leur capacit activer le flux de Ca2+. Jai ainsi identifi un groupe de lysine sur la queue cytoplasmique dICOS situ proximit de la membrane comme tant essentiel la fonction de potentialisation du flux de Ca2+. Je fournis galement des preuves de limplication de la kinase Lck, membre de la famille de kinases Src, dans la voie de signalisation de ICOS mdiant la potentialisation du flux de Ca2+. Ainsi, ICOS sassocie Lck et mne une augmentation de lactivation de PLC1, la protine effectrice cl causant la sortie de Ca2+ de la rserve intracellulaire. En conclusion, notre tude permet de comprendre davantage une des voies de signalisation dICOS. Linflux de Ca2+ dans les cellules T implique la voie ICOS-Lck-PLC1. Une comprhension plus approfondie de cette voie de signalisation pourrait savrer bnfique afin dlaborer de nouvelles stratgies menant la prvention de maladies relies ICOS, comme la GVHD.
Resumo:
Connue pour son rle dans la cascade de coagulation, la thrombine, une protase srine, peut galement agir par lintermdiaire de PAR1, un rcepteur activ par protase et coupl aux protines G liant le GTP (GPCR). La thrombine se lie et clive lextrmit N-terminale du PAR1 entre lArg41 et la Ser42, exposant une nouvelle extrmit terminale qui agit elle-mme comme un ligand. La thrombine et une squence peptidique de cinq acides amins, compose des rsidus Ser42 Arg46, nomme PAR1-AP, dclenchent dans diverses cellules de mammifres une rponse intracellulaire comportant une composante calcique. Dans cette tude, le systme dexpression par baculovirus dans les cellules Sf9 d'insecte nous a permis d'exprimer le rcepteur PAR1 du rat la surface de ces cellules et de raliser son couplage fonctionnel leur signalisation intracellulaire (modle rPAR1-Sf9). La composante calcique de celle-ci, en rponse au PAR1-AP, a ensuite t tudie en dtail laide de la sonde fluorescente Fura-2 et de plusieurs inhibiteurs agissant sur les canaux calciques ou d'autres lments de la cascade de signalisation du calcium intracellulaire. Lorsque le milieu extracellulaire contient du calcium (Ca2+), la thrombine ou PAR1-AP dclenchent un signal calcique qui consiste en une augmentation rapide de [Ca2+]i suivi dun plateau relativement soutenu, puis d'un retour lent vers le niveau de base initial. En l'absence de Ca2+ dans le milieu extracellulaire, l'augmentation initiale rapide de [Ca2+]i est suivie d'un retour rapide vers le [Ca2+]i de base. laide dinhibiteurs de canaux calciques, tels que le lanthane, la nifdipine et le D-600, l'entre du calcium du milieu extracellulaire dans les cellules est inhibe, abolissant le plateau soutenu de [Ca2+]i. Linhibition de la pompe Ca2+-ATPase par la thapsigargine supprime la rponse au PAR1-AP aprs puisement des sites de stockage de Ca2+intracellulaire. Le TMB-8 agit de faon discordante quant linhibition de la libration de Ca2+ des sites de stockage intracellulaires. La rponse PAR1-AP nest pas affecte par le D-609, un inhibiteur de la phospholipase . Linhibition de la protine kinase C (PKC) par le bisindolylmalimide induit des oscillations en prsence de Ca2+ extracellulaire et attnue fortement le signal calcique en absence de Ca2+ extracellulaire. En prsence de Ca2+ extracellulaire, lactivation de la PKC par le PBDu tronque le flux de [Ca2+]i tandis que la rponse calcique est abolie en absence de Ca2+ dans le milieu extracellulaire. Le H-89, un inhibiteur de la protine kinase A (PKA), cause une prolongation de la dure du plateau de [Ca2+]i dans un milieu riche en calcium et la suppression de la rponse PAR1-AP lorsque le milieu extracellulaire est dpourvu de Ca2+. Les rsultats obtenus nous permettent de conclure que la PKC et possiblement la PKA jouent un rle critique dans la mobilisation du Ca2+ induite par le PAR1-AP dans le modle rPAR1-Sf9.
