Méthode pour l’établissement d’une liste de médicaments remboursables dans le cadre du nouveau programme d’assurance-médicaments en Côte d’Ivoire

Contexte général La Côte d'Ivoire est un pays de l’Afrique de l’Ouest qui a décidé, depuis 2001, d'étendre la couverture des prestations de santé à toute sa population. En effet, cette réforme du système de santé avait pour but de fournir, à chaque ivoirien, une couverture médicale et pharmaceutique. Toutefois, la mise en œuvre de cette réforme était difficile car, contrairement aux pays développés, les pays en développement ont un secteur « informel » échappant à la législation du travail et occupant une place importante. En conséquence, il a été recommandé qu’il y ait deux caisses d'assurance santé, une pour le secteur formel (fonctionnaires) et l'autre pour le secteur informel. Ces caisses auraient légitimité en ce qui a trait aux décisions de remboursement de médicaments. D’ores-et-déjà, il existe une mutuelle de santé appelée la Mutuelle Générale des Fonctionnaires et Agents de l'État de Côte d'Ivoire (MUGEFCI), chargée de couvrir les frais médicaux et pharmaceutiques des fonctionnaires et agents de l’Etat. Celle-ci connaît, depuis quelques années, des contraintes budgétaires. De plus, le processus actuel de remboursement des médicaments, dans cette organisation, ne prend pas en considération les valeurs implicites liées aux critères d'inscription au formulaire. Pour toutes ces raisons, la MUGEFCI souhaite se doter d’une nouvelle liste de médicaments remboursables, qui comprendrait des médicaments sécuritaires avec un impact majeur sur la santé (service médical rendu), à un coût raisonnable. Dans le cadre de cette recherche, nous avons développé une méthode de sélection des médicaments pour des fins de remboursement, dans un contexte de pays à faibles revenus. Cette approche a ensuite été appliquée dans le cadre de l’élaboration d’une nouvelle liste de médicaments remboursables pour la MUGEFCI. Méthode La méthode de sélection des médicaments remboursables, développée dans le cadre de cette recherche, est basée sur l'Analyse de Décision Multicritère (ADM). Elle s’articule autour de quatre étapes: (1) l'identification et la pondération des critères pertinents d'inscription des médicaments au formulaire (combinant revue de la littérature et recherche qualitative, suivies par la réalisation d’une expérience de choix discrets); (2) la détermination d'un ensemble de traitements qui sont éligibles à un remboursement prioritaire; (3) l’attribution de scores aux traitements selon leurs performances sur les niveaux de variation de chaque critère, et (4) le classement des traitements par ordre de priorité de remboursement (classement des traitements selon un score global, obtenu après avoir additionné les scores pondérés des traitements). Après avoir défini la liste des médicaments remboursables en priorité, une analyse d’impact budgétaire a été réalisée. Celle-ci a été effectuée afin de déterminer le coût par patient lié à l'utilisation des médicaments figurant sur la liste, selon la perspective de la MUGEFCI. L’horizon temporel était de 1 an et l'analyse portait sur tous les traitements admissibles à un remboursement prioritaire par la MUGEFCI. En ce qui concerne la population cible, elle était composée de personnes assurées par la MUGEFCI et ayant un diagnostic positif de maladie prioritaire en 2008. Les coûts considérés incluaient ceux des consultations médicales, des tests de laboratoire et des médicaments. Le coût par patient, résultant de l'utilisation des médicaments figurant sur la liste, a ensuite été comparé à la part des dépenses par habitant (per capita) allouée à la santé en Côte d’Ivoire. Cette comparaison a été effectuée pour déterminer un seuil en deçà duquel la nouvelle liste des médicaments remboursables en priorité était abordable pour la MUGEFCI. Résultats Selon les résultats de l’expérience de choix discrets, réalisée auprès de professionnels de la santé en Côte d'Ivoire, le rapport coût-efficacité et la sévérité de la maladie sont les critères les plus importants pour le remboursement prioritaire des médicaments. Cela se traduit par une préférence générale pour les antipaludiques, les traitements pour l'asthme et les antibiotiques indiqués pour les infections urinaires. En outre, les résultats de l’analyse d’impact budgétaire suggèrent que le coût par patient lié à l'utilisation des médicaments figurant sur la liste varierait entre 40 et 160 dollars américains. Etant donné que la part des dépenses par habitant allouées à la santé en Côte d’Ivoire est de 66 dollars américains, l’on pourrait conclure que la nouvelle liste de médicaments remboursables serait abordable lorsque l'impact économique réel de l’utilisation des médicaments par patient est en deçà de ces 66 dollars américains. Au delà de ce seuil, la MUGEFCI devra sélectionner les médicaments remboursables en fonction de leur rang ainsi que le coût par patient associé à l’utilisation des médicaments. Plus précisément, cette sélection commencera à partir des traitements dans le haut de la liste de médicaments prioritaires et prendra fin lorsque les 66 dollars américains seront épuisés. Conclusion Cette étude fait la démonstration de ce qu’il est possible d'utiliser l’analyse de décision multicritère pour développer un formulaire pour les pays à faibles revenus, la Côte d’Ivoire en l’occurrence. L'application de cette méthode est un pas en avant vers la transparence dans l'élaboration des politiques de santé dans les pays en développement.

