Impact du sexe et du profil génétique sur la sécrétion d’insuline dans une cohorte de patients atteints de fibrose kystique

Introduction : La Fibrose Kystique (FK) est la maladie autosomique récessive la plus fréquente chez les Caucasiens et est due à une mutation du gène Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR), codant pour un canal chlore. La principale mutation est la délétion de l'acide aminé phénylalanine en position 508. En raison de l’augmentation de l'espérance de vie, de nouvelles complications telles que le diabète associé à la FK (DAFK) ont vu le jour. Le DAFK semble principalement dû à un défaut de sécrétion d'insuline. Des études ont montré que les femmes et les personnes homozygotes ΔF508 ont un risque plus élevé de développer le DAFK. Objectifs : Comparer la sécrétion d'insuline entre les hommes et les femmes FK selon leur génotype CFTR. Notre hypothèse était que les femmes FK présentaient une sécrétion d'insuline moins élevée que des hommes. Méthodes : Deux cents sujets adultes sans diabète connu ont été recrutés dans la clinique de FK du CHUM et inclus dans cette étude. Cent seize ont été revus après un suivi de 24 ± 10 mois. Leur génotype CFTR a été extrait à partir des dossiers médicaux. Tous les sujets ont subi une hyperglycémie provoquée par voie orale de 2-h (HGPO) afin de déterminer leur tolérance au glucose : normale (NGT), intolérance (IGT) ou DAFK. Des échantillons de sang ont été prélevés aux temps 0, 30, 60, 90, et 120 min de l’HGPO. À partir de ces derniers, la sécrétion d'insuline et la sensibilité à l’insuline des sujets ont été évaluées en utilisant les indices de Stumvoll et les aires sous la courbe de l’insuline durant l’HGPO. Résultats : Pour une excursion glycémique comparable, il y avait des différences significatives dans les concentrations d'insuline entre les hommes et les femmes et selon le génotype CFTR. Ainsi, les femmes et les sujets hétérozygotes avaient des concentrations d’insuline plus élevées que les hommes et les sujets homozygotes. Cela restait significatif quelle que soit leur tolérance au glucose. Le calcul du disposition index représentant la sécrétion d'insuline ajustée pour le degré de sensibilité à l’insuline a suggéré une sécrétion d'insuline plus élevée chez les femmes que les hommes. Le suivi prospectif nous a permis de déterminer que cette sécrétion plus élevée d’insuline était associée à une évolution plus favorable pour la tolérance au glucose. Fait intéressant, cette constatation n'était vraie que pour les femmes. Conclusion : Dans une vaste cohorte prospective observationnelle de patients FK sans diabète connu, nous avons démontré qu’en dépit d’un âge et d’une fonction pulmonaire semblables, les femmes présentaient une sécrétion d'insuline supérieure à celle des hommes et que cela pourrait avoir un effet protecteur, à court terme, chez celles-ci pour le développement du DAFK.

Les partenaires d'interactions de Cirhin, la protéine portant la mutation responsable de la Cirrhose Amérindienne Infantile (NAIC)

La Cirrhose Amérindienne Infantile (CAI, NAIC) est une forme de cholestase non-syndromique héréditaire à transmission autosomique récessive, décrite uniquement chez les enfants autochtones du Nord-Ouest québécois et issue d’un effet fondateur. La maladie se présente d’abord sous la forme d’une jaunisse néonatale chez un enfant autrement en bonne santé, qui progresse en cirrhose de type biliaire dans l’enfance et dans l’adolescence. Le taux de survie à l’âge adulte est inférieur à 50% et la seule thérapie efficace à ce jour pour les patients avancés dans la maladie demeure la transplantation hépatique. Les recherches antérieures menées par le groupe ont permis d’identifier le locus ainsi que le gène responsable de NAIC, qui encode la protéine nucléolaire Cirhin. Cirhin est exprimée uniquement dans le foie et tous les patients sont homozygotes pour la mutation R565W. La fonction de Cirhin est inconnue, mais les motifs WD40 retrouvés dans sa séquence indiquent qu’elle participerait à des interactions protéine-protéine et serait impliquée dans un mécanisme moléculaire de base. Cirhin interagit avec la protéine nucléaire Cirip, qui a un effet positif important sur la transcription de l’élément activateur HIV-1 LTR et qui a un rôle dans la prolifération cellulaire. L’interaction de Cirhin et Cirip est affectée par la mutation R565W. À l’aide de la technique du double hybride chez la levure, la protéine nucléolaire Nol11 a été identifiée comme étant un partenaire d’interaction de Cirhin. Par son interaction avec MARK3 et c-Myc, Nol11 serait impliquée dans des processus cellulaires tels que le contrôle du cycle cellulaire, la polarité, la croissance cellulaire et possiblement la biogenèse des ribosomes. La portion C-terminale de Nol11 interagirait avec Cirhin, et la mutation R565W abolit cette interaction. Le résidu R565 serait donc important pour la fonctionnalité de Cirhin.