Resumo:
Le motif imidazole, un htrocycle 5 atomes contenant 2 atomes dazote et trois atomes de carbone, prsente des proprits physico-chimiques intressantes qui en font un compos de choix pour plusieurs applications. Parmi ces proprits, la fonctionnalisation simple des deux atomes dazote pour former un sel dimidazolium est trs intressante. Ces sels sont dexcellents prcurseurs de carbnes N-htrocycliques (NHC) et sont couramment utiliss pour synthtiser des ligands en vue dune utilisation en catalyse organomtallique. Dautre part, cette famille de composs possde des proprits anionophores permettant une utilisation en transport anionique. Le prsent travail contient les rsultats de travaux concernant ces deux domaines, soit la catalyse et le transport anionique. Dans un premier temps, les proprits de drivs de limidazole sont exploites pour former un catalyseur de type palladium-NHC qui est utilis pour catalyser la raction de Suzuki-Miyaura en milieu aqueux. Lefficacit de ce catalyseur a t dmontre en utilisant aussi peu que 0,001 mol% pour un rendement quantitatif. Il sagit de la premire occurrence dun processus htrogne et recyclable dans leau, utilisant un catalyseur de type Pd-NHC et qui ne ncessite aucun additif ou co-solvant. Le recyclage a t prouv jusqu 10 cycles sans diminution apparente de lactivit du catalyseur. Dans un second temps, plusieurs sels dimidazolium ont t tests en tant que transporteurs transmembranaires danions chlorures. Les proprits intrinsques des sels utiliss qui en font des transporteurs efficaces ont t lucides. Ainsi, les paramtres qui semblent affecter le plus le transport anionique sont le changement du contre-anion du sel dimidazolium de mme que la propension de ce dernier sauto-assembler via une succession dempilements-. De plus, les proprits du transport ont t lucides, montrant la formation de canaux transmembranaires qui permettent non-seulement la diffusion dions Cl-, mais aussi le transport de protons et dions Ca2+. Lintrt de cette recherche repose dabord dans le traitement de diverses pathologies voyant leur origine dans le dysfonctionnement du transport anionique. Cependant, les proprits bactricides des sels dimidazolium utiliss ont t identifies lors des dernires expriences.
Resumo:
Le systme rnine-angiotensine est impliqu dans le remodelage structurel et lectrique caractrisant la fibrillation auriculaire (FA). Langiotensine II (ANG II) induit le dveloppement de fibrose et dhypertrophie au niveau des oreillettes, prdisposant la FA. Or, les mcanismes lectrophysiologiques par lesquels lANG II pourrait promouvoir la FA sont peu connus. Lobjectif de ce projet de recherche est dvaluer leffet de lANG II sur les courants potassiques et calciques au niveau auriculaire indpendamment du remodelage structurel. Pour ce faire, nous avons utilis la technique de patch-clamp avec un modle de souris surexprimant le rcepteur de type 1 langiotensine II (AT1R) spcifiquement au niveau cardiaque. Pour distinguer les effets directs de la surexpression dAT1R des effets induits par le remodelage cardiaque, nous avons tudi des souris ges de 180 jours, qui prsentent du remodelage structurel, et des souris ges de 50 jours, qui nen prsentent pas. Des tudes prcdentes sur ce modle ont montr quau niveau des myocytes ventriculaires, lANG II rduit le courant potassique global (Ipeak) et rectifiant entrant (IK1) ainsi que le courant calcique de type L (ICaL). Ainsi, notre hypothse est que lANG II modulera aussi ces courants au niveau auriculaire, pouvant ainsi augmenter lhtrognit de repolarisation auriculaire et de ce fait le risque de dvelopper et maintenir la FA. Nous avons observ une diminution significative de la densit dIK1 dans loreillette gauche des souris transgniques sans changement dIpeak. De plus, la densit d ICaL nest pas rduite chez les souris transgniques ges de 50 jours. En conclusion, leffet de lANG II sur les courants potassiques et calciques semble dpendre de la chambre cardiaque. En effet, nous savions que lANGII rduisait Ipeak, IK1 et ICaL au niveau ventriculaire, mais nos rsultats ont montr quil ne les affectait pas directement au niveau des oreillettes. Ceci suggre des mcanismes de rgulation impliquant des voies de signalisation distinctes selon les chambres cardiaques. Enfin, nos rsultats montrant labsence de linfluence directe de la surexpression dAT1R sur les canaux K+ et Ca2+ au niveau des myocytes auriculaires renforcent limportance dapprofondir nos connaissances sur les effets de langiotensine II sur le dveloppement de la fibrose, sur le remodelage structurel et sur la conduction lectrique cardiaque.