Effets des fluorures sur l'activité antimicrobienne des antibiotiques contre Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa

L’émergence des souches bactériennes résistantes aux antibiotiques est un phénomène inquiétant, qui se répand à travers le monde. Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa sont des bactéries pathogènes opportunistes multi résistantes qui peuvent causer plusieurs maladies. Cependant, ces bactéries deviennent difficiles à traiter avec des antibiotiques sans occasionner de toxicité. Alors pour trouver des solutions, c’est nécessaire de développer de nouvelles molécules afin de combattre les agents pathogènes résistants. Grâce à leur action pharmacologique, les fluorures exercent un certain effet antibactérien au niveau de l'émail des dents; donc, leur association aux antibiotiques pourrait bien a méliorer l’activité antimicrobienne. De ce fait, nous nous sommes proposés d’étudier les activités in vitro de la vancomycine (VAN), l’oxacilline (OXA), la ceftazidime (CFT) et la méropenème (MER) libre ou associée au fluorure de sodium (NaF) et fluorure de lithium (LiF) qui ont été évaluées sur des souches S.aureus et P.aeruginosa sensibles et résistantes, par la méthode de la microdilution en bouillon, déterminant leur concentration minimale inhibitrice (CMI), leur concentration minimale bactéricide (CMB), leur courbe cinétique (Time-Kill). Leur cytotoxicité sur les globules rouges humains, et leur stabilité à la température de 4°C et 22°C ont été étudiées. Les associations des antimicrobiens aux dérivés des fluorures ont montré une amélioration de l’effet des antibiotiques par la réduction des leurs concentrations et toxicité pour traiter correctement ces pathogènes résistants. Par conséquent, des antibiotiques associés aux dérivés de fluorure pourraient devenir une option de traitement contre des souches résistantes afin de diminuer la toxicité causée par de fortes doses des antibiotiques conventionnels.

Conception et synthèse d’aminoglycosides semi-synthétiques

Plusieurs aminoglycosides font partie d’une famille d’antibiotiques à large spectre d’action. Les aminoglycosides ayant une activité antibiotique viennent interférer dans la synthèse protéique effectuée par les bactéries. Les protéines mal codées entraineront la mort cellulaire. Au fil des années, de nombreux cas de résistance ont émergé après une utilisation soutenue des aminoglycosides. De nombreux aminoglycosides semi-synthétiques ont été synthétisés avec comme objectif de restaurer leur activité antimicrobienne. Parmi les modifications ayant connu du succès, notons la didésoxygénation d’un diol et l’introduction de la chaine latérale HABA. Des études précédentes ont montré l’efficacité de ces modifications sur les aminoglycosides. Les présents travaux portent sur l’installation de la chaine latérale HABA et la didésoxygénation d’un diol sur la paromomycine et la néomycine. La didésoxygénation sélective des diols a été effectuée en utilisant la méthodologie développée par Garegg et Samuelsson, une variation de la réaction de Tipson-Cohen. Cette méthode a permis l’obtention du motif didésoxygéné sur les cycles A et D dans des rendements jamais égalés pour ce motif synthétique. La chaîne latérale a été introduite en tirant profit de la réactivité et de la sélectivité d’un carbamate cyclique. Ces méthodes combinées ont permis la synthèse efficace de nombreux analogues semi-synthétiques nouveaux. La 3',4'-didéhydro-N-1-HABA-néomycine et la 3',4',3''',4'''-tétradésoxy-N-1-HABA-néomycine montrent une activité impressionnante contre des souches de bactéries résistantes aux aminoglycosides. Des tests de toxicité effectués en collaboration avec Achaogen Inc. ont démontré que ces composés sont relativement toxiques sur les cellules rénales de type H2K, ce qui réduit de façon importante leur index thérapeutique. Afin d’abaisser la toxicité des composés, la relation entre toxicité et basicité a été explorée. Des substitutions de l’amine en 6''' ont été effectuées afin d’abaisser la basicité de l’amine. Les résultats de toxicité et d’activité antimicrobienne démontrent une corrélation importante entre la basicité des amines et la toxicité/activité des aminoglycosides antibiotiques. L’effet d’une modulation du pKa a aussi été exploré en installant des chaines fluorées sur l’amine en 6''' de la paromomycine et de la néomycine. Une séquence synthtétique pour isoler l’amine en 6''' de la néomycine a aussi été développée.

Caractérisation de la résistance à la bacitracine et évaluation in vitro de bactériophages envers les Clostridium perfringens aviaires

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Évaluation du lavage articulaire avec des salines hypertoniques dans le traitement de l’arthrite septique chez le veau