Études de type structure fonction des mutations causant l’ataxie épisodique de type I sur les canaux potassiques dépendants du voltage

Les ataxies épisodiques (EA) d’origine génétique sont un groupe de maladies possédant un phénotype et génotype hétérogènes, mais ont en commun la caractéristique d’un dysfonctionnement cérébelleux intermittent. Les EA de type 1 et 2 sont les plus largement reconnues des ataxies épisodiques autosomiques dominantes et sont causées par un dysfonctionnement des canaux ioniques voltage-dépendants dans les neurones. La présente étude se concentrera sur les mutations causant l'EA-1, retrouvées dans le senseur de voltage (VSD) de Kv1.1, un canal très proche de la famille des canaux Shaker. Nous avons caractérisé les propriétés électrophysiologiques de six mutations différentes à la position F244 et partiellement celles des mutations T284 A/M, R297 K/Q/A/H, I320T, L375F, L399I et S412 C/I dans la séquence du Shaker grâce à la technique du ‘’cut open voltage clamp’’ (COVC). Les mutations de la position F244 situées sur le S1 du canal Shaker sont caractérisées par un décalement des courbes QV et GV vers des potentiels dépolarisants et modifient le couplage fonctionnel entre le domaine VSD et le pore. Un courant de fuite est observé durant la phase d'activation des courants transitoires et peut être éliminé par l'application du 4-AP (4-aminopyridine) ou la réinsertion de l'inactivation de type N mais pas par le TEA (tétraéthylamonium). Dans le but de mieux comprendre les mécanismes moléculaires responsables de la stabilisation d’un état intermédiaire, nous avons étudié séparément la neutralisation des trois premières charges positives du S4 (R1Q, R2Q et R3Q). Il en est ressorti l’existence d’une interaction entre R2 et F244. Une seconde interface entre S1 et le pore proche de la surface extracellulaire agissant comme un second point d'ancrage et responsable des courants de fuite a été mis en lumière. Les résultats suggèrent une anomalie du fonctionnement du VSD empêchant la repolarisation normale de la membrane des cellules nerveuses affectées à la suite d'un potentiel d'action.

Cartographie génétique d’une forme familiale autosomale dominante d’anévrysmes du septum inter-ventriculaire et de communications inter-ventriculaires au chromosome 10p15

Les malformations cardiaques congénitales (CHM) représentent 28 % de toutes les malformations congénitales majeures et touchent 8 pour 1000 naissances à terme. Elles sont la cause de mortalité et de morbidité non infectieuse la plus fréquente chez les enfants de moins d’une année de vie. Les communications interventriculaires (VSD) forment le sous-type de CHM le plus fréquent et l’aggrégation familiale est extrêmement rare. Le but de cette étude était d’identifier les facteurs génétiques et les régions chromosomiques contribuant aux VSD. Une grande famille ségréguant diverses formes de pathologies septales, incluant des VSD, des anévrysmes du septum interventriculaire (VSA) et des communications interauriculaires (ASD), a été examinées et caractérisées cliniquement et génétiquement. Dix-huit membres de la famille, sur trois générations, ont pu être étudiés. (10 affectés : 4 VSD, 3 VSA, 2 ASD et une tétralogie de Fallot). L’analyse de liaison multipoint paramétrique démontre un logarithme des probabilités maximal (LOD) de 3.29 liant significativement le chromosome 10p15.3-10p15.2 aux traits observés dans cette famille. Le pointage LOD oriente vers une région pauvre en gènes qui a déjà été associée aux malformations du septum interventriculaire, mais qui est distincte de la région du syndrome de DiGeorge de type 2 sur le chromosome 10p. De plus, plusieurs scénarios d’analyse de liaison suggèrent que la tétralogie de Fallot est une phénocopie et qu’elle est donc génétiquement différente des autres pathologies du septum observées dans cette famille. En bref, cette étude associe une forme rare de VSD/VSA au chromosome 10p15 et permet d’étendre le spectre de l’hétérogénéité des pathologies septales. Mots-clés : Malformations cardiaques congénitales, malformations du septum, tétralogie de Fallot, analyse de liaison, chromosome 10p15, génétique moléculaire

Études génétiques de familles récessives d’ataxies et de paraplégies spastiques

Au cours des dernières années, la génétique a subi une progression phénoménale suite au développement de nouvelles technologies de séquençage. En effet, le séquençage de l’exome entier chez des familles a permis l’identification de nouveaux gènes impliqués pour plusieurs maladies. La neurologie a d’ailleurs bénéficié de ces avancées et plusieurs gènes ont été mis en évidence comme causatifs pour différents désordres neurologiques. Dans ce travail il sera question de deux désordres du mouvement pour lequel nous avons utilisés des technologies de séquençage traditionnelles, en l’occurrence le séquençage par Sanger, ainsi que de nouvelles technologies pour le séquençage de l’exome entier afin d’identifier de nouveaux gènes causatifs. Le premier désordre du mouvement qui sera décrit est l’ataxie, où ne seront abordées que les ataxies de cause génétiques, à transmission récessive. Le premier chapitre relatera les nouvelles mutations qui ont été trouvées chez des canadiens-français souffrant de l’ataxie de Beauce. Il sera aussi question de nouvelles mutations retrouvées dans deux autres populations, confirmant l’implication du gène SYNE1 dans les cas d’ataxie cérébelleuse à travers le monde. Le second chapitre fera la démonstration qu’il est souhaitable d’utiliser le séquençage de l’exome entier dans le but de poser un diagnostic clinique. En effet, il a été possible de trouver la cause génétique d’une famille comportant deux membres atteints d’atrophie congénitale du cervelet, où le symptôme prédominant est l’ataxie. Le séquençage de l’exome a permis la mise en évidence de mutations dans le gène PMM2, déjà connues pour cause le syndrome des glycoprotéines déficientes en hydrates de carbone. Dans un second temps, il sera question d’un autre désordre du mouvement la paraplégie spastique familiale (PSF). Le chapitre 3 relatera les mutations trouvées dans le gène CYP7B1 dans notre cohorte de patients PSF.