Resumo:
Durant le vieillissement, lensemble des fonctions de lorganisme se dtriore, que ce soit aussi bien au niveau moteur que cognitif. Le vieillissement saccompagne dune diminution de la force, ainsi que de la masse musculaire. Des tudes rcentes tendent montrer que cette perte de masse musculaire que lon appelle sarcopnie aurait pour origine un drglement de la jonction neuromusculaire. Les changements au niveau du prsynaptique et du post synaptiques lors du vieillissement normal font lobjet de plusieurs tudes, mais les changements relatifs aux cellules de Schwann prisynaptique sont trs peu connus. Le but de cette tude est donc danalyser les modifications des interactions neurone-glie la jonction neuromusculaire. Dans cette tude, nous montrons que certaines fonctions des cellules gliales de la synapse ge sont drgles, en particulier, le type de rcepteurs activs par une stimulation nerveuse haute frquence. Dautre part, nos rsultats montrent que les mcanismes responsables de laugmentation de la transmission synaptique suite cette stimulation nerveuse haute frquence sont altrs la synapse ge. Enfin, outre les modifications de la terminaison axonale et de la fibre musculaire, les cellules gliales montrent des signes de rorganisation structurelle propre une synapse en rparation. Ces rsultats montrent que le fonctionnement de la jonction neuromusculaire et a fortiori les interactions neurones-glie sont altres lors du vieillissement normal.
Resumo:
Le remodelage cardiaque est le processus par lequel la structure ou la fonction cardiaque change en rponse un dsquilibre pathophysiologique tel qu'une maladie cardiaque, un contexte d'arythmie prolonge ou une modification de l'quilibre hormonal. Le systme rnine-angiotensine (SRA) est un systme hormonal largement tudi et il est impliqu dans de nombreuses activits associes au remodelage cardiovasculaire. Lexistence d'un systme circulatoire coupl un systme de tissus locaux est une reprsentation classique, cependant de nouvelles donnes suggrent un SRA indpendant et fonctionnellement actif l'chelle cellulaire. La comprhension de l'activit intracellulaire du SRA pourrait mener de nouvelles pistes thrapeutiques qui pourraient prvenir un remodelage cardiovasculaire dfavorable. L'objectif de cette thse tait d'lucider le rle du SRA intracellulaire dans les cellules cardiaques. Rcemment, les rcepteurs coupls aux protines G (RCPG), les protines G et leurs effecteurs ont t dtects sur des membranes intracellulaires, y compris sur la membrane nuclaire, et les concepts de RCPG intracellulaires fonctionnels sont en voie d'tre accepts comme une ralit. Nous avons ds lors fait l'hypothse que la signalisation du SRA dlimitant le noyau tait implique dans le contrle de l'expression des gnes cardiaques. Nous avons dmontr la prsence de rcepteurs d'angiotensine de type-1 (AT1R) et de type-2 (AT2R) nuclaires dans les cardiomyocytes ventriculaires adultes et dans une fraction nuclaire purifie de tissu cardiaque. Des quantits d'Ang II ont t dtectes dans du lysat de