L’arthrite septique chez les bovins est une affection le plus souvent d’origine bactérienne qui est une cause de boiterie fréquente associée à des pertes économiques importantes. Le traitement, qui doit être initié le plus rapidement possible, s’appuie sur l’utilisation combinée d’anti-inflammatoires non stéroïdiens, d’un ou de plusieurs lavages articulaires ainsi que d’antibiotiques administrés de façon systémique pour un minimum de 3 semaines. Cette durée d’administration constitue une difficulté pour les élevages dits biologiques pour lesquels un cahier des charges strict limite un recours prolongé aux antibiotiques. Ainsi le traitement efficace de diverses conditions infectieuses et celui de l’arthrite septique en particulier dans ces élevages peut être compromis. L’objectif de ce travail est de s’appuyer sur les propriétés antimicrobiennes des solutions de saline hypertonique (SSH) pour limiter l’utilisation des antibiotiques dans les cas d’arthrite septique chez les veaux en intégrant ces solutions pour le lavage des articulations infectées. Notre première étude a consisté à déterminer la sécurité d’emploi de deux concentrations de SSH (une commerciale à 7.2% et une maison à 15%) dans des articulations supposées saines chez le veau. Une synovite sévère associée à des signes cliniques caractéristiques d’atteintes articulaires a été observé lors de l’utilisation de SSH 15%. Son utilisation clinique comme solution de lavage articulaire est par conséquent déconseillée. Concernant la SSH 7.2%, malgré une synovite d’intensité variable, nous n’avons pas noté des signes cliniques caractéristiques d’atteintes articulaires. Son utilisation dans un contexte expérimental d’infection articulaire nous a paru réaliste. Notre seconde étude a permis d’évaluer les effets du lavage articulaire avec de la SSH 7.2% dans un modèle expérimental d’infection à Escherichia coli. Trois groupes de traitement ont été constitués. Dans le premier groupe (traitement standard), un lavage était effectué avec du lactate de Ringer (LRS) et les veaux recevaient une administration biquotidienne de ceftiofur par voie intraveineuse pour 21 jours. Dans le deuxième groupe (LRS), un lavage était effectué avec du LRS et aucun antibiotique n’était administré. Enfin dans le troisième groupe (SSH), un lavage était effectué avec de la SSH 7.2% sans qu’aucun antibiotique ne soit administré. Tous les veaux ont reçu du kétoprofen quotidiennement pendant 3 jours. L’inoculation s’est fait au jour 1 et les traitements ont débuté au jour 2. L’efficacité des traitements a été établie sur des critères cliniques, bactériologiques et cytologiques. Dans le modèle que nous avons utilisé, les trois groupes de traitements ont conduits à une guérison clinique et bactériologique satisfaisante (absence de boiterie, de douleur et de croissance bactérienne dans le liquide articulaire en fin d’étude). La guérison cytologique n’a quant à elle pas été jugée satisfaisante avec des moyennes de comptage et de pourcentage en neutrophiles tout groupe confondu bien supérieures aux valeurs normales (11.39x109/l de neutrophiles représentant 74.73% des leucocytes en fin d’étude). Le traitement avec la SSH 7.2% s’est révélé être significativement plus traumatique et pas plus efficace dans l’élimination de l’infection comparativement au traitement LRS. D’autre part, le lavage articulaire au LRS s’est révélé être aussi efficace et sécuritaire que le traitement standard de l’arthrite septique qui incluait 21 jours de ceftiofur administré par voie intraveineuse. Ainsi, bien que le lavage avec de la SSH 7.2% n’est pas démontré de résultats satisfaisants qui permettrait de limiter le recours aux antibiotiques dans les filières biologiques, l’association d’un lavage au LRS avec le ketoprofen s’est révélée être une alternative possible. De nouvelles études sont requises pour confirmer ses résultats et pour déterminer le rôle respectif du lavage articulaire et du ketoprofen dans la guérison lors d’arthrite septique.

Étude de la résistance aux antibiotiques des entérocoques d'origine animale du Québec

Les entérocoques font partie de la flore normale intestinale des animaux et des humains. Plusieurs études ont démontré que les entérocoques d’origine animale pouvaient représenter un réservoir de gènes de résistance aux antibiotiques pour la communauté humaine et animale. Les espèces Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium sont importantes en santé publique; elles sont responsables d’environ 12% de toutes les infections nosocomiales aux États-Unis. Au Canada, les cas de colonisation et/ou d’infections à entérocoques résistants à la vancomycine ont plus que triplé de 2005 à 2009. Un total de 387 isolats E. faecalis et E. faecium aviaires, et 124 isolats E. faecalis porcins ont été identifiés et analysés pour leur susceptibilité aux antibiotiques. De hauts pourcentages de résistance envers les macrolides et les tétracyclines ont été observés tant chez les isolats aviaires que porcins. Deux profils phénotypiques prédominants ont été déterminés et analysés par PCR et séquençage pour la présence de gènes de résistance aux antibiotiques. Différentes combinaisons de gènes de résistance ont été identifiées dont erm(B) et tet(M) étant les plus prévalents. Des extractions plasmidiques et des analyses par hybridation ont permis de déterminer, pour la première fois, la colocalisation des gènes erm(B) et tet(M) sur un plasmide d’environ 9 kb chez des isolats E. faecalis porcins, et des gènes erm(B) et tet(O) sur un plasmide de faible poids moléculaire d’environ 11 kb chez des isolats E. faecalis aviaires. De plus, nous avons démontré, grâce à des essais conjugatifs, que ces plasmides pouvaient être transférés. Les résultats ont révélé que les entérocoques intestinaux aviaires et porcins, lesquels peuvent contaminer la viande à l’abattoir, pouvaient représenter un réservoir de gènes de résistance envers la quinupristine-dalfopristine, la bacitracine, la tétracycline et les macrolides. Afin d’évaluer l’utilisation d’un antisérum polyclonal SA dans l’interférence de la résistance à de fortes concentrations de bacitracine (gènes bcrRAB), lors d’un transfert conjugatif répondant aux phéromones, un isolat multirésistant E. faecalis aviaire a été sélectionné. Après induction avec des phéromones produites par la souche réceptrice E. faecalis JH2-2, l’agrégation de la souche donatrice E. faecalis 543 a été observée ainsi que des fréquences de transfert élevées en bouillon lors d’une courte période de conjugaison. Le transfert conjugatif des gènes asa1, traB et bcrRAB ainsi que leur colocalisation a été démontré chez le donneur et un transconjugant T543-1 sur un plasmide de 115 kb par électrophorèse à champs pulsé (PFGE) et hybridation. Une CMI de > 2 048 µg/ml envers la bacitracine a été obtenue tant chez le donneur que le transconjuguant tandis que la souche réceptrice JH2-2 démontrait une CMI de 32 µg/ml. Le séquençage des gènes asa1, codant pour la substance agrégative, et traB, une protéine régulant négativement la réponse aux phéromones, a révélé une association de cet élément génétique avec le plasmide pJM01. De plus, cette étude présente qu’un antisérum polyclonal SA peut interférer significativement dans le transfert horizontal d’un plasmide répondant aux phéromones codant pour de la résistance à de fortes doses de bacitracine d’une souche E. faecalis aviaire multirésistante. Des isolats cliniques E. faecium d’origine humaine et canine ont été analysés et comparés. Cette étude rapporte, pour la première fois, la caractérisation d’isolats cliniques E. faecium résistants à l’ampicilline (EFRA) d’origine canine associés à CC17 (ST17) au Canada. Ces isolats étaient résistants à la ciprofloxacine et à la lincomycine. Leur résistance envers la ciprofloxacine a été confirmée par la présence de substitutions dans la séquence en acides aminés des gènes de l’ADN gyrase (gyrA/gyrB) et de la topoisomérase IV (parC/parE). Des résistances élevées envers la gentamicine, la kanamycine et la streptomycine, et de la résistance envers les macrolides et les lincosamides a également été observées. La fréquence de résistance envers la tétracycline était élevée tandis que celle envers la vancomycine n’a pas été détectée. De plus, aucune résistance n’a été observée envers le linézolide et la quinupristine-dalfopristine. Les données ont démontré une absence complète des gènes esp (protéine de surface des entérocoques) et hyl (hyaluronidase) chez les isolats canins EFRA testés tandis qu’ils possédaient tous le gène acm (adhésine de liaison au collagène d’E. faecium). Aucune activité reliée à la formation de biofilm ou la présence d’éléments CRISPR (loci de courtes répétitions palindromiques à interespaces réguliers) n’a été identifiée chez les isolats canins EFRA. Les familles de plasmide rep6 and rep11 ont significativement été associées aux isolats d’origine canine. Les profils PFGE des isolats d’origine humaine et canine n'ont révélé aucune relation (≤ 80%). Ces résultats illustrent l'importance d'une utilisation judicieuse des antibiotiques en médecine vétérinaire afin d’éviter la dissémination zoonotique des isolats EFRA canins. Nous pensons que ces résultats contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes de résistance aux antibiotiques et de leurs éléments mobiles ainsi qu’à de nouvelles stratégies afin de réduire le transfert horizontal de la résistance aux antibiotiques et des facteurs de virulence.