Étude du trafic cellulaire de la convertase de proprotéine PCSK9 responsable de la dégradation du récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLR)

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de mortalité dans les pays industrialisés. L'hypercholestérolémie constitue un facteur de risque majeur pour les MCV. Elle est caractérisée par des niveaux élevés de lipoprotéines de faible densité (LDL, aussi appelé “mauvais cholestérol”). La présence prolongée de haut niveaux de LDL dans la circulation augmente le risque de formation de plaques athérosclérotiques, ce qui peut conduire à l'obstruction des artères et l'infarctus du myocarde. Le LDL est normalement extrait du sang par sa liaison au récepteur du LDL (LDLR) qui est responsable de son endocytose dans les hépatocytes. Des études génétiques humaines ont identifié PCSK9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) comme le troisième locus responsable de l'hypercholestérolémie autosomique dominante après le LDLR et son ligand l’apolipoprotéine B-100. PCSK9 interagit avec le LDLR et induit sa dégradation, augmentant ainsi les niveaux plasmatiques de LDL. Les mutations gain de fonction (GF) de PCSK9 sont associées à des niveaux plasmatiques élevés de LDL et à l'apparition précoce des MCV, alors que les mutations perte de fonction (PF) de PCSK9 diminuent le risque de MCV jusqu’à ~ 88% grâce à une réduction du LDL circulant. De ce fait, PCSK9 constitue une cible pharmacologique importante pour réduire le risque de MCV. PCSK9 lie le LDLR à la surface cellulaire et/ou dans l'appareil de Golgi des hépatocytes et provoque sa dégradation dans les lysosomes par un mécanisme encore mal compris. Le but de cette étude est de déterminer pourquoi certaines mutations humaines de PCSK9 sont incapables de dégrader le LDLR tandis que d'autres augmentent sa dégradation dans les lysosomes. Plusieurs mutations GF et PF de PCSK9 ont été fusionnées à la protéine fluorecente mCherry dans le but d'étudier leur mobilité moléculaire dans les cellules hépatiques vivantes. Nos analyses quantitatives de recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) ont montré que les mutations GF (S127R et D129G) avaient une mobilité protéique plus élevée (> 35% par rapport au WT) dans le réseau trans- Golgien. En outre, nos analyses quantitatives de recouvrement de fluorescence inverse après photoblanchiment (iFRAP) ont montré que les mutations PF de PCSK9 (R46L) avaient une mobilité protéique plus lente (<22% par rapport au WT) et une fraction mobile beaucoup plus petite (<40% par rapport au WT). Par ailleurs, nos analyses de microscopie confocale et électronique démontrent pour la toute première fois que PCSK9 est localisée et concentrée dans le TGN des hépatocytes humains via son domaine Cterminal (CHRD) qui est essentiel à la dégradation du LDLR. De plus, nos analyses sur des cellules vivantes démontrent pour la première fois que le CHRD n'est pas nécessaire à l'internalisation de PCSK9. Ces résultats apportent de nouveaux éléments importants sur le mécanisme d'action de PCSK9 et pourront contribuer ultimement au développement d'inhibiteurs de la dégradation du LDLR induite par PCSK9.

Les fluctuations glycémiques et l'inflammation dans le diabète secondaire à la fibrose kystique

