Réponse cellulaire pan-spécifique : analyse de la présentation d’antigènes conservés du virus de l’influenza

Les méthodes de vaccination actuelles contre l’influenza, axées sur la réponse à anticorps dirigée contre des antigènes hautement variables, nécessitent la production d’un vaccin pour chaque nouvelle souche. Le défi est maintenant de stimuler simultanément une réponse cellulaire pan-spécifique ciblant des antigènes conservés du virus, tel que la protéine de la matrice (M1) ou la nucléoprotéine (NP). Or, la présentation antigénique de ces protéines est peu définie chez l’humain. Nous avons analysé la présentation endogène par les complexes majeurs d’histocompatibilité de classes (CMH)-I et -II de M1 et de NP. Ainsi, les protéines M1 et NP ont été exprimées dans des cellules présentatrices d’antigènes (CPAs). Notamment, des épitopes de M1 et de NP endogènes peuvent être présentées par CMH-I et -II, ce qui résulte en une activation respectivement de lymphocytes T CD8+ et CD4+ précédemment isolés. Étant donné l’importance des lymphocytes T CD4+ dans la réponse cellulaire, nous avons cloné M1 ou NP en fusion avec des séquences de la protéine gp100 permettant la mobilisation vers les compartiments du CMH-II sans affecter la présentation par CMH-I. Des CPAs exprimant de façon endogène ces constructions modifiées ou sauvages ont ensuite été utilisées pour stimuler in vitro des lymphocytes T humains dont la qualité a été évaluée selon la production de cytokines et la présence de molécules de surface (ELISA ou marquage de cytokines intracellulaire). Nous avons observé une expansion de lymphocytes T CD8+ et CD4+ effecteurs spécifiques sécrétant diverses cytokines pro-inflammatoires (IFN-γ, TNF, MIP-1β) dans des proportions comparables avec une présentation par CMH-II basale ou améliorée. Cette qualité indépendante du niveau de présentation endogène par CMH-II de M1 et de NP des lymphocytes T CD4+ et CD8+ suggère que cette présentation est suffisante à court terme. En outre, la présentation endogène de M1 et NP a permis de stimuler des lymphocytes T spécifiques à des épitopes conservés du virus, tel qu’identifié à l’aide une méthode d’identification originale basée sur des segments d’ARNm, « mRNA PCR-based epitope chase (mPEC) ». Ensemble, ces nouvelles connaissances sur la présentation antigénique de M1 et de NP pourraient servir à établir de nouvelles stratégies vaccinales pan-spécifiques contre l’influenza.

Caractérisation de DKK1 comme antigène tumoral et manipulation des lymphocytes T CD8 : utilisation de la voie de Wnt en immunothérapie du cancer