Quantifying diffusion in biofilms : from model hydrogels to living biofilms

Les biofilms sont des communautés de microorganismes incorporés dans une matrice exo-polymérique complexe. Ils sont reconnus pour jouer un rôle important comme barrière de diffusion dans les systèmes environnementaux et la santé humaine, donnant lieu à une résistance accrue aux antibiotiques et aux désinfectants. Comme le transfert de masse dans un biofilm est principalement dû à la diffusion moléculaire, il est primordial de comprendre les principaux paramètres influençant les flux de diffusion. Dans ce travail, nous avons étudié un biofilm de Pseudomonas fluorescens et deux hydrogels modèles (agarose et alginate) pour lesquels l’autodiffusion (mouvement Brownien) et les coefficients de diffusion mutuels ont été quantifiés. La spectroscopie par corrélation de fluorescence a été utilisée pour mesurer les coefficients d'autodiffusion dans une volume confocal de ca. 1 m3 dans les gels ou les biofilms, tandis que les mesures de diffusion mutuelle ont été faites par cellule de diffusion. En outre, la voltamétrie sur microélectrode a été utilisée pour évaluer le potentiel de Donnan des gels afin de déterminer son impact sur la diffusion. Pour l'hydrogel d'agarose, les observations combinées d'une diminution du coefficient d’autodiffusion et de l’augmentation de la diffusion mutuelle pour une force ionique décroissante ont été attribuées au potentiel de Donnan du gel. Des mesures de l'effet Donnan (différence de -30 mV entre des forces ioniques de 10-4 et 10-1 M) et l'accumulation correspondante d’ions dans l'hydrogel (augmentation d’un facteur de 13 par rapport à la solution) ont indiqué que les interactions électrostatiques peuvent fortement influencer le flux de diffusion de cations, même dans un hydrogel faiblement chargé tel que l'agarose. Curieusement, pour un gel plus chargé comme l'alginate de calcium, la variation de la force ionique et du pH n'a donné lieu qu'à de légères variations de la diffusion de sondes chargées dans l'hydrogel. Ces résultats suggèrent qu’en influençant la diffusion du soluté, l'effet direct des cations sur la structure du gel (compression et/ou gonflement induits) était beaucoup plus efficace que l'effet Donnan. De même, pour un biofilm bactérien, les coefficients d'autodiffusion étaient pratiquement constants sur toute une gamme de force ionique (10-4-10-1 M), aussi bien pour des petits solutés chargés négativement ou positivement (le rapport du coefficient d’autodiffusion dans biofilm sur celui dans la solution, Db/Dw ≈ 85 %) que pour des nanoparticules (Db/Dw≈ 50 %), suggérant que l'effet d'obstruction des biofilms l’emporte sur l'effet de charge. Les résultats de cette étude ont montré que parmi les divers facteurs majeurs qui affectent la diffusion dans un biofilm environnemental oligotrophe (exclusion stérique, interactions électrostatiques et hydrophobes), les effets d'obstruction semblent être les plus importants lorsque l'on tente de comprendre la diffusion du soluté. Alors que les effets de charge ne semblaient pas être importants pour l'autodiffusion de substrats chargés dans l'hydrogel d'alginate ou dans le biofilm bactérien, ils ont joué un rôle clé dans la compréhension de la diffusion à travers l’agarose. L’ensemble de ces résultats devraient être très utiles pour l'évaluation de la biodisponibilité des contaminants traces et des nanoparticules dans l'environnement.

Identification et caractérisation de gènes chez Salmonella enterica sérovar Typhi impliqués dans l’interaction avec les macrophages humains.

