153 resultados para ARN ribosomique


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La sélénocystéine est le 21e acide aminé encodé génétiquement et on la retrouve à travers les trois domaines de la vie. Elle est synthétisée sur l'ARNtSec par un processus unique. L'ARNtSec se distingue également au niveau structural. La tige acceptrice possède 8 (procaryotes) et 9 (eucaryotes) paires de bases, contrairement aux ARNt canoniques qui ont invariablement 7 paires de bases dans la tige acceptrice. De plus, la tige D a 2 paires de bases additionnelles qui remplacent les interactions tertiaires universelles 8-14, 15-48 qui sont absentes chez l'ARNtSec. D'autre part, la longueur de la boucle variable de l'ARNtSec est plus longue que la majorité des ARNt de type II. Dans ce mémoire, on se concentre sur la région de la boucle variable de l'ARNtSec . La recherche consiste à distinguer les paires de bases de la boucle variable qui sont essentielles à la biosynthèse et l’insertion de la sélénocystéine. De plus, on regarde si la paire de base additionnelle de la tige acceptrice de l'ARNtSec (procaryote) est essentielle pour l'insertion de la sélénocystéine. Pour répondre à ces questions, on a utilisé l'approche expérimentale Évolution Instantanée qui consiste au criblage in vivo d'ARNtSec fonctionnels chez E. coli. Dans ce travail, on montre que l'insertion de la sélénocystéine ne nécessite pas une spécificité de la longueur ou de la séquence de l'ARNtSec. On montre aussi que ni la longueur de la tige acceptrice ou du domaine tige acceptrice/tige T n'est essentielle pour avoir un ARNtSec fonctionnel.

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Les ARN non codants (ARNnc) sont des transcrits d'ARN qui ne sont pas traduits en protéines et qui pourtant ont des fonctions clés et variées dans la cellule telles que la régulation des gènes, la transcription et la traduction. Parmi les nombreuses catégories d'ARNnc qui ont été découvertes, on trouve des ARN bien connus tels que les ARN ribosomiques (ARNr), les ARN de transfert (ARNt), les snoARN et les microARN (miARN). Les fonctions des ARNnc sont étroitement liées à leurs structures d’où l’importance de développer des outils de prédiction de structure et des méthodes de recherche de nouveaux ARNnc. Les progrès technologiques ont mis à la disposition des chercheurs des informations abondantes sur les séquences d'ARN. Ces informations sont accessibles dans des bases de données telles que Rfam, qui fournit des alignements et des informations structurelles sur de nombreuses familles d'ARNnc. Dans ce travail, nous avons récupéré toutes les séquences des structures secondaires annotées dans Rfam, telles que les boucles en épingle à cheveux, les boucles internes, les renflements « bulge », etc. dans toutes les familles d'ARNnc. Une base de données locale, RNAstem, a été créée pour faciliter la manipulation et la compilation des données sur les motifs de structure secondaire. Nous avons analysé toutes les boucles terminales et internes ainsi que les « bulges » et nous avons calculé un score d’abondance qui nous a permis d’étudier la fréquence de ces motifs. Tout en minimisant le biais de la surreprésentation de certaines classes d’ARN telles que l’ARN ribosomal, l’analyse des scores a permis de caractériser les motifs rares pour chacune des catégories d’ARN en plus de confirmer des motifs communs comme les boucles de type GNRA ou UNCG. Nous avons identifié des motifs abondants qui n’ont pas été étudiés auparavant tels que la « tetraloop » UUUU. En analysant le contenu de ces motifs en nucléotides, nous avons remarqué que ces régions simples brins contiennent beaucoup plus de nucléotides A et U. Enfin, nous avons exploré la possibilité d’utiliser ces scores pour la conception d’un filtre qui permettrait d’accélérer la recherche de nouveaux ARN non-codants. Nous avons développé un système de scores, RNAscore, qui permet d’évaluer un ARN en se basant sur son contenu en motifs et nous avons testé son applicabilité avec différents types de contrôles.