L’immunothérapie tumorale à médiation cellulaire est un traitement qui utilise le système immunitaire des patients afin d’induire une réponse des lymphocytes T CD8+ (T CD8+) contre la tumeur. Cette réponse est produite suite à la reconnaissance des antigènes par les T CD8+. Ces cibles sont appelées antigènes tumoraux (TAA) et définies comme des protéines exprimées par les cellules cancéreuses mais absentes des tissus normaux. Par une approche bio-informatique, notre laboratoire a identifié Dickkopf-1 (DKK1), une protéine inhibitrice de la voie de Wnt, comme un TAA potentiel. Une immunothérapie à médiation cellulaire efficace requiert l’identification de TAA candidats pertinents. Le traitement de patients par immunothérapie pourrait également être améliorées par l’augmentation de la puissance d’action anti-tumorale ainsi que la persistante des T CD8+ spécifiques aux TAA. Ce projet de doctorat se divise en deux parties : 1- La caractérisation de l’expression de DKK1 dans les cancers communs et la détermination de son immunogénicité afin de valider sa candidature comme TAA. 2- La reprogrammation des T CD8+, de patients atteints d’un cancer commun, vers un phénotype moins différentié afin d’augmenter leur potentiel anti-tumoral et leur persistance. Dans le premier objectif, nous avons caractérisé l’expression de DKK1 dans le cancer du sein et dans d’autres cancers communs. Le profil d’expression de DKK1 a été étudié par RT-PCR et par ELISA dans plusieurs lignées cellulaires de cancer et dans les tissus normaux. L’expression de DKK1 a aussi été étudiée dans des échantillons cliniques provenant de cancers du sein, du poumon et du rein. Trente pourcents (30%) des tumeurs provenant d’un cancer du sein exprimaient DKK1. La moitié des tumeurs DKK1(+) était triple négative, donc pas de récepteurs d’œstrogène et de progestérone et était Her-2/neu(-) (ces patientes ont des possibilités de traitements très restreintes). De plus, 50% des échantillons cliniques de tumeurs du poumon et 30% des tumeurs de rein exprimaient DKK1. Les observations effectuées dans le cancer du poumon ont été, par la suite, corroborées par d'autres groupes qui ont montré une corrélation entre l'expression de DKK1 et un mauvais pronostic. Après avoir confirmée l’expression de DKK1 dans les cancers communs, justifiant ainsi sa candidature comme TAA, nous avons évalué l’immunogénicité de DKK1. Pour ce faire, nous avons effectué des stimulations in vitro de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de patient(e)s atteint(e)s d’un cancer du sein ou du poumon avec des peptides dérivés de DKK1 pouvant être présentés par les complexes majeurs d’histocompatibilité (CMH) HLA-A*0201. Des clones de T CD8+ reconnaissant un peptide de DKK1 ont été identifiés et isolés. Par essai multiplex et cytométrie de flux intracellulaire, la polyfonctionnalité d’un ces clones T CD8+ spécifiques à DKK1 a été étudiée et a révélée un profil effecteur, renforçant ainsi la candidature de DKK1 comme TAA. Dans l’ensemble, les résultats obtenus dans cette première partie de thèse suggèrent une possible utilisation de DKK1 en immunothérapie contre les cancers communs, attribuable à son expression dans ces cancers et la possibilité de faire proliférer des T CD8+ effecteurs spécifiques à DKK1 à partir de sang de patients. Dans la seconde partie de cette thèse, je décrirai la manipulation in vitro des T CD8+ de patients atteints d’un cancer commun, afin d’augmenter la force et la durée de leurs fonctions anti-tumorales. Il a été démontré que des lymphocytes moins différentiés sont capables d’une réponse immunologique plus efficace et durable. Nous avons basé ce projet sur l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique de la GSK-3, pour activer de la voie de Wnt chez les T CD8+ et ainsi leur conférer un phénotype moins différentié, partageant des caractéristiques de la cellule naïve et de la cellule mémoire. Des cultures de T CD8+, spécifiques à des antigènes viraux, en présence de l’inhibiteur ont permis d’augmenter la sécrétion d’interféron (IFN)- et leur activité cytotoxique. Ces résultats indiquent un effet de l’activation de la voie de Wnt sur la fonction des T CD8+. Ces observations sont rapportées pour la première fois chez les T CD8+ humains et suggèrent une nouvelle stratégie, applicables à l’immunothérapie du cancer, afin de prolonger la persistance des cellules ainsi que leur activité anti-tumorale. En conclusion, ces travaux de recherche ont mené à la réalisation d’une étape très importante dans la validation de la candidature de DKK1 comme TAA pour les cancers communs, soit la démonstration de son expression dans ces cancers et son absence dans les tissus normaux dérivés d’organes importants. Ces travaux ont également mené à la démonstration de l’immunogénicité de DKK1, par l’identification d’un peptide de DKK1 reconnu par les T CD8+. De plus, l’étude de la polyfonctionnalité des T CD8+ spécifiques à DKK1 a révélée un profil effecteur favorable pour l’obtention d’une réponse anti-tumorale efficace. Ces découvertes pourraient servir à l’élaboration d’une stratégie d’immunothérapie à médiation cellulaire pour les cancers communs. Pour sa part, l’étude phénotypique et fonctionnelle de la modulation de la voie de Wnt dans les T CD8+ a donné lieu à l’observation d’un phénotype encore jamais rapporté chez l’humain, conférant aux T CD8+ un aspect moins différentié avec des caractéristiques propre à un phénotype mémoire. Ces résultats sont pertinents dans l’amélioration de l’immunothérapie du cancer, passant par l’augmentation de la persistance des lymphocytes. En résumé, les résultats présentés dans cette thèse de doctorat fournissent des évidences indéniables quant à la validation de DKK1 comme TAA pour une immunothérapie à médiation cellulaire des cancers communs. Ces résultats fournissent également des preuves quant à la pertinence de la reprogrammation des T CD8+ par l’activation de la voie de la voie de Wnt, afin de générer des lymphocytes médiateurs plus efficaces pour ce type de thérapie.

Identification des peptides du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I par spectrométrie de masse

L’immunité adaptive et la discrimination entre le soi et le non-soi chez les vertébrés à mâchoire reposent sur la présentation de peptides par les récepteurs d’histocompatibilité majeur de classe I. Les peptides antigéniques, présentés par les molécules du complexe d’histocompatibilité (CMH), sont scrutés par les lymphocytes T CD8 pour une réponse immunitaire appropriée. Le répertoire des peptides du CMH de classe I, aussi appelé immunopeptidome, est généré par la dégradation protéosomale des protéines endogènes, et a un rôle essentiel dans la régulation de l’immunité cellulaire. La composition de l’immunopeptidome dépend du type de cellule et peut présenter des caractéristiques liées à des maladies comme le cancer. Les peptides antigéniques peuvent être utilisés à des fins immunothérapeutiques notamment dans le traitement voire la prévention de certains cancers. La spectrométrie de masse est un outil de choix pour l’identification, le séquençage et la caractérisation de ces peptides. Cependant, la composition en acides aminés, la faible abondance et la diversité de ces peptides compliquent leur détection et leur séquençage. Nous avons développé un programme appelé StatPeaks qui permet de calculer un certains nombres de statistiques relatives à la fragmentation des peptides. À l’aide de ce programme, nous montrons sans équivoque que les peptides du CMH classe I, en mode de fragmentation par dissociation induite par collision (CID), fragmentent très différemment des peptides trypsiques communément utilisés en protéomique. Néanmoins, la fragmentation par décomposition induite par collision à plus haute énergie (HCD) proposée par le spectromètre LTQ-Orbitrap Velos améliore la fragmentation et fournit une haute résolution qui permet d’obtenir une meilleure confiance dans l’identification des peptides du CMH de classe I. Cet avantage permet d’effectuer le séquençage de novo pour identifier les variants polymorphes qui ne sont normalement pas identifiés par les recherches utilisant des bases de données. La comparaison des programmes de séquençage Lutefisk, pepNovo, pNovo, Vonode et Peaks met en évidence que le dernier permet d’identifier un plus grand nombre de peptides du CMH de classe I. Ce programme est intégré dans une chaîne de traitement de recherche d’antigènes mineurs d’histocompatibilité. Enfin, une base de données contenant les informations spectrales de plusieurs centaines de peptides du CMH de classe I accessible par Internet a été développée.