La fibrose kystique (FK) est la maladie autosomique récessive la plus fréquente chez les individus de race caucasienne. Elle est secondaire à la mutation du gène Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR). Grâce à des traitements plus agressifs, la médiane de l’espérance de vie des individus atteints de la FK a augmenté et cette augmentation est associée à l’émergence du diabète secondaire ou associé à la FK (DAFK), une complication associée à une augmentation du taux de mortalité. La pathophysiologie du DAFK n’est pas parfaitement comprise. Par exemple, la cause de l’accélération de la perte de la fonction pulmonaire, qui débute des années avant l’apparition du DAFK, n'est pas élucidée. Tous les patients atteints de la FK, même ceux sans le DAFK, présentent de l’hyperglycémie et des fluctuations glycémiques. D’ailleurs, une étude a démontré que la réactivité immunitaire est affectée par l’hyperglycémie dans un modèle animal de la FK et il y a des évidences que les lymphocytes sans CFTR fonctionnel ou en présence d’un excès de glucose ont des réactions inflammatoires anormales. Donc, nous avons émis l’hypothèse que les patients atteints de la FK, surtout ceux non-diabétiques et pré-diabétiques, auront une plus grande proportion de lymphocytes Th17 et Treg produisant la cytokine pro-inflammatoire IL-17A comparativement aux sujets sains et que l’augmentation de cette cytokine pourrait influencer la chute accélérée des fonctions pulmonaires avant l’apparition du DAFK. Des niveaux élevés d’IL-17A sont retrouvés dans les poumons des patients atteints de la FK et dans le sang périphérique des patients avec le diabète de type 1 (DT1) et de type 2 (DT2). L’IL-17A peut aussi être produite par les lymphocytes Treg dysfonctionnels. Habituellement, ces lymphocytes atténuent les réponses inflammatoires excessives, mais lorsqu’ils sont dysfonctionnels, ils peuvent produire de l’IL-17A, contribuant ainsi à l’état inflammatoire. De plus, nous avons supposé que les proportions de Th17 et Treg produisant de l’IL-17A seront associées aux fonctions pulmonaires des patients atteints de la FK et que l’alimentation, l’activité physique et la composition corporelle influenceraient ces relations. Les résultats de cette thèse ont montré que, malgré une association entre la proportion de lymphocytes dans le sang périphérique et les indices de fluctuations glycémiques, celles-ci n’influençaient pas les proportions de lymphocytes Th17 et Treg produisant de l’IL-17A lorsqu’ils étaient mis en culture pour 24 ou 48 heures dans des milieux contenant soit 5 mM ou 25 mM de glucose et stimulés par le phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) et le phytohemagglutinine (PHA) ou, encore, non stimulés. De plus, ces proportions étaient semblables entre les patients atteints de la FK et les individus en santé. Toutefois, les proportions de lymphocytes Treg stimulés produisant de l’IL-17A des sujets sains étaient plus élevées que les proportions de lymphocytes Treg non stimulés de tous les participants (patients atteints de la FK et individus en santé). Tout ceci suggérant donc que les Treg des sujets sains et atteints de la FK ne réagissaient pas de la même façon à la stimulation. D’ailleurs, la durée d’incubation affectait les proportions de Th17 produisant de l’IL-17A, mais elle n’avait aucun effet sur les proportions de Treg produisant cette cytokine. Donc, ces types cellulaires réagissaient différemment dans les mêmes milieux de culture. De plus, nous avons observé que seulement l’énergie provenant des glucides affectait modestement les indices de fluctuations glycémiques et que les proportions de Th17 et Treg produisant de l’IL-17A n’étaient pas associées aux fonctions pulmonaires des patients atteints de la FK. En conclusion, les patients atteints de la FK avaient plus d’hyperglycémie et de fluctuations glycémiques, mais elles n’influençaient pas les proportions de lymphocytes Th17 et Treg produisant de l’IL-17A ex vivo. Dans des études futures, il faudrait étudier le rôle de l’IL-17A dans les poumons des patients avec et sans le DAFK et réaliser une étude prospective pour déterminer si une augmentation des niveaux d’IL-17A chez les patients sans le DAFK se traduit par une chute accélérée des fonctions pulmonaires avant l’apparition de cette complication.

Exploration génomique de la déficience intellectuelle

La déficience intellectuelle (DI) définit un groupe de conditions génétiquement hétérogènes caractérisées par l’apparition de troubles cognitifs précoces chez l’enfant. Elle affecte 1-3% de la population dans les pays industrialisés. La prévalence de la DI est beaucoup plus élevée ailleurs dans le monde, en raison de facteurs sociodémographiques comme le manque de ressources dans le système de santé, la pauvreté et la consanguinité. Des facteurs non-génétiques sont mis en cause dans l’étiologie de la DI ; on estime qu’environ 25% des cas de DI sont d’origine génétique. Traditionnellement, les bases moléculaires de la DI ont été investiguées par des analyses cytogénétiques, les approches de cartographie génétique et le séquençage de gènes candidats ; ces techniques de génétiques classiques sont encore mises à rude épreuve dans l’analyse de maladies complexes comme la DI. La DI liée à l’X a été particulièrement étudiée, avec plus d’une centaine de gènes identifiés uniquement sur le chromosome X. Des mutations hétérozygotes composites sont mises en évidence dans la DI autosomique, dans le contexte d’unions non-consanguines. L’occurrence de ce type de mutations est rare, chez des individus non-apparentés, de sorte que les mutations dominantes de novo sont plus courantes. Des mutations homozygotes sont attendues dans les populations consanguines ou marquées par un effet fondateur. En fait, les bases moléculaires de la DI autosomique ont été presqu’exclusivement étudiées dans le contexte de populations avec des forts taux de consanguinité. L’origine de la DI demeure encore inconnue dans environ 60 % des cas diagnostiqués. En l’absence de facteurs environnementaux associés à la DI chez ces individus, il est possible d’envisager que des facteurs génétiques non identifiés entrent en jeu dans ces cas de DI inexpliqués. Dans ce projet de recherche, nous voulions explorer l’origine génétique de la DI, dans vingt familles, où une transmission de la maladie selon un mode autosomique récessif est suspectée. Nous avons mis de l’avant les techniques de séquençage de nouvelle génération, afin de mettre en évidence les déterminants génétiques de la DI, à l’échelle du génome humain. En fait, nous avons priorisé la capture et le séquençage de l’exome; soient la totalité des régions codantes du génome humain et leurs sites d’épissage flanquants. Dans nos analyses, nous avons ciblé les variants qui ne sont pas rapportés trop fréquemment dans différentes bases de données d’individus contrôles, ces mutations rares cadrent mieux avec une condition comme la DI. Nous avons porté une attention particulière aux mutations autosomiques récessives (homozygotes et hétérozygotes composites) ; nous avons confirmé que ces mutations ségréguent avec une transmission récessive dans la famille à l’étude. Nous avons identifié des mutations dans des gènes pouvant être à l’origine de la DI, dans certaines des familles analysées ; nous avons validé biologiquement l'impact fonctionnel des mutations dans ces gènes candidats, afin de confirmer leur implication dans la pathophysiologie de la DI. Nous avons élucidé les bases moléculaires de la DI dans huit des familles analysées. Nous avons identifié le second cas de patients avec syndrome de cassure chromosomique de Varsovie, caractérisé par des dysfonctions de l’ARN hélicase DDX11. Nous avons montré qu’une perte de l’activité de TBC1D7, une des sous-unités régulatrice du complexe TSC1-TSC2, est à l’origine de la pathologie dans une famille avec DI et mégalencéphalie. Nous avons mis en évidence des mutations pathogéniques dans le gène ASNS, codant pour l’Asparagine synthétase, chez des patients présentant une microcéphalie congénitale et une forme progressive d’encéphalopathie. Nous avons montré que des dysfonctions dans la protéine mitochondriale MAGMAS sont mises en cause dans une condition caractérisée par un retard prononcé dans le développement associé à une forme sévère de dysplasie squelettique. Nous avons identifié une mutation tronquant dans SPTBN2, codant pour la protéine spinocerebellar ataxia 5, dans une famille avec DI et ataxie cérébelleuse. Nous avons également mis en évidence une mutation dans PIGN, un gène impliqué dans la voie de biosynthèse des ancres de glycosylphosphatidylinositol , pouvant être à l’origine de la maladie chez des individus avec épilepsie et hypotonie. Par ailleurs, nous avons identifié une mutation - perte de fonction dans CLPB, codant pour une protéine chaperonne mitochondriale, dans une famille avec encéphalopathie néonatale, hyperekplexie et acidurie 3-méthylglutaconique. Le potentiel diagnostic des techniques de séquençage de nouvelle génération est indéniable ; ces technologies vont révolutionner l’univers de la génétique moléculaire, en permettant d’explorer les bases génétiques des maladies complexes comme la DI.