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Nous étudions le ribozyme VS de Neurospora, en tant que système modèle, pour augmenter nos connaissances sur la relation entre la structure et la fonction chez les ARNs, ainsi que pour mieux comprendre le mécanisme de clivage de ce ribozyme. Il a été proposé précédemment que la boucle interne A730 dans la tige-boucle VI (SLVI) contient le site actif du ribozyme et lie un ou plusieurs ions métalliques qui pourraient participer au mécanisme réactionnel. Nous avons déterminé par spectroscopie RMN la structure de la tige-boucle SLVI contenant la boucle A730 afin d’éclaircir ce mécanisme. La structure obtenue est en accord avec les études biochimiques antérieures et présente un ou plusieurs sites de liaison au magnésium associé à la boucle interne. Suite à des études de cinétique et de mutagenèse, il a été proposé qu’une adénine localisée dans le site actif, A756, participe à la catalyse par acide/base générale. Des études de pH effectuées précédemment ont identifié un pKa catalytique (5.2-5.8) qui correspond probablement à l’équilibre de protonation du A756. À l’aide de méthodes utilisant le carbone-13, nous avons identifié un pKa modifié appartenant au A756, ce qui supporte le rôle de ce résidu dans la catalyse par acide/base générale. Les études structurales présentées ici aident donc à augmenter notre compréhension du mécanisme de clivage chez le ribozyme VS.

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Les microARNs appartiennent à la famille des petits ARNs non-codants et agissent comme inhibiteurs des ARN messagers et/ou de leurs produits protéiques. Les mi- croARNs sont différents des petits ARNs interférants (siARN) car ils atténuent l’ex- pression au lieu de l’éliminer. Dans les dernières années, de nombreux microARNs et leurs cibles ont été découverts chez les mammifères et les plantes. La bioinforma- tique joue un rôle important dans ce domaine, et des programmes informatiques de découvertes de cibles ont été mis à la disposition de la communauté scientifique. Les microARNs peuvent réguler chacun des centaines de gènes, et les profils d’expression de ces derniers peuvent servir comme classificateurs de certains cancers. La modélisation des microARNs artificiels est donc justifiable, où l’un pourrait cibler des oncogènes surexprimés et promouvoir une prolifération de cellules en santé. Un outil pour créer des microARNs artificiels, nommé MultiTar V1.0, a été créé et est disponible comme application web. L’outil se base sur des propriétés structurelles et biochimiques des microARNs et utilise la recherche tabou, une métaheuristique. Il est démontré que des microARNs conçus in-silico peuvent avoir des effets lorsque testés in-vitro. Les sé- quences 3’UTR des gènes E2F1, E2F2 et E2F3 ont été soumises en entrée au programme MultiTar, et les microARNs prédits ont ensuite été testés avec des essais luciférases, des western blots et des courbes de croissance cellulaire. Au moins un microARN artificiel est capable de réguler les trois gènes par essais luciférases, et chacun des microARNs a pu réguler l’expression de E2F1 et E2F2 dans les western blots. Les courbes de crois- sance démontrent que chacun des microARNs interfère avec la croissance cellulaire. Ces résultats ouvrent de nouvelles portes vers des possibilités thérapeutiques.