Développement d'une méthode d'isolation des noyaux adaptée aux macrophages pour une caractérisation protéomique d'une nouvelle structure autophagique induite par le virus HSV-1

L’autophagie est un processus cellulaire catabolique qui a été conservé durant l’évolution de la levure à l’homme. Cet important mécanisme consiste en une dégradation des composants cytoplasmiques dans une structure lytique, le lysosome. Il existe trois types de l’autophagie : la microautophagie, l’autophagie médiée par les chaperones et la macroautophagie nommée « autophagie ». Il a été démontré que lors de l’autophagie, le matériel cytoplasmique (protéines cytosoliques et organites) est séquestré dans l’autophagosome qui finit par fusionner avec le lysosome, formant ainsi l’autophagolysosome. Le matériel séquestré et la membrane interne de l’autophagosome seront dégradés par les hydrolases lysosomales. Plusieurs études se sont focalisées sur la détermination de la machinerie moléculaire et les mécanismes de l’autophagie. Il a été démontré l’implication de 31 molécules Atg essentielles dans le processus de l’autophagie. L’identification de ces protéines a permis de déceler le rôle de l’autophagie non seulement dans le maintien de l’homéostasie cellulaire mais aussi dans la défense contre les agents pathogènes. En effet, l’autophagie joue un rôle important dans l’immunité innée conduisant à contrôler l’évasion des pathogènes dont les bactéries et les virus. Également, l’autophagie est impliquée dans l’immunité adaptative en favorisant la présentation des antigènes viraux par le CMH de classe II aux cellules T CD4+. De plus, une étude récente suggère que l’autophagie contribue à la présentation antigénique par le CMH de classe I aux cellules T CD8+ durant une infection virale par le virus HSV-1 (Herpes simplex type 1). Toutefois, certains virus y compris HSV-1 ont pu développer des mécanismes pour contourner et inhiber en partie le rôle protecteur de l’autophagie. Récemment, une étude dans notre laboratoire a mis en évidence, lors d’une infection virale par HSV-1 des cellules macrophages BMA, la présence d’une nouvelle structure autophagique dans une phase tardive de l’infection. Cette nouvelle structure est différente des autophagosomes classiques à double membrane et est caractérisée morphologiquement par quatre membranes dérivées de l’enveloppe nucléaire interne et externe. Peu de choses ont été rapportées sur cette nouvelle voie autophagique qui peut être un mécanisme de défense cellulaire quand l’autophagie classique dans le cytosol est inhibée par HSV-1. Il devient donc intéressant de caractériser les molécules impliquées dans la formation de ces autophagosomes issus du noyau par spectrométrie de masse. Pour ce faire, il était impératif d’établir un outil d’isolation des noyaux à partir de macrophages infectés par HSV-1 dans lesquels les autophagosomes issus des noyaux seront formés. La validation de cette méthode d’isolation a été effectuée en déterminant la pureté et l’intégrité des noyaux isolés à partir des cellules non infectées (contrôle) et infectées par HSV-1. La pureté des préparations de noyaux isolés a été caractérisée par l’absence de contaminants cellulaires et un enrichissement en noyaux. Également, il a fallu déterminer la cinétique de formation des autophagosomes issus des noyaux pour les deux lignées cellulaires de macrophages utilisées dans ce projet. Dans une perspective future, l’analyse protéomique à partir des échantillons purs des noyaux isolés (non infectés et infectés) mènera à identifier les protéines impliquées dans la formation des autophagosomes dérivés des noyaux, ce qui permettra ultérieurement d’effectuer des études sur les mécanismes moléculaires et les fonctions de cette nouvelle voie autophagique.

Étude fonctionnelle et génétique d'une population de lymphocytes T CD4-CD8- impliquée dans la résistance au diabète auto-immun chez la souris

Le diabète auto-immun résulte de la destruction des cellules bêta pancréatiques sécrétrices d’insuline par les lymphocytes T du système immunitaire. Il s’ensuit une déficience hormonale qui peut être comblée par des injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, toutefois il demeure à ce jour impossible de guérir les patients atteints de la maladie. De façon générale, un système immunitaire sain reconnaît une multitude d’antigènes différents et assure ainsi notre défense à l’égard de différents pathogènes ou encore de cellules tumorales. Il arrive cependant que, pour des raisons génétiques et/ou environnementales, les lymphocytes T puissent s’activer de façon aberrante suite à la reconnaissance d’antigènes provenant du soi. C’est ce bris de tolérance qui mène au développement de pathologies auto-immunes telles que le diabète auto-immun. Afin de limiter l’auto-immunité, des mécanismes de sélection stricts permettent d’éliminer la majorité des lymphocytes T présentant une forte affinité envers des antigènes du soi lors de leur développement dans le thymus. Certains de ces lymphocytes réussissent toutefois à échapper à l’apoptose et migrent en périphérie afin d’y circuler en quête d’un antigène spécifiquement reconnu. Il est alors primordial que des mécanismes périphériques assurent le maintien de la tolérance immunitaire en faisant obstacle à l’activation et à la prolifération des lymphocytes T auto-réactifs. L’une des avenues afin d’inhiber le développement de réponses immunitaires aberrantes est la génération de lymphocytes T régulateurs. Ces cellules, d’origine thymique ou périphérique, peuvent arborer différents phénotypes et agissent via de multiples mécanismes afin d’inactiver et/ou éliminer les cellules impliquées dans l’apparition de pathologies auto-immunes. L’utilisation de modèles murins transgéniques a permis la mise en évidence d’une population peu caractérisée de lymphocytes T au potentiel régulateur. En effet, la proportion de ces cellules T n’exprimant pas les corécepteurs CD4 et CD8 (double négatives, DN) a été inversement corrélée à la prédisposition à l’auto-immunité chez ces ii souris. L’objectif principal de cette thèse est de démontrer la fonction immuno-régulatrice des lymphocytes T DN, tout en investiguant les facteurs génétiques responsables du maintien de cette population cellulaire. Nous avons observé que les lymphocytes T DN exercent une activité cytotoxique à l’égard des lymphocytes B de façon spécifique à l’antigène, via la libération de granules cytolytiques contenant du granzyme B et de la perforine. Par ailleurs, nous avons établi qu’un unique transfert adoptif de ces cellules est suffisant afin d’inhiber le développement du diabète auto-immun chez des hôtes transgéniques prédisposés à la maladie. Le recours à des souris déficientes pour l’expression du gène CD47 a permis de constater que la voie de signalisation CD47-Sirp est essentielle dans le maintien de la proportion des lymphocytes T DN. De plus, le locus murin de prédisposition au diabète auto-immun Idd13, qui contient le gène Sirp, a été identifié pour son rôle dans la régulation de la proportion de ces cellules. Finalement, une analyse génétique a révélé que d’autres intervalles génétiques sont impliqués dans le contrôle de la population des lymphocytes T DN. Parmi ceux-ci, un locus situé en région proximale du chromosome 12 a été validé grâce à la création de souris congéniques. Grâce aux résultats présentés dans cette thèse, notre compréhension de la biologie ainsi que de la régulation des lymphocytes T DN est approfondie. Ces connaissances constituent un pas important vers la création de thérapies cellulaires novatrices permettant de prévenir et de guérir diverses pathologies auto-immunes.