cardiomyocytes et des microinjections d'Ang-II-FITC ont donn lieu des liaisons prfrentielles aux sites nuclaires. L'analyse transcriptionnelle prouve que la synthse d'ARN de novo dans des noyaux isols stimuls l'Ang-II, et l'expression des ARNm de NF-B taient beaucoup plus importants lorsque les noyaux taient exposs de l'Ang II par rapport aux cardiomyocytes intacts. La stimulation des AT1R nuclaires a engendr une mobilisation de Ca2+ via les rcepteurs de l'inositol trisphosphate (IP3R), et le blocage des IP3R a diminu la rponse transcriptionnelle. Les mthodes disponibles actuellement pour l'tude de la signalisation intracrine sont limites aux mthodes indirectes. L'un des objectifs de cette thse tait de synthtiser et caractriser des analogues d'Ang-II cellule-permants afin dtudier spcifiquement dans les cellules intactes l'activit intracellulaire du SRA. Nous avons synthtis et caractris pharmacologiquement des analogues photosensibles Ang-II encapsule en incorporant un groupement 4,5-dimthoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) photoclivable sur les sites actifs identifis du peptide. Chacun des trois analogues d'Ang II encapsule synthtiss et purifis: [Tyr(DMNB)4]Ang-II, Ang-II-ODMNB et [Tyr(DMNB)4]Ang-II-ODMNB a montr une rduction par un facteur deux ou trois de l'affinit de liaison envers AT1R et AT2R dans les dosages par liaison comptitive et une activit rduite dans la contraction de l'aorte thoracique. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans des cellules HEK a augment la phosphorylation d'ERK1/2 (via AT1R) et la production de cGMP (via AT2R) alors que dans les cardiomyocytes isols elle gnrait une augmentation de Ca2+ nucloplasmique et initiait la synthse d'ARNr 18S et d'ARNm du NF-B. Les fibroblastes sont les principaux gnrateurs de remodelage cardiaque structurel, et les fibroblastes auriculaires sont plus ractifs aux stimuli profibrotiques que les fibroblastes ventriculaires. Nous avons mis l'hypothse que lAng-II intracellulaire et l'activation des AT1R et AT2R nuclaires associs contrlaient les profils d'expression des gnes des fibroblastes via des systmes de signalisation distincts et de ce fait jouaient un rle majeur dans le dveloppement de la fibrose cardiaque. Nous avons remarqu que les fibroblastes auriculaires expriment lAT1R et lAT2R nuclaire et l'Ang-II au niveau intracellulaire. Lexpression d'AT1R nuclaire a t rguls positivement dans les cas dinsuffisance cardiaque (IC), tandis que l'AT2R nuclaire a t glycosyl post-traductionnellement. La machinerie protique des protines G, y compris Gq/11, Gi/3, et G, a t observe dans des noyaux isols de fibroblastes. AT1R et AT2R rgulent l'initiation de la transcription du fibroblaste via les voies de transduction de signal d'IP3R et du NO. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans une culture de fibroblastes auriculaire dclenche la libration de Ca2+ nucloplasmique, la prolifration, et la synthse et scrtion de collagne qui ne sont pas inhibes par les bloqueurs d'AT1R et/ou AT2R extracellulaires.