Characterization of polycystin-1 in ADPKD pathogenetic mechanism : biogenesis and functional implications by genetic approaches in mouse

La polykystose rénale autosomique dominante (ADPKD) est une des maladies génétiques les plus communes. ADPKD se manifeste le plus souvent au stade adulte par la présence de kystes rénaux, et bien souvent de kystes hépatiques, avec une progression très variable. ADPKD mène à une insuffisance rénale: les seuls recours sont la dialyse puis la transplantation rénale. Les mutations dispersées sur les gènes PKD1 (majoritairement; la protéine polycystine-1, PC1) et PKD2 (la protéine polycystine-2, PC2) sont responsables de l’ADPKD. Le mécanisme pathogénétique de perte de fonction (LOF) et donc d’un effet récessif cellulaire est évoqué comme causatif de l’ADPKD. LOF est en effet supporté par les modèles murins d’inactivation de gènes PKD1/PKD2, qui développent de kystes, quoique in utéro et avec une rapidité impressionnante dans les reins mais pas dans le foie. Malgré de nombreuses études in vitro, le rôle de PC1/PC2 membranaire/ciliaire reste plutôt hypothétique et contexte-dépendant. Ces études ont associé PC1/PC2 à une panoplie de voies de signalisation et ont souligné une complexité structurelle et fonctionnelle exceptionnelle, dont l’implication a été testée notamment chez les modèles de LOF. Toutefois, les observations patho-cellulaires chez l’humain dont une expression soutenue, voire augmentée, de PKD1/PC1 et l’absence de phénotypes extrarénaux particuliers remet en question l’exclusivité du mécanisme de LOF. Il était donc primordial 1) d’éclaircir le mécanisme pathogénétique, 2) de générer des outils in vivo authentiques d’ADPKD en terme d’initiation et de progression de la maladie et 3) de mieux connaitre les fonctions des PC1/PC2 indispensables pour une translation clinique adéquate. Cette thèse aborde tous ces points. Tout d’abord, nous avons démontré qu’une augmentation de PKD1 endogène sauvage, tout comme chez l’humain, est pathogénétique en générant et caractérisant en détail un modèle murin transgénique de Pkd1 (Pkd1TAG). Ce modèle reproduit non seulement les caractéristiques humaines rénales, associées aux défauts du cil primaire, mais aussi extrarénales comme les kystes hépatiques. La sévérité du phénotype corrèle avec le niveau d’expression de Pkd1 ce qui supporte fortement un modèle de dosage. Dans un deuxième temps, nous avons démontré par les études de complémentations génétiques que ces deux organes reposent sur une balance du clivage GPS de Pc1, une modification post-traductionelle typique des aGPCR, et dont l’activité et l’abondance semblent strictement contrôlées. De plus, nous avons caractérisé extensivement la biogénèse de Pc1 et de ses dérivés in vivo générés suite au clivage GPS. Nous avons identifié une toute nouvelle forme et prédominante à la membrane, la forme Pc1deN, en plus de confirmer deux fragments N- et C-terminal de Pc1 (NTF et CTF, respectivement) qui eux s’associent de manière non-covalente. Nous avons démontré de façon importante que le trafic de Pc1deN i.e., une forme NTF détachée du CTF, est toutefois dépendant de l’intégrité du fragment CTF in vivo. Par la suite, nous avons généré un premier modèle humanisant une mutation PKD1 non-sens tronquée au niveau du domaine NTF(E3043X) en la reproduisant chez une souris transgénique (Pkd1extra). Structurellement, cette mutation, qui mimique la forme Pc1deN, s’est également avérée causative de PKD. Le modèle Pkd1extra a permis entre autre de postuler l’existence d’une cross-interaction entre différentes formes de Pc1. De plus, nos deux modèles murins sont tous les deux associés à des niveaux altérés de c-Myc et Pc2, et soutiennent une implication réelle de ces derniers dans l’ADPKD tou comme une interaction fonctionnelle entre les polycystines. Finalement, nous avons démontré un chevauchement significatif entre l’ADPKD et le dommage rénal aigüe (ischémie/AKI) dont une expression augmentée de Pc1 et Pc2 mais aussi une stimulation de plusieurs facteurs cystogéniques tel que la tubérine, la β-caténine et l’oncogène c-Myc. Nos études ont donc apporté des évidences cruciales sur la contribution du gène dosage dans l’ADPKD. Nous avons développé deux modèles murins qui serviront d’outil pour l’analyse de la pathologie humaine ainsi que pour la validation préclinique ADPKD. L’identification d’une nouvelle forme de Pc1 ajoute un niveau de complexité supplémentaire expliquant en partie une capacité de régulation de plusieurs voies de signalisation par Pc1. Nos résultats nous amènent à proposer de nouvelles approches thérapeutiques: d’une part, le ciblage de CTF i.e., de style chaperonne, et d’autre part le ciblage de modulateurs intracellulaires (c-Myc, Pc2, Hif1α). Ensemble, nos travaux sont d’une importance primordiale du point de vue informatif et pratique pour un avancement vers une thérapie contre l’ADPKD. Le partage de voies communes entre AKI et ADPKD ouvre la voie aux approches thérapeutiques parallèles pour un traitement assurément beaucoup plus rapide.