Étude des fonctions immunomodulatrices des lymphocytes T « Doubles-Négatifs »

La réaction du greffon contre l’hôte (GvH) est responsable d’un grand taux de morbidité et de mortalité chez les patients recevant des greffes de cellules souches (GCSH) allogéniques. Dans ce contexte, les cellules T régulatrices sont largement étudiées et semblent avoir un grand potentiel d’utilisation dans le domaine de la thérapie cellulaire de la GvH. Parmi les populations cellulaires T régulatrices, les lymphocytes T CD4-CD8- TCRαβ+ « Doubles-Négatifs » (DN), qui ne représentent que 1-3% des lymphocytes T, ont été décrits. Ces cellules ont des propriétés inhibitrices de la réponse immunitaire qui s’avèrent spécifiques aux antigènes auxquels elles ont préalablement été exposées. La répression de la réponse immunitaire par les cellules T DN régulatrices semble être un mécanisme important impliqué dans l’induction de la tolérance aux allo-antigènes. De plus, ces cellules confèrent une tolérance immunitaire dans des modèles de greffes allogéniques et xénogéniques. En effet, ces cellules ont la capacité d’inhiber la réaction contre un allo-antigène auquel elles ont été exposées, sans inhiber la réaction contre un allo-antigène inconnu. Les cellules T DN ont été isolées et caractérisées chez l’homme où elles ont la capacité d’interagir avec des cellules présentatrices d’antigènes (APCs) par un contact cellulaire, comme chez la souris. Cependant, leur capacité immunomodulatrice reste inconnue chez l’humain. Notre objectif consistait donc principalement à étudier le rôle et le mécanisme d’action des cellules T DN régulatrices humaines in vitro, en étudiant leur capacité à inhiber une réaction lymphocytaire mixte (MLR). Nous avons montré que les cellules T DN stimulées par un allo-antigène donné inhibent des cellules syngéniques effectrices dirigées contre ce même alloantigène mais n’inhibent pas des cellules syngéniques effectrices dirigées contre un autre alloantigène, démontrant ainsi la spécificité aux antigènes de ces cellules. De plus, les T DN non stimulées par un allo-antigène n’ont pas de rôle inhibiteur. Cependant, durant cette inhibition, nous n’observons pas de modulation de l’expression des marqueurs d’activation et d’induction de l’apoptose. Afin d’étudier le mécanisme d’action des cellules T DN, nous avons mesuré l’expression intracellulaire de la granzyme B. Les résultats démontrent que les cellules T DN stimulées expriment un niveau significativement plus élevé de granzyme B que les cellules T DN non-stimulées par l’allo-antigène. Ceci suggère que l’immunosuppression induite par les cellules T DN stimulées pourrait passer par la voie granzyme B. Le mécanisme utilisé par ces cellules reste à être confirmé par nos futures expériences.

Étude sur le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline chez le porc à l'abattoir au Québec, Canada

Le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) est un pathogène important qui a été identifié comme agent d‟infection chez les animaux d‟élevage et les travailleurs exposés à ces animaux. Au Canada, très peu d‟informations sont disponibles concernant les SARMs d‟origine porcine. L‟objectif de cette étude était de déterminer la prévalence des SARMs provenant de porcs à l‟abattoir, de caractériser leur résistance aux antibiotiques ainsi que d‟évaluer le niveau de séroconversion des porcs envers le S. aureus chez les animaux porteurs ou non du SARM. Un total de 107 isolats ont été identifiés positifs aux SARMs sur 660 échantillons. La prévalence de SARMs à l‟abattoir A était de 30,8% et de 23,8% à l‟abattoir B. La susceptibilité aux antibiotiques a été déterminée en utilisant la méthode de micro-dilution de Sensititre. Tous les isolats ont démontré une sensibilité envers la ciprofloxacine, la gatifloxacine, la gentamicine, la lévofloxacine, le linézolide, la quinupristine/dalfopristine, la rifampicine, la streptomycine, le triméthoprime/sulfaméthoxazole et la vancomycine. De la résistance a été observée envers la daptomycine (0,93%), l‟érythromycine (29%), la clindamycine (29%), la tétracycline (98,1%). De plus, 30% des SARMs isolés étaient résistants à plus de deux antibiotiques autres que les β-lactamines. Par typage, deux clones prédominants ont été obtenus ainsi que deux types de SCCmec (type V et possiblement un nouveau type comprenant les cassettes III et IVb). 15 clones ont été identifiés par typage MLVA, comprenant les clones prédominants VI (40.1%; 43/107) et XI (17.7%; 19/107). Deux souches de SARMs ont été caractérisées par biopuce à ADN et des gènes d‟antibiorésistance, de typage (SCCmec et MLST) et de virulence ont été identifiés. Sans considération pour le site de colonisation, les porcs SA-/MRSA- (n=34) et les porcs SA+ (n=194) montrent, respectivement, des taux de séroconversion de 20.6% et 32.5%. Les porcs colonisés par un SARM à un site de iv prélèvement et non colonisés par un SA à l‟autre site (n=18) montrent une séroconversion (5.6%) significativement (P < 0.05) plus faible comparativement aux porcs colonisés par SA à un ou deux sites de prélèvement et n‟ayant pas de SARM. Nos résultats démontrent que les porcs provenant d‟abattoir peuvent être colonisés par des SARMs multi-résistants aux antibiotiques. De plus, ces SARMs sont possiblement capable de coloniser leurs hôtes sans stimuler la production d‟anticorps et ce par l‟atténuation de la réponse immunitaire ou par la colonisation de porcs qui sont moins immunocompétents.