Le genre bactérien Salmonella regroupe plus de 2500 sérovars, mais peu sont responsables de pathologies humaines. Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) est reconnu pour son importance médicale à travers le globe. S. Typhi cause la fièvre typhoïde chez l’Homme, une maladie infectieuse létale caractérisée par la dissémination systémique de la bactérie vers des organes du système réticulo-endothélial. La fièvre typhoïde représente un fardeau pour la santé mondiale, notamment auprès des pays en développement où les conditions sanitaires sont désuètes. La situation se complique davantage par l’apparition de souches résistantes aux antibiotiques. De plus, les deux vaccins licenciés sont d’efficacité modérée, présentent certaines contraintes techniques et ne sont pas appropriés pour les jeunes enfants et nourrissons. La phase systémique de l’infection par Salmonella repose sur sa survie dans les macrophages du système immunitaire. Dans ce compartiment intracellulaire, la bactérie module les défenses antimicrobiennes grâce à de multiples facteurs de virulence encodés dans son génome. Les mécanismes moléculaires sollicités sont complexes et finement régulés. Malgré les progrès scientifiques réalisés précédemment, plusieurs incompréhensions persistent au sujet de l’adaptation de ce pathogène dans les macrophages de l’hôte. Pour mieux concevoir les déterminants génétiques de S. Typhi impliqués dans l’interaction avec ces cellules, une stratégie de sélection négative a été appliquée afin de vérifier systématiquement l’effet direct des gènes pendant l’infection. En premier temps, une librairie de mutants par transposon chez S. Typhi a été créée pour l’infection de macrophages humains en culture. Après 24 heures d’infection, la présence des mutants fut évaluée simultanément par analyse sur des biopuces de Salmonella. Au total, 130 gènes ont été sélectionnés pour leur contribution potentielle auprès des macrophages infectés. Ces gènes comptaient des composantes d’enveloppe bactérienne, des éléments fimbriaires, des portions du flagelle, des régulateurs, des facteurs de pathogenèse et plusieurs protéines sans fonction connue. En deuxième temps, cette collection de gènes a dirigé la création de 28 mutants de délétion définie chez S. Typhi. Les capacités d’entrée et de réplication intracellulaire de ces mutants au sein des macrophages humains ont été caractérisées. D’abord, les macrophages ont été co-infectés avec les mutants en présence de la souche sauvage, pour vérifier la compétitivité de chacun d’eux envers cette dernière. Ensuite, les mutants ont été inoculés individuellement chez les macrophages et leur infectivité fut mesurée comparativement à celle de la souche sauvage. Sommairement, 26 mutants ont présenté des défauts lorsqu’en compétition, tandis que 14 mutants se sont montrés défectueux lorsque testés seuls. Par ailleurs, 12 mutants ont exposé une déficience lors de l’infection mixte et individuelle, incluant les mutants acrA, exbDB, flhCD, fliC, gppA, mlc, pgtE, typA, waaQGP, STY1867-68, STY2346 et SPI-4. Notamment, 35 nouveaux phénotypes défectueux d’entrée ou de survie intracellulaire chez Salmonella ont été révélés par cette étude. Les données générées ici offrent plusieurs nouvelles pistes pour élucider comment S. Typhi manipule sa niche intracellulaire, menant à l’infection systémique. Les gènes décrits représentent des cibles potentielles pour atténuer la bactérie chez l’humain et pourraient contribuer au développement de meilleures souches vaccinales pour immuniser contre la fièvre typhoïde.

Nanovecteurs pour cibler pseudomonas aeruginosa dans la fibrose kystique.

La production excessive de mucus visqueaux dans les poumons des patients atteints de la fibrose kystique (FK) gêne la diffusion des médicaments et entraîne des infections bactériennes. En effet, l’infection pulmonaire par Pseudomonas aeruginosa (PA) est la principale cause de mortalité. Les travaux effectués dans cette thèse avaient pour but de développer des nouvelles formulations de nanoparticules (NP) et de liposomes (LP) chargées avec des antibiotiques pour erradiquer le PA chez les patients atteints de KF. Tout d’abord, les polymères PEG-g-PLA et PLA-OH ont été synthétisés et caractérisés. Ensuite, l'efficacité d'encapsulation (EE) de la tobramycine, du sulfate de colistine et de la lévofloxacine (lévo) a été testée dans des NP de PEG-g-PLA et / ou PLA-OH. Les premiers essais d'optimisation ont montré que les NP chargées avec la lévo présentaient une augmentation de l’EE. La lévo reste alors le médicament de choix. Cependant, la meilleure charge de médicament obtenue était de 0,02% m/m. Pour cette raison, nous avons décidé d'évaluer l'encapsulation de la lévo dans les LP. En fait, des LP chargés de lévo ont présenté une EE d’environ 8% m/m. De plus, la taille et la charge de ces LP étaient appropriées pour la pénétration du vecteur dans le mucus. Le test de biofilm n'est pas reproductible, mais le test standard a montré que la souche mucoïde de PA était susceptible à la lévo. Ainsi, nous avons comparé les activités des LP fraîchement préparées (vides et chargés ) et de la lévo libre sous la forme planctonique de PA. Les résultats ont montré que des LP vides ne gênent pas la croissance bactérienne. Pour la souche mucoïde (Susceptible à la lévo) les LP chargés et le médicament libre ont présenté la même concentration minimale inhibitrice (CMI). Toutefois, les souches non mucoïdes (résistant à la lévo) ont présenté une CMI deux fois plus faible que celle pour le médicament libre. Finalement, les LP se sont avérés plus appropriés pour encapsuler des médicaments hydrophiles que les NP de PEG-g-PLA. En outre, les LP semblent améliorer le traitement contre la souche résistante de PA. Toutefois, des études complémentaires doivent être effectuées afin d'assurer la capacité des liposomes èa traiter la fibrose kystique.