Genetic Landscape of Joubert syndrome in French Canadians

Le syndrome de Joubert est une maladie récessive caractérisée par une malformation congénitale distincte du tronc cérébral et du cervelet, associée à une anomalie des mouvements oculaires (apraxie oculomotrice), une respiration irrégulière, un retard de développement, et une ataxie à la démarche. Au cours de la dernière décennie, plus de 20 gènes responsables ont été identifiés, tous ayant un rôle important dans la structure et la fonction des cils primaires. Ainsi, le syndrome de Joubert est considéré une ciliopathie. Bien que le Syndrome de Joubert ait été décrit pour la première fois dans une famille canadienne-française en 1969, le(s) gène(s) causal demeurait inconnu dans presque tous les cas de syndrome de Joubert recensés en 2010 dans la population canadienne-française, soit début de mon projet doctoral. Nous avons identifié un total de 43 individus canadiens-français (35 familles) atteints du syndrome de Joubert. Il y avait un regroupement de familles dans la région du Bas-Saint-Laurent de la province de Québec, suggérant la présence d'un effet fondateur. L’objectif de ce projet était de caractériser la génétique du syndrome de Joubert dans la population canadienne-française. Notre hypothèse était qu’il existait un effet fondateur impliquant au moins un nouveau gène JBTS. Ainsi, dans un premier temps, nous avons utilisé une approche de cartographie par homozygotie. Cependant, nous n’avons pas identifié de région d’homozygotie partagée parmi les individus atteints, suggérant la présence d’une hétérogénéité génétique ou allélique. Nous avons donc utilisé le séquençage exomique chez nos patients, ce qui représente une approche plus puissante pour l’étude de conditions génétiquement hétérogènes. Nos travaux ont permis l’identification de deux nouveaux gènes responsables du syndrome de Joubert: C5orf42 et TMEM231. Bien que la localisation cellulaire et la fonction de C5orf42 soient inconnus au moment de cette découverte, nos résultats génétiques combinés avec des études ultérieures ont établi un rôle important de C5orf42 dans la structure et la fonction ciliaire, en particulier dans la zone de transition, qui est une zone de transition entre le cil et le reste de la cellule. TMEM231 avait déjà un rôle établi dans la zone de transition ciliaire et son interaction avec d’autres protéines impliquées dans le syndrome de Joubert était connu. Nos études ont également identifié des variants rares délétères chez un patient JBTS dans le gène ciliaire CEP104. Nous proposons donc CEP104 comme un gène candidat JBTS. Nous avons identifié des mutations causales dans 10 gènes, y compris des mutations dans CC2D2A dans 9 familles et NPHP1 dans 3 familles. Au total, nous avons identifié les mutations causales définitives chez 32 des 35 familles étudiées (91% des cas). Nous avons documenté un effet fondateur complexe dans la population canadienne-française avec de multiples mutations récurrentes dans quatre gènes différents (C5orf42, CC2D2A, TMEM231, NPHP1). Au début de ce projet de recherche, l’étiologie génétique était inconnue chez les 35 familles touchées du syndrome de Joubert. Maintenant, un diagnostique moléculaire définitif est identifié chez 32 familles, et probable chez les 3 autres. Nos travaux ont abouti à la caractérisation génétique du syndrome de Joubert dans la population canadienne-française grâce au séquençage exomique, et révèlent la présence d'un effet fondateur complexe avec une l'hétérogénéité allélique et intralocus importante. Ces découvertes ont éclairé la physiologie de cette maladie. Finalement, l’identification des gènes responsables ouvre de nouvelles perspectives diagnostiques ante-natales, et de conseils génétique, très précieuses pour les familles.