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Des variations importantes du surenroulement de l’ADN peuvent être générées durant la phase d’élongation de la transcription selon le modèle du « twin supercoiled domain ». Selon ce modèle, le déplacement du complexe de transcription génère du surenroulement positif à l’avant, et du surenroulement négatif à l’arrière de l’ARN polymérase. Le rôle essentiel de la topoisomérase I chez Escherichia coli est de prévenir l’accumulation de ce surenroulement négatif générée durant la transcription. En absence de topoisomérase I, l’accumulation de ce surenroulement négatif favorise la formation de R-loops qui ont pour conséquence d’inhiber la croissance bactérienne. Les R-loops sont des hybrides ARN-ADN qui se forment entre l’ARN nouvellement synthétisé et le simple brin d’ADN complémentaire. Dans les cellules déficientes en topoisomérase I, des mutations compensatoires s’accumulent dans les gènes qui codent pour la gyrase, réduisant le niveau de surenroulement négatif du chromosome et favorisant la croissance. Une des ces mutations est une gyrase thermosensible qui s’exprime à 37 °C. La RNase HI, une enzyme qui dégrade la partie ARN d’un R-loop, peut aussi restaurer la croissance en absence de topoisomérase I lorsqu’elle est produite en très grande quantité par rapport à sa concentration physiologique. En présence de topoisomérase I, des R-loops peuvent aussi se former lorsque la RNase HI est inactive. Dans ces souches mutantes, les R-loops induisent la réponse SOS et la réplication constitutive de l’ADN (cSDR). Dans notre étude, nous montrons comment les R-loops formés en absence de topoisomérase I ou RNase HI peuvent affecter négativement la croissance des cellules. Lorsque la topoisomérase I est inactivée, l’accumulation d’hypersurenroulement négatif conduit à la formation de nombreux R-loops, ce qui déclenche la dégradation de l’ARN synthétisé. Issus de la dégradation de l’ARNm de pleine longueur, des ARNm incomplets et traductibles s’accumulent et causent l’inhibition de la synthèse protéique et de la croissance. Le processus par lequel l’ARN est dégradé n’est pas encore complètement élucidé, mais nos résultats soutiennent fortement que la RNase HI présente en concentration physiologique est responsable de ce phénotype. Chose importante, la RNase E qui est l’endoribonuclease majeure de la cellule n’est pas impliquée dans ce processus, et la dégradation de l’ARN survient avant son action. Nous montrons aussi qu’une corrélation parfaite existe entre la concentration de RNase HI, l’accumulation d’hypersurenroulement négatif et l’inhibition de la croissance bactérienne. Lorsque la RNase HI est en excès, l’accumulation de surenroulement négatif est inhibée et la croissance n’est pas affectée. L’inverse se produit Lorsque la RNase HI est en concentration physiologique. En limitant l’accumulation d’hypersurenroulement négatif, la surproduction de la RNase HI prévient alors la dégradation de l’ARN et permet la croissance. Quand la RNase HI est inactivée en présence de topoisomérase I, les R-loops réduisent le niveau d’expression de nombreux gènes, incluant des gènes de résistance aux stress comme rpoH et grpE. Cette inhibition de l’expression génique n’est pas accompagnée de la dégradation de l’ARN contrairement à ce qui se produit en absence de topoisomérase I. Dans le mutant déficient en RNase HI, la diminution de l’expression génique réduit la concentration cellulaire de différentes protéines, ce qui altère négativement le taux de croissance et affecte dramatiquement la survie des cellules exposées aux stress de hautes températures et oxydatifs. Une inactivation de RecA, le facteur essentiel qui déclenche la réponse SOS et le cSDR, ne restaure pas l’expression génique. Ceci démontre que la réponse SOS et le cSDR ne sont pas impliqués dans l’inhibition de l’expression génique en absence de RNase HI. La croissance bactérienne qui est inhibée en absence de topoisomérase I, reprend lorsque l’excès de surenroulement négatif est éliminé. En absence de RNase HI et de topoisomérase I, le surenroulement négatif est très relaxé. Il semble que la réponse cellulaire suite à la formation de R-loops, soit la relaxation du surenroulement négatif. Selon le même principe, des mutations compensatoires dans la gyrase apparaissent en absence de topoisomérase I et réduisent l’accumulation de surenroulement négatif. Ceci supporte fortement l’idée que le surenroulement négatif joue un rôle primordial dans la formation de R-loop. La régulation du surenroulement négatif de l’ADN est donc une tâche essentielle pour la cellule. Elle favorise notamment l’expression génique optimale durant la croissance et l’exposition aux stress, en limitant la formation de R-loops. La topoisomérase I et la RNase HI jouent un rôle important et complémentaire dans ce processus.