Resumo:
Les nanomatriaux sont une classe de contaminants qui est de plus en plus prsent dans lenvironnement. Leur impact sur lenvironnement dpendra de leur persistance, mobilit, toxicit et bioaccumulation. Chacun de ces paramtres dpendra de leur comportement physicochimique dans les eaux naturelles (i.e. dissolution et agglomration). Lobjectif de cette tude est de comprendre lagglomration et lhtroagglomration des nanoparticules dargent dans lenvironnement. Deux diffrentes sortes de nanoparticules dargent (nAg; avec enrobage de citrate et avec enrobage dacide polyacrylique) de 5 nm de diamtre ont t marques de manire covalente laide dun marqueur fluorescent et ont t mlanges avec des collodes doxyde de silice (SiO2) ou dargile (montmorillonite). Lhomo- et htroagglomration des nAg ont t tudis dans des conditions reprsentatives deaux douces naturelles (pH 7,0; force ionique 10 7 10-1 M de Ca2+). Les tailles ont t mesures par spectroscopie de corrlation par fluorescence (FCS) et les rsultats ont t confirms laide de la microscopie en champ sombre avec imagerie hyperspectrale (HSI). Les rsultats ont dmontrs que les nanoparticules dargent enrobage dacide polyacrylique sont extrmement stables sous toutes les conditions imposes, incluant la prsence dautres collodes et des forces ioniques trs leves tandis que les nanoparticules dargent avec enrobage de citrate ont formes des htroagrgats en prsence des deux particules collodales.
Resumo:
Le glaucome est la principale cause de ccit irrversible dans le monde. Chez les patients atteints de cette pathologie, la perte de la vue rsulte de la mort slective des cellules ganglionnaires (CGR) de la rtine ainsi que de la dgnrescence axonale. La pression intraoculaire leve est considre le facteur de risque majeur pour le dveloppement de cette maladie. Les thrapies actuelles emploient des traitements pharmacologiques et/ou chirurgicaux pour diminuer la pression oculaire. Nanmoins, la perte du champ visuel continue progresser, impliquant des mcanismes indpendants de la pression intraoculaire dans la progression de la maladie. Il a t rcemment dmontr que des facteurs neuroinflammatoires pourraient tre impliqus dans le dveloppement du glaucome. Cette rponse est caractrise par une rgulation positive des cytokines pro-inflammatoires, en particulier du facteur de ncrose tumorale alpha (TNF). Cependant, le mcanisme par lequel le processus neuroinflammatoire agit sur la mort neuronale reste clarifier. Lhypothse principale de ce doctorat propose que les facteurs pro-inflammatoires comme le TNF et la phosphodiestrase 4 (PDE4) interagissent avec les mcanismes molculaires de la mort neuronale, favorisant ainsi la survie et la protection des CGRs au cours du glaucome. Dans la premire partie de ma thse, Jai utilis un modle in vivo de glaucome chez des rats Brown Norway pour montrer que lexpression du TNF est augmente aprs l'induction de l'hypertension oculaire. L'hypothse spcifique de cette tude suggre que les niveaux levs de TNF provoquent la mort des CGRs en favorisant l'insertion de rcepteurs AMPA permables au calcium (CP-AMPAR) la membrane cytoplasmique. Pour tester cette hypothse, jai utilis un inhibiteur slectif de la forme soluble du TNF, le XPro1595. L'administration de cet agent pharmacologique a induit une protection significative des somas et des axones des neurones rtiniens. L'valuation de la permabilit au cobalt a montr que le TNF soluble est impliqu dans l'insertion de CP-AMPAR la membrane des CGRs lors du glaucome. Lexposition des neurones une pression oculaire leve est lorigine de la hausse de la densit membranaire des CP-AMPARs, grce une diminution de lexpression de la sous-unit GluA2. La prsence de GluA2 au sein du rcepteur ne permet pas lentre du calcium lintrieur de la cellule. L'administration intraoculaire dantagonistes spcifiques des CP-AMPARs promeut la protection des somas et des axones des CGRs. Ces rsultats montrent que les CP-AMPARs jouent un rle important dans la pathologie du glaucome. Dans la deuxime partie de ma thse, jai caractris l'effet neuroprotecteur dun inhibiteur de la PDE4, libudilast, dans notre modle de glaucome. L'hypothse spcifique soriente vers une attnuation de la rponse neuroinflammatoire et de la gliose par ladministration dibudilast, favorisant ainsi la protection neuronale. Les rsultats montrent que dans les rtines glaucomateuses, libudilast diminue la gliose et l'expression de plusieurs facteurs tels que le TNF, l'interleukine-1 (IL-1), linterleukine-6 (IL-6) et le facteur inhibiteur de la migration des macrophages (MIF). Chez les rats glaucomateux, nous avons observ une expression notable de PDE4A dans les cellules de Mller, qui est en corrlation avec l'accumulation de lAMP cyclique (AMPc) dans ces cellules aprs un traitement dibudilast. Finalement, nous avons dmontr que la protection des CGRs via ladministration dibudilast est un mcanisme dpendent de lAMPc et de la protine kinase A (PKA). En conclusion, les rsultats prsents dans cette thse identifient deux mcanismes diffrents impliqus dans la perte des CGRs au cours du glaucome. Ces mcanismes pourraient fournir des perspectives potentielles pour le dveloppement de nouvelles stratgies de traitement du glaucome.