Biology and characterisation of polyalanine as an emerging pathological marker

Dix-huit maladies humaines graves ont jusqu'ici été associées avec des expansions de trinucléotides répétés (TNR) codant soit pour des polyalanines (codées par des codons GCN répétés) soit pour des polyglutamines (codées par des codons CAG répétés) dans des protéines spécifiques. Parmi eux, la dystrophie musculaire oculopharyngée (DMOP), l’Ataxie spinocérébelleuse de type 3 (SCA3) et la maladie de Huntington (MH) sont des troubles à transmission autosomale dominante et à apparition tardive, caractérisés par la présence d'inclusions intranucléaires (IIN). Nous avons déjà identifié la mutation responsable de la DMOP comme étant une petite expansion (2 à 7 répétitions supplémentaires) du codon GCG répété du gène PABPN1. En outre, nous-mêmes ainsi que d’autres chercheurs avons identifié la présence d’événements de décalage du cadre de lecture ribosomique de -1 au niveau des codons répétés CAG des gènes ATXN3 (SCA3) et HTT (MH), entraînant ainsi la traduction de codons répétés hybrides CAG/GCA et la production d'un peptide contenant des polyalanines. Or, les données observées dans la DMOP suggèrent que la toxicité induite par les polyalanines est très sensible à leur quantité et leur longueur. Pour valider notre hypothèse de décalage du cadre de lecture dans le gène ATXN3 dans des modèles animaux, nous avons essayé de reproduire nos constatations chez la drosophile et dans des neurones de mammifères. Nos résultats montrent que l'expression transgénique de codons répétés CAG élargis dans l’ADNc de ATXN3 conduit aux événements de décalage du cadre de lecture -1, et que ces événements sont néfastes. À l'inverse, l'expression transgénique de codons répétés CAA (codant pour les polyglutamines) élargis dans l’ADNc de ATXN3 ne conduit pas aux événements de décalage du cadre de lecture -1, et n’est pas toxique. Par ailleurs, l’ARNm des codons répétés CAG élargis dans ATXN3 ne contribue pas à la toxicité observée dans nos modèles. Ces observations indiquent que l’expansion de polyglutamines dans nos modèles drosophile et de neurones de mammifères pour SCA3 ne suffit pas au développement d'un phénotype. Par conséquent, nous proposons que le décalage du cadre de lecture ribosomique -1 contribue à la toxicité associée aux répétitions CAG dans le gène ATXN3. Pour étudier le décalage du cadre de lecture -1 dans les maladies à expansion de trinucléotides CAG en général, nous avons voulu créer un anticorps capable de détecter le produit présentant ce décalage. Nous rapportons ici la caractérisation d’un anticorps polyclonal qui reconnaît sélectivement les expansions pathologiques de polyalanines dans la protéine PABPN1 impliquée dans la DMOP. En outre, notre anticorps détecte également la présence de protéines contenant des alanines dans les inclusions intranucléaires (IIN) des échantillons de patients SCA3 et MD.

Bases moléculaires et cellulaires d’un trouble neurodéveloppemental causé par l’haploinsuffisance de SYNGAP1.