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Le transport et la traduction localisée des ARN messagers sont observés chez plusieurs organismes et sont requis pour de multiples phénomènes tels la mémoire, la division cellulaire asymétrique et l’établissement des axes durant le développement. Staufen, une protéine liant l’ARN double-brin, a été identifié dans un premier temps chez la mouche à fruits Drosophila melanogaster. Il a été montré, chez cet organisme, que Staufen est requis pour la localisation des messagers bicoid et oskar aux pôles antérieur et postérieur de l’ovocyte, respectivement. Également, Staufen est requis afin que la répression traductionnelle du messager oskar soit levée une fois qu’il est bien localisé. Chez les mammifères, Stau1 est une protéine ubiquiste qui est présente dans des complexes prenant la forme de granules dans les dendrites des neurones. Également, Stau1 peut interagir de façon indépendante de l’ARN avec le ribosome et cofractionner tant avec la sous-unité 40S qu’avec la sous-unité 60S du ribosome dans un gradient de saccharose. L’implication de Stau1 dans un mécanisme permettant la dérépression traductionnelle de certains ARNm chez les mammifères était donc une voie d’investigation intéressante. Nous avons donc décidé de vérifier si Stau1 mammifère avait la capacité de stimuler la traduction d’un ARNm cellulaire via un mécanisme régulé. Au moment où cette thèse a été entreprise, aucun ARNm cellulaire lié par Stau1 n’avait été identifié chez les mammifères. Des structures d’ARN double-brin ont donc été employées afin de réprimer la traduction d’un ARNm rapporteur. C’est ainsi que nous avons montré que Stau1 peut stimuler la traduction d’un ARNm lorsqu’il lie celui-ci dans sa région 5’ non-traduite. Par la suite, en employant des micropuces d’ADN, nous avons identifié des messagers cellulaires dont la distribution dans les polysomes lourds est modifiée par Stau1. En effet, un groupe de messagers est enrichi dans les polysomes lourds suite à une surexpression de Stau1, ce qui suggère que Stau1 stimule la traduction de cette population d’ARNm. Afin d’identifier un mécanisme potentiel de régulation de l’activité traductionnelle de Stau1, nous nous sommes intéressés à la capacité d’auto-association de cette protéine. Nous avons montré que Stau1, tout comme plusieurs protéines liant l’ARN double-brin, est en mesure de s’associer à lui-même, et ce, d’une façon indépendante de l’ARN. Nous avons identifié les déterminants impliqués mettant ainsi au jour un nouveau mécanisme pouvant influencer les activités cellulaires de Stau1. Les résultats présentés dans cette thèse suggèrent donc que Stau1 est en mesure de stimuler la traduction d’une sous-population précise d’ARN messagers au sein de la cellule permettant ainsi de jeter un regard nouveau sur l’implication de cette protéine dans divers phénomènes au sein de l’organisme.

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La transcription, la maturation d’ARN, et le remodelage de la chromatine sont tous des processus centraux dans l'interprétation de l'information contenue dans l’ADN. Bien que beaucoup de complexes de protéines formant la machinerie cellulaire de transcription aient été étudiés, plusieurs restent encore à identifier et caractériser. En utilisant une approche protéomique, notre laboratoire a purifié plusieurs composantes de la machinerie de transcription de l’ARNPII humaine par double chromatographie d’affinité "TAP". Cette procédure permet l'isolement de complexes protéiques comme ils existent vraisemblablement in vivo dans les cellules mammifères, et l'identification de partenaires d'interactions par spectrométrie de masse. Les interactions protéiques qui sont validées bioinformatiquement, sont choisies et utilisées pour cartographier un réseau connectant plusieurs composantes de la machinerie transcriptionnelle. En appliquant cette procédure, notre laboratoire a identifié, pour la première fois, un groupe de protéines, qui interagit physiquement et fonctionnellement avec l’ARNPII humaine. Les propriétés de ces protéines suggèrent un rôle dans l'assemblage de complexes à plusieurs sous-unités, comme les protéines d'échafaudage et chaperonnes. L'objectif de mon projet était de continuer la caractérisation du réseau de complexes protéiques impliquant les facteurs de transcription. Huit nouveaux partenaires de l’ARNPII (PIH1D1, GPN3, WDR92, PFDN2, KIAA0406, PDRG1, CCT4 et CCT5) ont été purifiés par la méthode TAP, et la spectrométrie de masse a permis d’identifier de nouvelles interactions. Au cours des années, l’analyse par notre laboratoire des mécanismes de la transcription a contribué à apporter de nouvelles connaissances et à mieux comprendre son fonctionnement. Cette connaissance est essentielle au développement de médicaments qui cibleront les mécanismes de la transcription.