Resumo:
Lendothlium vasculaire joue un rle prpondrant dans la rgulation du tonus vasculaire en gnrant loxyde nitrique (NO), la prostacycline (PGI2) et les facteurs hyperpolarisants drivs de lendothlium (EDHF) comme puissants vasodilatateurs. Ces mcanismes requirent le calcium (Ca2+) divers niveaux, dmontrant limportance des dynamiques calciques endothliales. Une perturbation de lhomostasie calcique est observe dans une dysfonction endothliale lie lhypertension artrielle. Il est impratif dapprofondir nos connaissances sur les signalisations calciques endothliales impliques dans le contrle du tonus vasculaire. Des tudes rcentes ont montr quune variation locale de la concentration en Ca2+ libre intracellulaire ([Ca2+]i) est suffisante pour gnrer une rponse physiologique importante. Les pulsars calciques sont caractriss par une augmentation de [Ca2+]i spontane et transitoire spcifiquement localise au niveau des projections myoendothliales (PMEs). Ces PMEs sont des sites de communication privilgis entre les cellules endothliales (CEs) et les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs). Les pulsars calciques sont impliqus dans le mcanisme de lEDHF via lactivation des canaux potassiques Ca2+-dpendant de moyenne conductance (KCa3.1 ou IKCa). Les travaux de cette thse visent amliorer nos connaissances sur les signalisations calciques locales en caractrisant une nouvelle voie de signalisation pouvant tre implique dans la rgulation du tonus vasculaire en condition physiopathologique. Outre les canaux KCa3.1 peu dinformations sont disponibles sur les cibles sensibles aux pulsars calciques. Une premire tude a permis didentifier la protine kinase II dpendante du complexe Ca2+/calmoduline (CaMKII) sous ses isoformes , et dans les CEs dartres natives de souris comme une cible pouvant tre module par les pulsars calciques. Des tudes en immunofluorescence ont permis dobserver la localisation particulire de CaMKII endothliale dans les PMEs, les sites des pulsars calciques. Une stimulation spcifique des pulsars calciques par la phnylphrine (PE) engendre un recrutement de CaMKII dans les PMEs. Sachant que CaMKII active loxyde nitrique synthase endothliale (NOS3), nous avons valu limpact dune stimulation des pulsars calciques sur la production de NO en prsence dun inhibiteur de CaMKII, le KN-93. Nous avons dmontr que la production de NO est en partie dpendante de lactivation de CaMKII par les pulsars calciques. En utilisant un modle dhypertension induite par linfusion chronique de PE, nous avons permis de mettre en vidence une perturbation dans la relation entre les pulsars calciques et CaMKII. Dans une seconde tude nous avons tabli deux modles (normo- et hypertendus) dinfusion chronique langiotensine II (AngII) afin valuer limpact des ROS et de lhypertension sur la voie de signalisation pulsars/CaMKII/NO. Nos rsultats ont montr une augmentation des pulsars calciques accompagne dun recrutement de CaMKII dans les PMEs. Une stimulation aigue lAngII suggre que les ROS modulent les dynamiques calciques et que lAngII stimule la production de NO. Cette tude propose que ces voies de signalisations impliquent les rcepteurs de type 1 et 2 lAngII (AT1 et AT2). Ltude des pulsars calciques dpend fortement de la structure native des artres qui permet de conserver la formation des PMEs. La dernire tude prsente dans cette thse a permis dtablir une relation entre les PMEs et