Influence des facteurs immuno-modulateurs d'origine placentaire sur la différenciation et la maturation des cellules dendritiques plasmacytoïdes

Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont des cellules dendritiques spécialisées, aussi connues sous le nom de cellules productrices d’interféron-α (IFN-α). Les pDC jouent un rôle essentiel dans l’induction de la réponse immunitaire antivirale, en reconnaissant les antigènes viraux via les Toll-like receptors (TLR) 7 et 9. Toutefois, les pDC du sang de cordon sont incapables de produire de l’IFN-α en réponse à une stimulation du TLR9, mais leur maturation en cellules présentatrices d’antigènes est normale. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes intéressés aux effets des facteurs immuno-régulateurs sécrétés par le placenta sur la différenciation et la fonction des pDC. Nous avons analysé l’effet, seules ou en combinaison, de la progestérone (PG), de l'interleukine (IL)-10 et du tumor growth factor (TGF)-β sur la différenciation et la fonction des pDC. Nous démontrons qu’à des niveaux supra-physiologiques ces trois facteurs modulent la différenciation et la production d’IFN-α des pDC. À des niveaux observés dans le sang de cordon, ces facteurs ont peu d’impact sur les pDC lorsque utilisés individuellement. Toutefois lorsque utilisés en combinaison, ils diminuent la production d’IFN-α. Nous avons aussi démontré que la PG, l’IL-10 et le TGF-β n’induisent pas l’expression des micro-ARN 146a et 155 par les pDC. Finalement nous démontrons que les niveaux de ces molécules sont plus élevés dans le sang de cordon que dans le sang d’adulte. Nos résultats révèlent le rôle important des facteurs immuno-régulateurs sécrétés par le placenta sur la fonction des pDC et en conséquence, sur la réponse immunitaire fœtale et néonatale.

MARCH1 : new insights in the activation of B cells

L’implication des cellules B dans le développement de l’auto-immunité ne cesse d’être illustrée par de récentes publications. Les cellules présentent des peptides du soi aux cellules T auto-réactives ce qui mène à la production de cytokines pro-inflammatoires et d’anticorps auto-réactifs. Dans le présent document, nous explorons la présentation antigénique et la modification post-traductionnelle du complexe majeur d’histocompatibilité II (CMH-II). MARCH1 est une E3 ubiquitine ligase qui cible le CMH-II et le relocalise le complexe vers les endosomes de recyclage. Ainsi, MARCH1 est un inhibiteur de la présentation d’antigènes exogènes. Ici, nous démontrons que MARCH1 est exprimé seulement dans la sous-population des cellules B folliculaires et que cette expression est perdue lors de l’entrée dans les centres germinatifs. Nous proposons que MARCH1 établie une barrière de formation de centres germinatifs. Nous démontrons le lien entre MARCH1 et la hausse de CMH-II à la surface des cellules B à la suite d’un traitement à l’IL-10. De plus, nous avons testé plusieurs stimuli activateurs des cellules B et démontrons que MARCH1 est régulé à la baisse dans tous les cas. De plus, nous mettons en valeurs le rôle de la voie canonique d’activation de NF-κB dans cette régulation de MARCH1. Finalement, nous avons développé un système de lentivirus exprimant MARCH1 qui nous permet de forcer l’expression de MARCH1 dans des cellules réfractaires à la transfection. Nous discutons de l’implication de cette régulation du CMH-II par MARCH1 dans le développement de maladies auto-immunes.

Alternative splicing by hnRNP L as a new modulator of hematopoietic cell differentiation, survival and migration