Étude sur le biofilm et les mécanismes de résistance à la bacitracine chez Clostridium perfringens

Clostridium perfringens est ubiquitaire dans l’environnement. Ce microorganisme peut être retrouvé dans la flore normale du tractus gastro-intestinal des mammifères et peut également causer une variété d’infections intestinales. Le phénotype de résistance à la bacitracine a déjà été rapporté chez C. perfringens mais les gènes associés n’ont pas été caractérisés. Dans cette étude, 24 des 99 isolats de C. perfringens aviaires testés ont démontré une résistance à la bacitracine. Les analyses ont révélé la présence d’un transporteur ABC ainsi que d’une undécaprénol kinase surproduite. Ces deux mécanismes semblent être codés par l’opéron bcrABDR. En amont et en aval des gènes bcr, un élément IS1216-like a été identifié, celui-ci pouvant jouer un rôle dans la dissémination de la résistance à la bacitracine. Des analyses d’hybridation sur ADN ont révélé que les gènes bcrABDR étaient localisés sur le chromosome. De plus, il a été démontré que les gènes bcr étaient exprimés en présence de bacitracine. Plusieurs études ont associé la tolérance aux antibiotiques et aux désinfectants à la formation de biofilm. Dans la littérature, peu d’informations sont disponibles sur le biofilm de C. perfringens. La majorité des isolats testés dans cette étude ont démontré la formation d’un biofilm. L’analyse de la matrice a démontré que celle-ci contenait des protéines, de l’ADN extracellulaire ainsi que des polysaccharides liés en bêta-1,4. Une meilleure survie des cellules en biofilm a été observée suite à une exposition à de fortes concentrations d’antibiotiques. Une exposition à de faibles doses de certains antibiotiques semblait diminuer le biofilm formé alors que pour d’autres, le biofilm semblait augmenter. Dans la présente étude, la susceptibilité des biofilms de C. perfringens à la désinfection a été également analysée. Les résultats ont démontré que la formation de biofilm protégeait les cellules de l’action du monopersulfate de potassium, des ammoniums quaternaires, du peroxyde d’hydrogène et du glutéraldéhyde. Toutefois, l’hypochlorite de sodium a été démontré comme étant efficace contre le biofilm de C. perfringens. Il a été démontré que les biofilms mixtes de C. perfringens cultivés en présence de Staphylococcus aureus ou d’Escherichia coli étaient plus résistants à la désinfection en comparaison aux biofilms simples de S. aureus ou d’E. coli. Toutefois, le biofilm simple de C. perfringens était plus résistant à la désinfection que les biofilms mixtes. Finalement, les profils de transcription entre les populations planctoniques et en biofilm ont été analysés par séquençage d’ARN. L’analyse transcriptomique du biofilm a identifié 238 gènes différentiellement exprimés entre les deux conditions. Les gènes négativement régulés sont impliqués dans la virulence, la production d’énergie, le métabolisme des sucres ainsi que dans la biosynthèse des acides gras et des acides aminés alors que les gènes induits sont impliqués dans la réponse au stress et au stress oxydatif, dans la biosynthèse d’acides gras et de phospholipides ainsi que dans la virulence. Cette étude décrit pour la première fois la découverte des gènes associés à la résistance à la bacitracine chez C. perfringens. Elle rapporte également de nouvelles données sur la matrice du biofilm, la tolérance aux antibiotiques et aux désinfectants ainsi que sur le transcriptome du biofilm de C. perfringens.

Étude de l'impact de deux traitements, dont un sans antibiotiques, sur la santé digestive et les populations de Clostridium perfringens dans des élevages de poulets de chair.

Le problème grandissant de l’antibiorésistance remet en question plusieurs pratiques reliées à l’utilisation des antibiotiques, dont l’usage à grande échelle pour des fins de promotion de la croissance chez les animaux de consommation. Depuis 2006, le retrait des antibiotiques dans les élevages de poulets de chair en Europe a été associé à la résurgence d’entérite nécrotique, une maladie intestinale causée par la bactérie Clostridium perfringens. Alors que la pathogénie de la maladie semblait bien comprise, le retrait des antibiotiques a montré que peu de solutions de remplacement sont disponibles afin de prévenir cette maladie. Très peu d’études se sont intéressées à mieux caractériser la dynamique des populations de C. perfringens dans les élevages avicoles et l’effet que pouvait avoir le retrait des antibiotiques sur l’évolution de ces populations. La présente étude a évalué l’impact du remplacement des antibiotiques promoteurs de croissance et des anticoccidiens pendant une période de 14 mois, dans huit élevages commerciaux de poulets de chair au Québec. Un protocole d’élevage alternatif, combinant des stratégies telles que des produits à base d’huiles essentielles, des acides organiques et inorganique, une vaccination contre la coccidiose ainsi qu’une amélioration des conditions de démarrage des poussins, a été utilisé en remplacement des antimicrobiens. Les performances zootechniques, la santé digestive ainsi que l’occurrence d’entérite nécrotique pour les lots de poulets soumis au protocole d’élevage alternatif ont été comparées avec celles de lots de poulets de chair recevant une ration conventionnelle. Des analyses moléculaires basées sur la PCR et le PFGE ont été utilisées afin de documenter l’impact de la mise en place du protocole d’élevage alternatif sur les populations de C. perfringens. Les résultats obtenus montrent qu’aucune différence entre les groupes soumis aux deux types de protocoles n'est observée en ce qui a trait à la viabilité en élevage, à l'âge d'abattage et aux taux de condamnations à l'abattoir. Toutefois, les lots soumis au traitement alternatif ont eu des performances moindres pour le poids moyen à l'abattage, le gain moyen quotidien et la conversion alimentaire. Un peu plus de 27% des lots soumis au protocole alternatif ont connu un épisode d’entérite nécrotique clinique. Les analyses ont aussi montré que l’un ou l’autre des protocoles ne semble pas exercer d’influence particulière sur la dynamique temporelle des populations de C. perfringens. Pour les lots soumis au protocole d’élevage alternatif, une forte diversité génétique pour C. perfringens a été liée à un risque augmenté de vivre un épisode d’entérite nécrotique. À l’opposé, les lots alternatifs ayant vécu des épisodes récurrents de la maladie ont montré une diminution significative de la diversité génétique, ainsi qu’une augmentation marquée du nombre de souches de C. perfringens transportant plusieurs gènes de virulence. La présente étude a permis de mieux documenter, d’un point de vue économique et scientifique, la production de poulets de chair élevés sans antibiotiques ni anticoccidiens au Québec. Cette étude est la seule du genre s’étant intéressée à la caractérisation et à la comparaison dans le temps des flores de C. perfringens retrouvées dans les deux types d’élevages. Elle a révélé que la production à grande échelle de poulets de chair élevés sans antibiotiques ni anticoccidiens est possible au Québec, mais que celle-ci présente des impacts sur les performances zootechniques des oiseaux, sur leur santé digestive et sur la dynamique des populations de C. perfringens. Mots-clés : poulets de chair, antibiotiques, huiles essentielles, acides organiques, vaccination coccidiose, performances zootechniques, santé digestive, entérite nécrotique, Clostridium perfringens, dynamique populationnelle

