Étude préclinique de nouveaux médicaments inhibiteurs de PARP et Bcl-2 dans le neuroblastome

Le neuroblastome (NB) est la tumeur solide extracranienne la plus fréquente chez le jeune enfant. En dépit de plusieurs avancements thérapeutiques, seulement 60% survivront à long terme. Cette résistance aux traitements est possiblement due, en partie, à la présence des cellules souches cancéreuses (CSC). PARP-1 joue un rôle important dans la chimiorésistance de certaines tumeurs et son inhibition a montré une potentialisation des agents anticancéreux conventionnels. De plus, Bcl-2 est surexprimé dans le NB et son expression accrue contribuerait à la résistance à la chimiothérapie. Le but de notre travail était de déterminer les effets in vitro d’un PARP inhibiteur, AG-014699 (AG), et d’un inhibiteur de Bcl-2, Obatoclax (Obx), in vitro et in vivo, en monothérapie ou en combinaison avec de la Doxorubicine (Doxo) ou du Cisplatin (Cis), deux agents anticancéreux classiquement utilisés dans le traitement du NB. Afin de déterminer l’expression de PARP-1 dans les tumeurs de NB, nous avons analysé une cohorte de 132 tumeurs. Nous avons utilisé le test MTT afin d’évaluer la sensibilité de 6 lignées cellulaires de NB et des CSC à un traitement avec AG seul ou en combinaison avec de la Doxo ou du Cis. Nous avons déterminé l’étendue de la mort cellulaire par Annexin-V et caractérisé les dommages à l’ADN à l’aide d’un marquage γH2aX. De plus, les modulations des voies de signalisation intracellulaire ont été analysées par Western Blot. La sensibilité des cellules à l’Obx a été analysée par MTT sur 6 lignées cellulaires de NB et sa combinaison avec le Cis a également été déterminée dans 2 lignées cellulaires. Le marquage Annexin-V et des combinaisons avec ZVAD-FMK ont aussi été utilisés pour caractériser les effets d’Obx sur l’apoptose. Des expériences in vivo ont également été faites. Nos résultats démontrent que l’expression de PARP-1 est associée aux tumeurs moins agressives. AG n’a peu ou pas effet sur la croissance tumorale et ne potentialise pas significativement les effets de la Doxo ou de Cis. AG combiné à la Doxo semble sensibiliser les CSC dans une lignée cellulaire. L’Annexin-V et le marquage γH2aX ne révèlent pas d’effets synergiques de cette combinaison et les dommages à l’ADN et la mort cellulaire observés sont attribués à la Doxo. Cependant, on observe une augmentation d’apoptose et de bris d’ADN dans une lignée cellulaire (SK-N-FI) lorsqu’AG est utilisé en monothérapie. On observe une surexpression de pAKT et pERK suite à la combinaison Doxo et AG. Les cellules de NB sont sensibles à l’Obx à des concentrations à l’échelle nanomolaire. De plus, Obx active la mort cellulaire par apoptose. Aussi, Obx a un effet synergique avec le Cis in vitro. In vivo, l’Obx diminue significativement la taille tumorale. Nous concluons que l’Obx présente une avenue thérapeutique prometteuse dans le traitement du NB alors que l’utilisation d’AG ne semble pas être aussi encourageante.