Les modifications post-transcriptionnelles de l’ARN messager (ARNm), comme l’épissage alternatif, jouent un rôle important dans la régulation du développement embryonnaire, de la fonction cellulaire et de l’immunité. De nouvelles évidences révèlent que l’épissage alternatif serait également impliqué dans la régulation de la maturation et de l’activation des cellules du système hématopoïétique. Le facteur hnRNP L a été identifié comme étant le principal régulateur de l’épissage alternatif du gène codant pour le récepteur CD45 in vitro. Le récepteur CD45 est une tyrosine phosphatase exprimée par toutes les cellules du système hématopoïétique qui contrôle le développement et l’activation des lymphocytes T. Dans un premier temps, nous avons étudié la fonction du facteur hnRNP L dans le développement des lymphocytes T et dans l’épissage de l’ARNm de CD45 in vivo en utilisant des souris dont le gène de hnRNP L a été supprimé spécifiquement dans les cellules T. La délétion de hnRNP L dans les thymocytes résulte en une expression aberrante des différents isoformes de CD45 avec une prédominance de l'isoforme CD45RA qui est généralement absent dans le thymus. Une conséquence de la délétion de hnRNP L est une diminution de la cellularité du thymus causée par un blocage partiel du développement des cellules pré-T au stade DN4. Cette réduction du nombre de cellules dans le thymus n’est pas liée à une hausse de la mort cellulaire. Les thymocytes déficients pour hnRNP L démontrent plutôt une prolifération augmentée comparée aux thymocytes sauvages due à une hyper-activation des kinases Lck, Erk1/2 et Akt. De plus, la délétion de hnRNP L dans le thymus cause une perte des cellules T en périphérie. Les résultats des expériences in vitro suggèrent que cette perte est principalement due à un défaut de migration des thymocytes déficients pour hnRNP L du thymus vers la périphérie en réponse aux chimiokines. L’épissage alternatif de CD45 ne peut expliquer ce phénotype mais l’identification de cibles par RNA-Seq a révélé un rôle de hnRNP L dans la régulation de l’épissage alternatif de facteurs impliqués dans la polymérisation de l’actine. Dans un second temps, nous avons étudié le rôle de hnRNP L dans l’hématopoïèse en utilisant des souris dont la délétion de hnRNP L était spécifique aux cellules hématopoïétiques dans les foies fœtaux et la moelle osseuse. L’ablation de hnRNP L réduit le nombre de cellules progénitrices incluant les cellules progénitrices lymphocytaires (CLPs), myéloïdes (CMPs, GMPs) et mégakaryocytes-érythrocytaires (MEPs) et une perte des cellules hématopoïétiques matures. À l’opposé des cellules progénitrices multipotentes (MPPs) qui sont affectées en absence de hnRNP L, la population de cellules souches hématopoïétiques (HSCs) n’est pas réduite et prolifère plus que les cellules contrôles. Cependant, les HSCs n’exprimant pas hnRNP L sont positives pour l'Annexin V et expriment CD95 ce qui suggère une mort cellulaire prononcée. Comme pour les thymocytes, une analyse par RNA-Seq des foies fœtaux a révélé différents gènes cibles de hnRNP L appartenant aux catégories reliées à la mort cellulaire, la réponse aux dommages à l’ADN et à l’adhésion cellulaire qui peuvent tous expliquer le phénotype des cellules n’exprimant pas le gène hnRNP L. Ces résultats suggèrent que hnRNP L et l’épissage alternatif sont essentiels pour maintenir le potentiel de différenciation des cellules souches hématopoïétiques et leur intégrité fonctionnelle. HnRNP L est aussi crucial pour le développement des cellules T par la régulation de l’épissage de CD45 ainsi que pour leur migration.

Remodelage du muscle lisse péribronchique dans l’inflammation respiratoire chronique

Le souffle chez les chevaux et l’asthme chez l’humain sont des maladies respiratoires qui partagent plusieurs caractéristiques, notamment des épisodes de bronchospasme et de détresse respiratoire dus à une inflammation pulmonaire inappropriée en réponse à une inhalation de substances antigéniques. Les manifestations cliniques incluent des efforts respiratoires augmentés, des sifflements et de la toux. Au niveau des voies respiratoires, on observe une augmentation du muscle lisse péribronchique, une fibrose sous épithéliale, une métaplasie/hyperplasie épithéliale et du mucus en quantité augmentée. L’augmentation du muscle lisse est particulièrement importante car elle n’affecte pas seulement le calibre basal des voies respiratoires, mais elle accentue l’obstruction respiratoire lors de bronchoconstriction. Ces changements sont regroupés sous le terme de « remodelage » et sont associés à un déclin accéléré de la fonction respiratoire chez les patients asthmatiques. Alors que les traitements actuels contrôlent efficacement le bronchospasme et relativement bien l’inflammation, leurs effets sur le remodelage sont mal connus. Dans le cadre de thèse, la réversibilité du remodelage musculaire péribronchique a été investiguée chez des chevaux atteints du souffle dans deux études longitudinales. Ces études, faites principalement sur du tissu pulmonaire prélevé par thoracoscopie, sont difficilement réalisables chez l’humain pour des raisons éthiques, ou chez d’autres animaux, car ceux-ci présentent rarement une inflammation de type asthmatique de façon spontanée. Les résultats démontrent que les chevaux atteints du souffle ont approximativement deux fois plus de muscle péribronchique que les chevaux sains d’âge similaire gardés dans les mêmes conditions, et que la prolifération des myocytes contribue à cette augmentation. Ils démontrent aussi qu’une stimulation antigénique relativement brève chez des chevaux atteints du souffle depuis plusieurs années n’accentue pas le remodelage, ce qui suggère que l’augmentation du muscle lisse atteint un plateau. Nous avons également montré que le remodelage du muscle lisse chez des chevaux adultes est partiellement réversible et que cette réversibilité peut être accélérée par l’administration de corticostéroïdes par inhalation. Il semble toutefois qu’une portion du remodelage chronique est irréversible puisque les corticostéroïdes ont accéléré la diminution du muscle mais sans toutefois mener à une amélioration plus marquée au terme de l’étude qu’avec une modification environnementale stricte. La diminution de trente pourcent observée sur un an paraît modeste mais elle démontre clairement, et pour une première fois, que le remodelage du muscle lisse présent chez des chevaux adultes malades depuis plusieurs années est au moins partiellement réversible.