les pulsars calciques dans trois lits vasculaires distincts (artres msentriques, pulmonaires et coronariennes). Nos rsultats ont montr que les paramtres cintiques des pulsars calciques sont fortement conservs entre les diffrents lits vasculaires. Toutefois, la frquence globale ainsi que le nombre de sites actifs des pulsars calciques diffrent avec une proportion plus leve dans les artres msentriques et coronariennes comparativement aux artres pulmonaires. Ces rsultats corrlent avec le nombre plus lev de PMEs retrouv dans les artres msentriques et coronariennes. Ces travaux suggrent que les pulsars calciques sont fondamentaux pour les artres de rsistance. Les tudes de cette thse ont men lidentification dune nouvelle voie de signalisation impliquant les pulsars calciques et CaMKII endothliale dans la stimulation de la production de NO. Cette nouvelle voie de signalisation pourrait tre implique dans la rgulation du tonus vasculaire en condition physiopathologique. Les pulsars calciques semblent tre fortement conservs entre les diffrentes artres de rsistances et ce malgr la disparit dans les PMEs, suggrant un rle prpondrant dans la fonction vasculaire. Ces travaux ouvrent une avenue pour le dveloppement de potentielles cibles thrapeutiques pouvant contrer la dysfonction endothliale associe lhypertension artrielle.
Resumo:
Les canaux calciques de type L CaV1.2 sont principalement responsables de lentree des ions calcium pendant la phase plateau du potentiel daction des cardiomyocytes ventriculaires. Cet influx calcique est requis pour initier la contraction du muscle cardiaque. Le canal CaV1.2 est un complexe oligomerique qui est compose de la sous-unite principale CaV1 et des sous-unites auxiliaires CaV et CaV21. CaV joue un role determinant dans ladressage membranaire de la sous-unite CaV1. CaV21 stabilise letat ouvert du canal mais le mecanisme moleculaire responsable de cette modulation na pas ete encore identifie. Nous avons recemment montre que cette modulation requiert une expression membranaire significative de CaV21 (Bourdin et al. 2015). CaV21 est une glycoproteine qui possede 16 sites potentiels de glycosylation de type N. Nous avons donc evalue le role de la glycosylation de type-N dans ladressage membranaire et la stabilite de CaV21. Nous avons dabord confirme que la proteine CaV21 recombinante, telle la proteine endogene, est significativement glycosylee puisque le traitement a la PNGase F se traduit par une diminution de 50 kDa de sa masse moleculaire, ce qui est compatible avec la presence de 16 sites Asn. Il sest avere par ailleurs que la mutation simultanee de 6/16 sites (6xNQ) est suffisante pour 1) reduire significativement la densite de surface de! CaV21 telle que mesuree par cytometrie en flux et par imagerie confocale 2) accelerer les cinetiques de degradation telle questimee apres arret de la synthese proteique et 3) diminuer la modulation fonctionnelle des courants generes par CaV1.2 telle quevaluee par la methode du patch-clamp . Les effets les plus importants ont toutefois ete obtenus avec les mutants N663Q, et les doubles mutants N348Q/N468Q, N348Q/N812Q, N468Q/N812Q. Ensemble, ces resultats montrent que Asn663 et a un moindre degre Asn348, Asn468 et Asn812 contribuent a la biogenese et la stabilite de CaV21 et confirment que la glycosylation de type N de CaV21 est necessaire a la fonction du canal calcique cardiaque de type L.