Mécanismes d'action des antioestrogènes totaux

Le cancer du sein est le cancer qui a la plus forte fréquence au Canada. En 2012, on estime que 23 200 nouveaux cas de cancer du sein seront diagnostiqués. Deux tiers des tumeurs mammaires expriment ou surexpriment le récepteur des oestrogènes α (ERα). De même, les oestrogènes sont importants pour la croissance de ces tumeurs. La présence des récepteurs hormonaux est un critère qui détermine le choix de la thérapie; à cet égard, le ciblage des récepteurs des oestrogènes par les antioestrogènes a pour but d’inactiver ces récepteurs et diminuer leur contribution à la croissance tumorale. Les antioestrogènes sont des inhibiteurs compétitifs de ERα. Tamoxifene est le médicament le plus utilisé pour traiter les tumeurs mammaires ER+ de tous les stades, avant ou après la ménopause. Tamoxifene est antioestrogène partiel ou SERM qui a un profile mixte d’activités agonistes et antagonistes. Fulvestrant ou ICI 182, 780 est un antioestrogène de type total ou SERD dépourvu de toute activité agoniste. Ce composé est utilisé en clinique chez les femmes après la ménopause ayant des tumeurs mammaires avancées. Fulvestrant constitue, donc, une deuxième ligne thérapeutique en cas de rechute après à un traitement par Tamoxifene. Afin de comprendre le potentiel thérapeutique de Fulvestrant, il est primordial d’étudier son impact sur ERα. Actuellement, la polyubiquitination et la dégradation de ERα sont les mécanismes les plus connus pour expliquer l’inactivation de ERα par Fulvestrant. Par ailleurs, en utilisant des modèles cellulaires ER+ et ER-; nous avons montré que les antioestrogènes totaux induisent une insolubilité de ERα indépendamment de leur capacité à induire sa dégradation. L’insolubilité corrèle avec l’association de ERα avec la matrice nucléaire et avec l’inhibition de sa transactivation. L’hélice H12 du domaine de liaison du ligand joue un rôle important dans l’insolubilité et l’inactivation de ERα par les antioestrogènes totaux. Par ailleurs, les antioestrogènes totaux se distinguent par leur capacité à induire la SUMOylation de ERα par SUMO1 et SUMO2/3. La SUMOylation est rapide et précède la dégradation de ERα dans cellules ER+. À l’aide de dérivés de l’antioestrogène total ICI 164, 384, nous avons montré que la chaine latérale des antioestrogènes totaux est à la base de l’induction de la SUMOylation et de l’inactivation de ERα. De plus, la SUMOylation semble être une marque d’inhibition, car la déSUMOylation restaure une activité de ERα en présence des antioestrogènes totaux. L’hélice H12 du LBD et le domaine de liaison à l’ADN sont requis pour l’induction de la SUMOylation. La recherche de protéines impliquées dans l’inactivation et dans la SUMOylation a permis d’identifier le facteur de remodelage de la chromatine ACF dans le même complexe que ERα. De manière similaire à la SUMOylation, le recrutement de ACF est précoce et constitue une propriété spécifique des antioestrogènes totaux. D’autre part, Fulvestrant induit le recrutement de ACF au niveau du promoteur du gène cible des oestrogènes pS2, ce qui suggère une contribution du remodelage de la chromatine dans les mécanismes d’action des antioestrogènes totaux. La surexpression de la DéSUMOylase SENP1 abolit le recrutement de ACF ce qui indique un rôle de la SUMOylation dans le recrutement de ACF. De même, l’hélice H12 du LBD de ERα constitue un lien entre l’inactivation de ERα et le recrutement de ACF. L’insolubilité, la SUMOylation et l'interaction du complexe ACF sont le reflet des mécanismes d’action des antioestrogènes totaux. Ces observations peuvent être utilisées comme des critères fonctionnels pour identifier d’autres composés avec de meilleures propriétés pharmacologiques que Fulvestrant.

IL-23 receptor and IL-12 receptor expression is restricted to distinct cell types in the IL-23R-GFP reporter mouse

Les maladies inflammatoires de l'intestin (MII) sont caractérisées par des réponses immunitaires incontrôlées dans l'intestin. Des études génétiques ont associé un polymorphisme dans le gène de l'IL23R à la résistance aux MII. IL23R code pour la protéine de l’IL-23r, une sous-unité du récepteur à l’IL-23 (IL-23R). Ce récepteur appartient à la famille de l’IL-12R, contenant plusieurs récepteurs hétérodimériques. D’ailleurs, IL-12R et IL-23R partagent la sous-unité IL12Rb1. Néanmoins, ces deux récepteurs favorisent des réponses immunitaires distinctes (Th1 vs Th17). Ce mémoire caractérise les dynamiques d’expression cellulaires de l’IL-23R et l’IL-12R, afin d’élucider leurs rôles dans l’inflammation. Nous avons établi qu’IL-23R et IL-12R ne sont jamais co-exprimés, malgré qu’ils partagent la sous-unité IL-12Rβ1. Parmi les cellules de rates de souris, la protéine IL-23r est trouvée dans certaines cellules T TCRγδ ou T CD4+, quelques cellules B et des cellules Lti-like. La protéine IL-12Rβ2 est exprimée par quelques cellules B. L’analyse de l’expression de l’IL-23R et l’IL-12R dans différents organes révéla que la plus grande proportion de cellules exprimant l’IL-23R se retrouve dans la lamina propria de l'intestin grêle, alors que les cellules exprimant l’IL-12Rβ2 ont été retrouvées en proportion équivalente dans tous les organes lymphoïdes. Ces observations appuient les études génétiques suggérant un rôle prédominant de l’IL23R dans les intestins. Finalement, des cultures in vitro suggèrent que l’IL-23R ou l’IL-12R avaient des réactions croisées à l’IL-12 ou l’IL-23. L’étude de l’IL-23R dans les MII devrait donc être complémentée par l’étude de l’IL-12R, car les deux récepteurs pourraient avoir des rôles complémentaires.

Identification des bases génétiques des myopathies à multi-minicores avec ou sans cardiomyopathie

Thèse réalisée en cotutelle avec l'Université Pierre et Marie Curie, Paris 6(UPMC, Paris, France).