Structure-fonction de MARCH1, une E3 ubiquitine ligase régulant la présentation antigénique par le CMH II

Les molécules classiques du CMH de classe II sont responsables de la présentation de peptides exogènes par les cellules présentatrices d’antigène aux lymphocytes T CD4+. Cette présentation antigénique est essentielle à l’établissement d’une réponse immunitaire adaptative. Cependant, la reconnaissance d’auto-antigènes ainsi que l’élimination des cellules du Soi sont des problèmes à l’origine de nombreuses maladies auto-immunes. Notamment, le diabète et la sclérose en plaque. D’éventuels traitements de ces maladies pourraient impliquer la manipulation de la présentation antigénique chez les cellules dont la reconnaissance et l’élimination engendrent ces maladies. Il est donc primordial d’approfondir nos connaissances en ce qui concerne les mécanismes de régulation de la présentation antigénique. La présentation antigénique est régulée tant au niveau transcriptionnel que post-traductionnel. Au niveau post-traductionnel, diverses cytokines affectent le processus. Parmi celles-ci, l’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, cause une rétention intracellulaire des molécules du CMH II. Son mécanisme d’action consiste en l’ubiquitination de la queue cytoplasmique de la chaîne bêta des molécules de CMH II. Cette modification protéique est effectuée par MARCH1, une E3 ubiquitine ligase dont l’expression est restreinte aux organes lymphoïdes secondaires. Jusqu’à tout récemment, il y avait très peu de connaissance concernant la structure et les cibles de MARCH1. Considérant son impact majeur sur la présentation antigénique, nous nous sommes intéressé à la structure-fonction de cette molécule afin de mieux caractériser sa régulation ainsi que les diverses conditions nécessaires à son fonctionnement. Dans un premier article, nous avons étudié la régulation de l’expression de MARCH1 au niveau protéique. Nos résultats ont révélé l’autorégulation de la molécule par formation de dimères et son autoubiquitination. Nous avons également démontré l’importance des domaines transmembranaires de MARCH1 dans la formation de dimères et l’interaction avec le CMH II. Dans un second article, nous avons investigué l’importance de la localisation de MARCH1 pour sa fonction. Les résultats obtenus montrent la fonctionnalité des motifs de localisation de la portion C-terminale de MARCH1 ainsi que la présence d’autres éléments de localisation dans la portion N-terminale de la protéine. Les nombreux mutants utilisés pour ce projet nous ont permis d’identifier un motif ‘‘VQNC’’, situé dans la portion cytoplasmique C-terminale de MARCH1, dont la valine est requise au fonctionnement optimal de la molécule. En effet, la mutation de la valine engendre une diminution de la fonction de la molécule et des expériences de BRET ont démontré une modification de l’orientation spatiale des queues cytoplasmiques. De plus, une recherche d’homologie de séquence a révélé la présence de ce même motif dans d’autres ubiquitines ligases, dont Parkin. Parkin est fortement exprimée dans le cerveau et agirait, entre autre, sur la dégradation des agrégats protéiques. La dysfonction de Parkin cause l’accumulation de ces agrégats, nommés corps de Lewy, qui entraînent des déficiences au niveau du fonctionnement neural observé chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. La valine comprise dans le motif ‘’VQNC’’ a d’ailleurs été identifiée comme étant mutée au sein d’une famille où cette maladie est génétiquement transmise. Nous croyons que l’importance de ce motif ne se restreint pas à MARCH1, mais serait généralisée à d’autres E3 ligases. Ce projet de recherche a permis de caractériser des mécanismes de régulation de MARCH1 ainsi que de découvrir divers éléments structuraux requis à sa fonction. Nos travaux ont permis de mieux comprendre les mécanismes de contrôle de la présentation antigénique par les molécules de CMH II.

Les cadres de lectures alternatifs : une approche non-conventionnelle pour le développement de vecteurs vaccinaux

Introduction: Les cadres de lectures alternatifs (CLA) sont utilisés par de multiples virus afin de générer plusieurs protéines à partir d'une seule séquence nucléotidique. Les épitopes dits « cryptiques », c’est-à-dire les épitopes dérivés de protéines codées dans des CLAs, ont étés dernièrement l’objet de différentes études portant sur la réponse immunitaire antivirale et les lymphocytes T cytotoxiques. Méthodologie: Afin de vérifier le potentiel immunogène d'épitopes encodés dans des CLAs programmés, trois cassettes ont été construites pour mener à l'expression de trois épitopes bien caractérisés (épitope GAG77–85 du virus de l'immunodéficience humaine de type 1; épitope NS31406-1415 du virus de l'hépatite C; épitope core18-27 du virus de l'hépatite B) à partir de trois cadres de lectures superposés. La première cassette permet une initiation alternative de la traduction, la deuxième comprend deux signaux bipartites en tandem permettant un frameshift ribosomique et la troisième est une cassette contrôle. Ces éléments ont été introduits dans des vecteurs adénoviraux. Les virions générés ont servi à immuniser des souris C57BL/6 transgéniques pour HLA-A*0201 et HLA-DR1. La réponse immunitaire induite une semaine post-immunisation a été mesurée par essai ELISpot IFN . Résultats: Dans le contexte de cassettes vaccinales, les peptides dérivés d'une initiation alternative de traduction et de changement de cadre de lecture ribosomique ribosomal peuvent être exprimés et détectés par le système immunitaire dans un modèle animal. Conclusion: Ces expériences suggèrent la possibilité de développer de nouvelles stratégies vaccinales dans le but de prévenir ou de guérir certaines maladies associées aux infections virales chroniques telles que celles causées par le virus de l’immunodéficience humaine et le virus de l’hépatite C.