Étude d'un nouveau facteur impliqué dans la biosynthèse de la paroi bactérienne : le facteur ElyC

La résistance bactérienne aux antibiotiques est de nos jours une préoccupation majeure aux acteurs du monde de la santé publique. L’identification de nouvelles cibles bactériennes en vue de développer de nouveaux antibiotiques est donc nécessaire. La paroi bactérienne est une bonne cible car l’inhibition de sa biosynthèse cause la mort des bactéries. De récents travaux de notre laboratoire ont identifié de nombreux nouveaux facteurs importants pour la biosynthèse de la paroi chez Escherichia coli. L’un de ces facteurs renommé ElyC a un domaine DUF218 extrêmement conservé à travers les espèces bactériennes. L’absence du gène elyC entraîne la lyse bactérienne à température pièce. Des études bioinformatiques indiquent qu’ElyC est une protéine membranaire avec deux domaines transmembranaires et un domaine conservé DUF218 de fonction inconnue. Étant donné que les protéines agissent souvent en complexes, nous avons émis l’hypothèse qu’ElyC interagit avec d’autres protéines afin d'exécuter sa fonction biologique. Le but de mon projet est de déterminer la topologie d’ElyC et d’identifier ses partenaires protéiques. L’étude de la topologie a été faite par l’essai de modification de cystéine sur des souches exprimant individuellement le facteur ElyC avec un résidu cystéine en position N-terminale, dans la boucle ou en position C-terminale. Les partenaires protéiques d’ElyC ont été isolés par immuno-précipitation et identifiés par spectrométrie de masse. Les résultats obtenus ont révélé qu’ElyC est une protéine membranaire chez E. coli et est impliquée dans l'assemblage de l'enveloppe bactérienne, dans la chaîne de transport d'électrons et la phosphorylation oxydative. Ils ont permis aussi de confirmer l’existence d’un lien entre ElyC et le stress oxydatif. Cependant les résultats pour la détermination de la topologie restent à être clarifiés.

Prevalence et caracterisation de Staphylococcus aureus resistant a la methicilline d'origine aviaire au Quebec

Le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) est un enjeu majeur en santé publique. Il est responsable d’une grande variété d’infections. Les “Livestock Associated-MRSA” (LA-MRSA) sont des SARM ayant comme origine les animaux de production tels le porc ou la volaille. Ils constituent un risque de transmission à l’humain via la chaîne alimentaire. Les LA-MRSA peuvent former du biofilm ce qui augmente leur tolérance aux stress environnementaux. Le biofilm est partiellement régulé par le système Agr. Il n’existe aucune donnée sur les ‘LA-MRSA’ d’origine aviaire au Québec. Les objectifs de ce projet étaient : (i) de déterminer la prévalence de ces SARM dans la viande de poulet et le poulet à griller de la province de Québec et (ii) de caractériser les isolats retrouvés. La collecte d’échantillons s’est effectuée dans 43 épiceries (309 cuisses et pilons de poulet) et dans deux abattoirs (échantillons nasaux et fécaux de 200 poulets) de la Montérégie. La prévalence de SARM a été évaluée à 1.29% (IC 95%: 0.35-3.28) et 0% dans la viande et les oiseaux respectivement. Les isolats testés se sont révélés résistants aux bêta-lactamines (n=15), à la tétracycline (n=10), à l’oxytétracycline (n=10), à la spectinomycine (n=10) et à la tobramycine (n=1). Le typage a révélé deux clones différents (ST398-V, n=10; et ST8-IVa ’USA300’, n=5). La présence de gènes de résistance aux antibiotiques (blaZ, blaR, blaI, erm(A), lnu(A), aad(D), fosB, tet(K), tet(L) et spc) ainsi que plusieurs gènes codant pour l’évasion du système immunitaire (IEC), la production de toxines ou encore pour la production de biofilm ont aussi été détectés. Une forte production de biofilm a été observée pour la majorité des isolats (n=11) à l’exception de certains isolats ST398. Le taux d’expression du système Agr n’a révélé aucune différence particulière entre les SARM testés. Pour conclure, nos données indiquent une faible prévalence de SARM chez la volaille et la viande de poulet. Les isolats ont été catégorisés en deux génotypes, dont un portant plus de gènes de résistance aux antibiotiques (ST398) et l’autre possédant plus de gènes de virulence (ST8).