Impact of (pro)renin receptor deficiency in adipose tissue using a genetically engineered mouse model

La stimulation du récepteur de la rénine/prorénine [(P) RR], un membre récemment découvert du système rénine-angiotensine (SRA), augmente l'activité du SRA et des voies de signalisation angiotensine II-indépendante. Pour étudier l'impact potentiel du (P)RR dans le développement de l`obésité, nous avons émis l'hypothèse que les souris déficientes en (P)RR uniquement dans le tissus adipeux (KO) auront une diminution du poids corporel en ciblant le métabolisme du tissu adipeux, l'activité locomoteur et/ou la prise alimentaire. Ainsi, des souris KO ont été générées en utilisant la technologie Cre/Lox. Le gain de poids et la prise alimentaire ont été évalués hebdomadairement dans les mâles et femelles KO et de type sauvage (WT) pendant 4 semaines alors qu’ils étaient maintenu sur une diète normal. De plus, un groupe de femelles a été placé pour 6 semaines sur une diète riche en gras et en glucides (HF/HC). La composition corporelle et l'activité ambulatoire ont été évaluées par l’EchoMRI et à l’aide de cages Physioscan, respectivement. Les tissus adipeux ont été prélevés et pesés. De plus, les gras péri-gonadaux ont été utilisés pour le microarray. Finalement, le niveaux d'expression d'ARNm du (P)RR ont été évalués. Comme le gène du (P)RR est situé sur le chromosome X, les mâles étaient des KOs complets et les femelles étaient des KOs partielles. Les souris KO avaient un poids corporel significativement plus petit par rapport à WT, les différences étant plus prononcées chez les mâles. De plus, les femelles KOs étaient résistantes à l'obésité lorsqu'elles ont été placées sur la diète HF/HC et donc elles avaient significativement moins de masse grasse par rapport aux WTs. L’analyse histologique des gras péri-gonadaux des KOs nous ont dévoilés qu’il avait une réduction du nombre d'adipocytes mais de plus grande taille. Bien qu'il n'y ait eu aucun changement dans la consommation alimentaire, une augmentation de près de 3 fois de l'activité ambulatoire a été détectée chez les mâles. De plus, nous avons observé que leurs tibias étaient de longueur réduite ce qui suggère fortement l'affection de leur développement. Les gras péri-gonadaux des souris KO avaient une expression réduite de l`ABLIM2 (Actin binding LIM protein family, member 2) qui est associé avec le diabète de type II chez l'humain. Ainsi, les données recueillies suggèrent fortement que le (P)RR est impliquée dans la régulation du poids corporelle.

Rôle de l’azote dans la structure et la fonction des communautés de cyanobactéries toxiques

Dans cette étude de trois lacs sujets aux efflorescences de cyanobactéries, nous avons examiné la diversité des bactéries diazotrophes et des cyanobactéries toxiques. Nous avons tenté de définir les facteurs environnementaux influençant la composition des communautés phytoplanctoniques, la concentration ainsi que la composition des microcystines (MCs). Nous avons émis l’hypothèse que l’azote jouerait un rôle majeur dans le façonnement des communautés cyanobactériennes et influencerait la concentration et composition des MCs. Des concentrations de cette toxine ainsi que le gène mcyE codant pour l’enzyme microcystine synthétase ont été détectés à chaque échantillonnage dans tous les lacs. L’azote, particulièrement sous sa forme organique dissoute (AOD) ainsi que la température de l’eau étaient les facteurs environnementaux expliquant le mieux les concentrations des MCs, tandis que la biomasse de Microcystis spp. était globalement le meilleur prédicteur. Le gène nifH codant pour l’enzyme nitrogénase (fixation d’azote) a aussi été détecté dans chaque échantillon. Malgré les concentrations faibles en azote inorganique dissous (AID) et les densités importantes d’hétérocystes, aucun transcrits du gène n’a été détecté par réverse-transcription (RT-PCR), indiquant que la fixation d’azote n’avait pas lieu à des niveaux détectables au moment de l’échantillonnage. De plus, le pyroséquençage révèle que les séquences des gènes nifH et mcyE correspondaient à différents taxons, donc que les cyanobactéries n’avaient pas la capacité d’effectuer les deux fonctions simultanément.

Implication des peptides RALFs dans les communications cellulaires lors du développement du gamétophyte femelle chez Solanum chacoense et Arabidopsis thaliana.