La déficience intellectuelle est la cause d’handicap la plus fréquente chez l’enfant. De nombreuses évidences convergent vers l’idée selon laquelle des altérations dans les gènes synaptiques puissent expliquer une fraction significative des affections neurodéveloppementales telles que la déficience intellectuelle ou encore l’autisme. Jusqu’à récemment, la majorité des mutations associées à la déficience intellectuelle a été liée au chromosome X ou à la transmission autosomique récessive. D’un autre côté, plusieurs études récentes suggèrent que des mutations de novo dans des gènes à transmission autosomique dominante, requis dans les processus de la plasticité synaptique peuvent être à la source d’une importante fraction des cas de déficience intellectuelle non syndromique. Par des techniques permettant la capture de l’exome et le séquençage de l’ADN génomique, notre laboratoire a précédemment reporté les premières mutations pathogéniques dans le gène à transmission autosomique dominante SYNGAP1. Ces dernières ont été associées à des troubles comportementaux tels que la déficience intellectuelle, l’inattention, des problèmes d’humeur, d’impulsivité et d’agressions physiques. D’autres patients sont diagnostiqués avec des troubles autistiques et/ou des formes particulières d’épilepsie généralisée. Chez la souris, le knock-out constitutif de Syngap1 (souris Syngap1+/-) résulte en des déficits comme l’hyperactivité locomotrice, une réduction du comportement associée à l’anxiété, une augmentation du réflexe de sursaut, une propension à l’isolation, des problèmes dans le conditionnement à la peur, des troubles dans les mémoires de travail, de référence et social. Ainsi, la souris Syngap1+/- représente un modèle approprié pour l’étude des effets délétères causés par l’haploinsuffisance de SYNGAP1 sur le développement de circuits neuronaux. D’autre part, il est de première importance de statuer si les mutations humaines aboutissent à l’haploinsuffisance de la protéine. SYNGAP1 encode pour une protéine à activité GTPase pour Ras. Son haploinsuffisance entraîne l’augmentation des niveaux d’activité de Ras, de phosphorylation de ERK, cause une morphogenèse anormale des épines dendritiques et un excès dans la concentration des récepteurs AMPA à la membrane postsynaptique des neurones excitateurs. Plusieurs études suggèrent que l’augmentation précoce de l’insertion des récepteurs AMPA au sein des synapses glutamatergiques contribue à certains phénotypes observés chez la souris Syngap1+/-. En revanche, les conséquences de l’haploinsuffisance de SYNGAP1 sur les circuits neuronaux GABAergiques restent inconnues. Les enjeux de mon projet de PhD sont: 1) d’identifier l’impact de mutations humaines dans la fonction de SYNGAP1; 2) de déterminer si SYNGAP1 contribue au développement et à la fonction des circuits GABAergiques; 3) de révéler comment l’haploinsuffisance de Syngap1 restreinte aux circuits GABAergiques affecte le comportement et la cognition. Nous avons publié les premières mutations humaines de type faux-sens dans le gène SYNGAP1 (c.1084T>C [p.W362R]; c.1685C>T [p.P562L]) ainsi que deux nouvelles mutations tronquantes (c.2212_2213del [p.S738X]; c.283dupC [p.H95PfsX5]). Ces dernières sont toutes de novo à l’exception de c.283dupC, héritée d’un père mosaïque pour la même mutation. Dans cette étude, nous avons confirmé que les patients pourvus de mutations dans SYNGAP1 présentent, entre autre, des phénotypes associés à des troubles comportementaux relatifs à la déficience intellectuelle. En culture organotypique, la transfection biolistique de l’ADNc de Syngap1 wild-type dans des cellules pyramidales corticales réduit significativement les niveaux de pERK, en fonction de l’activité neuronale. Au contraire les constructions plasmidiques exprimant les mutations W362R, P562L, ou celle précédemment répertoriée R579X, n’engendre aucun effet significatif sur les niveaux de pERK. Ces résultats suggèrent que ces mutations faux-sens et tronquante résultent en la perte de la fonction de SYNGAP1 ayant fort probablement pour conséquences d’affecter la régulation du développement cérébral. Plusieurs études publiées suggèrent que les déficits cognitifs associés à l’haploinsuffisance de SYNGAP1 peuvent émerger d’altérations dans le développement des neurones excitateurs glutamatergiques. Toutefois, si, et auquel cas, de quelle manière ces mutations affectent le développement des interneurones GABAergiques résultant en un déséquilibre entre l’excitation et l’inhibition et aux déficits cognitifs restent sujet de controverses. Par conséquent, nous avons examiné la contribution de Syngap1 dans le développement des circuits GABAergiques. A cette fin, nous avons généré une souris mutante knockout conditionnelle dans laquelle un allèle de Syngap1 est spécifiquement excisé dans les interneurones GABAergiques issus de l’éminence ganglionnaire médiale (souris Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+). En culture organotypique, nous avons démontré que la réduction de Syngap1 restreinte aux interneurones inhibiteurs résulte en des altérations au niveau de leur arborisation axonale et dans leur densité synaptique. De plus, réalisés sur des coupes de cerveau de souris Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+, les enregistrements des courants inhibiteurs postsynaptiques miniatures (mIPSC) ou encore de ceux évoqués au moyen de l’optogénétique (oIPSC) dévoilent une réduction significative de la neurotransmission inhibitrice corticale. Enfin, nous avons comparé les performances de souris jeunes adultes Syngap1+/-, Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+ à celles de leurs congénères contrôles dans une batterie de tests comportementaux. À l’inverse des souris Syngap1+/-, les souris Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+ ne présentent pas d’hyperactivité locomotrice, ni de comportement associé à l’anxiété. Cependant, elles démontrent des déficits similaires dans la mémoire de travail et de reconnaissance sociale, suggérant que l’haploinsuffisance de Syngap1 restreinte aux interneurones GABAergiques dérivés de l’éminence ganglionnaire médiale récapitule en partie certains des phénotypes cognitifs observés chez la souris Syngap1+/-. Mes travaux de PhD établissent pour la première fois que les mutations humaines dans le gène SYNGAP1 associés à la déficience intellectuelle causent la perte de fonction de la protéine. Mes études dévoilent, également pour la première fois, l’influence significative de ce gène dans la régulation du développement et de la fonction des interneurones. D’admettre l’atteinte des cellules GABAergiques illustre plus réalistement la complexité de la déficience intellectuelle non syndromique causée par l’haploinsuffisance de SYNGAP1. Ainsi, seule une compréhension raffinée de cette condition neurodéveloppementale pourra mener à une approche thérapeutique adéquate.