Étude génétique et fonctionnelle des Interferon-producing Killer Dendritic Cells

L’idée qu’une cellule puisse effectuer la cytolyse de cellules transformées, comme une cellule Natural Killer (NK), tout en ayant la capacité de présenter des antigènes, comme une cellule dendritique (DC), peut sembler fantaisiste. Cependant, de telles cellules furent bel et bien identifiées chez la souris en 2006. Ces cellules, nommées Interferon-producing Killer Dendritic Cells (IKDC), furent l’objet d’une caractérisation extensive qui révéla leur énorme potentiel immunologique. La combinaison de fonctions associées à des cellules NK et à des DC a doté les IKDC d’un pouvoir antitumoral remarquable. D’ailleurs, il a été démontré que les IKDC sont plus efficaces que les cellules NK pour limiter la croissance tumorale. Ainsi, suite à leur découverte, les IKDC ont suscité beaucoup d’intérêt. Cependant, une controverse émergea sur la nature des IKDC. Plusieurs groupes indépendants tentèrent de reproduire les expériences attestant les fonctions de DC des IKDC, sans y parvenir. De plus, des études additionnelles révélèrent que les IKDC possèdent des similitudes très importantes avec les cellules NK. Ces observations ont mené la communauté scientifique à suggérer que les IKDC sont des cellules NK en état d’activation (aNK). Malgré cette controverse, les caractéristiques antitumorales des IKDC sont si uniques et considérables qu’il est primordial de poursuivre l’étude de ces cellules. Pour y arriver, il est essentiel de déterminer la nature des IKDC et de mettre fin à ce débat. Par la suite, il sera important d’identifier des façons de cibler spécifiquement les IKDC pour permettre leur usage dans le cadre de thérapies antitumorales. Ainsi, l’objectif de cette thèse est de définir l’identité des IKDC, puis de déterminer les facteurs génétiques responsables de la régulation de ces cellules. Nous avons démontré que les IKDC ne sont pas des cellules aNK, contrairement à ce qui avait été suggéré. Nous avons constaté que les IKDC prolifèrent activement et possèdent un phénotype unique, des caractéristiques associées à des cellules NK très immatures. Afin de déterminer si les IKDC peuvent acquérir un phénotype mature, nous avons effectué des expériences de transfert adoptif. Suite à leur injection in vivo, les IKDC acquièrent un phénotype de cellules matures, mais étonnamment, elles se différencient aussi en cellules NK. Ainsi, nous avons révélé que les IKDC sont un intermédiaire dans la différenciation des cellules NK. En parallèle, nous avons démontré que la proportion d’IKDC varie grandement entre des souris de fond génétique différent, indiquant que des facteurs génétiques sont impliqués dans la régulation de ces cellules. Nous avons alors effectué une analyse génétique qui a révélé que les IKDC sont régulées par des facteurs génétiques compris dans une région distale du chromosome 7. Les résultats présentés dans cette thèse constituent une avancée importante pour la recherche sur les IKDC. Ils ont permis de définir la nature des IKDC et d’identifier un intervalle génétique impliqué dans la régulation de ces cellules. Ces découvertes sont des connaissances précieuses pour l’identification des IKDC chez l’Homme et la création de nouvelles thérapies dans la lutte contre le cancer.

Antigen and superantigen presentation as defined by the MHCII-accessory proteins and associated-peptides

MHCII molecules expose a weave of antigens, which send survival or activation signals to T lymphocytes. The ongoing process of peptide binding to the MHC class II groove implicates three accessory molecules: the invariant chain, DM and DO. The invariant chain folds and directs the MHCII molecules to the endosomal pathway. Then, DM exchanges the CLIP peptide, which is a remnant of the degraded invariant chain, for peptides of better affinity. Expressed in highly specialized antigen presenting cells, DO competes with MHCII molecules for DM binding and favors the presentation of receptor-internalized antigens. Altogether, these molecules exhibit potential immunomodulatory properties that can be exploited to increase the potency of peptide vaccines. DO requires DM for maturation and to exit the ER. Interestingly, it is possible to monitor this interaction through a conformation change on DOβ that is recognized by the Mags.DO5 monoclonal antibody. Using Mags.DO5, we showed that DM stabilizes the interactions between the DO α1 and β1 chains and that DM influences DO folding in the ER. Thus, the Mags.DO5+ conformation correlates with DO egress from the ER. To further evaluate this conformation change, directed evolution was applied to DO. Of the 41 unique mutants obtained, 25% were localized at the DM-DO binding interface and 12% are at the solvent-exposed β1 domain, which is thought to be the Mags.DO5 epitope. In addition, I used the library to test the ability of HLA-DO to inhibit HLA-DM and sorted for the amount of CLIP. Interestingly, most of the mutants showed a decrease inhibitory effect, supporting the notion that the intrinsic instability of DO is a required for its function. Finally, these results support the model in which DO competes against classical MHCII molecules by sequestering DM chaperone’s function. MHCII molecules are also characterized by their ability to present superantigens, a group of bacterial or viral toxins that coerces MHCII-TCR binding in a less promiscuous fashion than what is observed in a canonical setting. While the mechanism of how bacterial superantigens form trimeric complexes with TCR and MHCII is well understood, the mouse mammary tumor virus superantigens (vSAG) are poorly defined. In the absence of a crystal structure, I chose a functional approach to examine the relation between vSAG, MHCII and TCR with the goal of uncovering the overall trimolecular architecture. I showed that TCR concomitantly binds both the MHCII α chain and the vSAG and that TCR-MHCII docking is almost canonical when coerced by vSAGs. Because many peptides may be tolerated in the MHCII groove, the pressure exerted by vSAG seems to tweak conventional TCR-MHCII interactions. Furthermore, my results demonstrate that vSAG binding to MHCII molecules is conformation-dependent and abrogated by the CLIP amino-terminal residues extending outside the peptide-binding groove. In addition, they also suggest that vSAGs cross-link adjacent MHCIIs and activate T cells via a TGXY motif.