Glycosidation avec protection minimale en solution et sur support solide

Les glycosides sont reconnus pour leur potentiel pharmaceutique tels que les antibiotiques, les agents anticancéreux et antiviraux. Ils sont impliqués dans plusieurs processus biologiques entre autres la reconnaissance cellulaire, l’inflammation, la réponse immunitaire, la croissance, le transport cellulaire, l’adhésion cellulaire et les groupes sanguin. Notre groupe excelle dans la glycosidation stéréocontrôlée avec un minimum de protection suivant le concept d’activation à distance d’aglycones hétérocycliques anomériques. La présence d’une quantité sous stoechiométrique d’acide de Lewis, les (2-pyridyl)-β-D-glycosides déprotégés sont d’excellents donneurs permettant de haute sélectivité pour l’anomère- α-D de glycosides simples et complexes. Inversement, (2-pyridyl)-α-D-glycosides donnent les β-D-glycosides avec de bonne sélectivité. Des exemples de formation stéréocontrôlée de glycosides sont présentés dans cette thèse avec des accepteurs tels que les phénols, les stéroïdes, les terpènes et les acides hydroxyaminés. Cette méthodologie de glycosidation a été appliquée sur support solide.

Analyse par spectrométrie de masse des antibiotiques vétérinaires liés à l’élevage porcin

L’élevage des porcs représente une source importante de déversement d’antibiotiques dans l’environnement par l’intermédiaire de l’épandage du lisier qui contient une grande quantité de ces molécules sur les champs agricoles. Il a été prouvé que ces molécules biologiquement actives peuvent avoir un impact toxique sur l’écosystème. Par ailleurs, elles sont aussi suspectées d’engendrer des problèmes sanitaires et de contribuer à la résistance bactérienne pouvant mener à des infections difficilement traitables chez les humains. Le contrôle de ces substances dans l’environnement est donc nécessaire. De nombreuses méthodes analytiques sont proposées dans la littérature scientifique pour recenser ces composés dans plusieurs types de matrice. Cependant, peu de ces méthodes permettent l’analyse de ces contaminants dans des matrices issues de l’élevage agricole intensif. Par ailleurs, les méthodes analytiques disponibles sont souvent sujettes à des faux positifs compte tenu de la complexité des matrices étudiées et du matériel utilisé et ne prennent souvent pas en compte les métabolites et produits de dégradation. Enfin, les niveaux d’analyse atteints avec ces méthodes ne sont parfois plus à jour étant donné l’évolution de la chimie analytique et de la spectrométrie de masse. Dans cette optique, de nouvelles méthodes d’analyses ont été développées pour rechercher et quantifier les antibiotiques dans des matrices dérivées de l’élevage intensif des porcs en essayant de proposer des approches alternatives sensibles, sélectives et robustes pour quantifier ces molécules. Une première méthode d’analyse basée sur une technique d’introduction d’échantillon alternative à l’aide d’une interface fonctionnant à l’aide d’une désorption thermique par diode laser munie d’une source à ionisation à pression atmosphérique, couplée à la spectrométrie de masse en tandem a été développée. L’objectif est de proposer une analyse plus rapide tout en atteignant des niveaux de concentration adaptés à la matrice étudiée. Cette technique d’analyse couplée à un traitement d’échantillon efficace a permis l’analyse de plusieurs antibiotiques vétérinaires de différentes classes dans des échantillons de lisier avec des temps d’analyse courts. Les limites de détection atteintes sont comprises entre 2,5 et 8,3 µg kg-1 et sont comparables avec celles pouvant être obtenues avec la chromatographie liquide dans une matrice similaire. En vue d’analyser simultanément une série de tétracyclines, une deuxième méthode d’analyse utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) a été proposée. L’utilisation de la HRMS a été motivée par le fait que cette technique d’analyse est moins sensible aux faux positifs que le triple quadripôle traditionnel. Des limites de détection comprises entre 1,5 et 3,6 µg kg-1 ont été atteintes dans des échantillons de lisier en utilisant un mode d’analyse par fragmentation. L’utilisation de méthodes de quantifications ciblées est une démarche intéressante lorsque la présence de contaminants est suspectée dans un échantillon. Toutefois, les contaminants non intégrés à cette méthode d’analyse ciblée ne peuvent être détectés même à de fortes concentrations. Dans ce contexte, une méthode d’analyse non ciblée a été développée pour la recherche de pharmaceutiques vétérinaires dans des effluents agricoles en utilisant la spectrométrie de masse à haute résolution et une cartouche SPE polymérique polyvalente. Cette méthode a permis l’identification d’antibiotiques et de pharmaceutiques couramment utilisés dans l’élevage porcin. La plupart des méthodes d’analyse disponibles dans la littérature se concentrent sur l’analyse des composés parents, mais pas sur les sous-produits de dégradation. L’approche utilisée dans la deuxième méthode d’analyse a donc été étendue et appliquée à d’autres classes d’antibiotiques pour mesurer les concentrations de plusieurs résidus d’antibiotiques dans les sols et les eaux de drainage d’un champ agricole expérimental. Les sols du champ renfermaient un mélange d’antibiotiques ainsi que leurs produits de dégradation relatifs à des concentrations mesurées jusqu’à 1020 µg kg-1. Une partie de ces composés ont voyagé par l’intermédiaire des eaux de drainage du champ ou des concentrations pouvant atteindre 3200 ng L-1 ont pu être relevées.