Chez les angiospermes, la reproduction passe par la double fécondation. Le tube pollinique délivre deux cellules spermatiques au sein du gamétophyte femelle. Une cellule féconde la cellule œuf pour produire un zygote; l’autre féconde la cellule centrale pour produire l’endosperme. Pour assurer un succès reproductif, le développement du gamétophyte femelle au sein de l’ovule doit établir un patron cellulaire qui favorise les interactions avec le tube pollinique et les cellules spermatiques. Pour ce faire, un dialogue doit s’établir entre les différentes cellules de l’ovule lors de son développement, de même que lors de la fécondation. D’ailleurs, plusieurs types de communications intercellulaires sont supposées suite à la caractérisation de plusieurs mutants développementaux. De même, ces communications semblent persister au sein du zygote et de l’endosperme pour permettre la formation d’un embryon viable au sein de la graine. Malgré les développements récents qui ont permis de trouver des molécules de signalisation supportant les modèles d’interactions cellulaires avancés par la communauté scientifique, les voies de signalisation sont de loin très incomplètes. Dans le but de caractériser des gènes encodant des protéines de signalisation potentiellement impliqués dans la reproduction chez Solanum chacoense, l’analyse d’expression des gènes de type RALF présents dans une banque d’ESTs (Expressed Sequence Tags) spécifiques à l’ovule après fécondation a été entreprise. RALF, Rapid Alcalinization Factor, est un peptide de 5 kDa qui fait partie de la superfamille des «protéines riches en cystéines (CRPs)», dont les rôles physiologiques au sein de la plante sont multiples. Cette analyse d’expression a conduit à une analyse approfondie de ScRALF3, dont l’expression au sein de la plante se limite essentiellement à l’ovule. L’analyse de plantes transgéniques d’interférence pour le gène ScRALF3 a révélé un rôle particulier lors de la mégagamétogénèse. Les plantes transgéniques présentent des divisions mitotiques anormales qui empêchent le développement complet du sac embryonnaire. Le positionnement des noyaux, de même que la synchronisation des divisions au sein du syncytium, semblent responsables de cette perte de progression lors de la mégagamétogénèse. L’isolement du promoteur de même que l’analyse plus précise d’expression au sein de l’ovule révèle une localisation sporophytique du transcrit. La voie de signalisation de l’auxine régule également la transcription de ScRALF3. De surcroît, ScRALF3 est un peptide empruntant la voie de sécrétion médiée par le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi. En somme, ScRALF3 est un important facteur facilitant la communication entre le sporophyte et le gamétophyte pour amener à maturité le sac embryonnaire. L’identification d’un orthologue potentiel chez Arabidopsis thaliana a conduit à la caractérisation de AtRALF34. L’absence de phénotype lors du développement du sac embryonnaire suggère, cependant, de la redondance génétique au sein de la grande famille des gènes de type RALF. Néanmoins, les peptides RALFs apparaissent comme d’importants régulateurs lors de la reproduction chez Solanum chacoense et Arabidopsis thaliana.

Étude fonctionnelle du couplage chimiokine-estrogène dans les tissus reproducteurs

Les estrogènes sont impliqués dans plusieurs aspects de la physiologie humaine en particulier, le développement, la croissance, la différenciation des tissus reproducteurs, la reproduction, et la grossesse. Les effets cellulaires des estrogènes sont transmis via l'interaction avec les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ. L’activation de ERα et ERβ contrôle directement la transcription des gènes cibles nécessaires pour médier les effets physiologiques des estrogènes. L’effet des estrogènes peut aussi être mitogénique et devient la cause de plusieurs pathologies surtout dans les tissus qui présentent une sensibilité accrue à l’hormone tel que les tissus mammaires, les ovaires et l’utérus. De ce fait, une surexposition de ces tissus à l’estrogène augmente le risque de développer le cancer. Dans une lignée cellulaire qui coexprime les deux récepteurs, nous avons identifié la chimiokine SDF-1 qui interagit avec le récepteur CXCR4 et qui décrit une boucle de régulation autocrine/paracrine entre la voie des chimiokines et celle des estrogènes. Cette régulation induit une augmentation de l’expression des gènes cibles prolifératifs du cancer du sein. Cependant, les mécanismes exacts de cette régulation restent inconnus. Afin d'identifier les cibles exactes de cette régulation au niveau génomique, nous avons développé un modèle cellulaire pour discriminer le rôle respectif de ERα et ERβ au niveau du contrôle transcriptionnel de cette boucle de régulation des chimiokines. En partant d’une lignée cellulaire ER-, nous avons généré un système cellulaire qui exprime l’un ou l’autre des isoformes en plus du mutant ERβ-S87A. Nous avons construit le promoteur CXCR4bLuc qu’on a testé dans les lignées cellulaires générées. En utilisant la construction du promoteur CXCR4bLuc, nous avons démontré une voie de régulation des récepteurs des chimiokines par les récepteurs des estrogènes. L’activation membranaire de CXCR4 par SDF-1 implique l’activation directe du récepteur de l’estrogène ERβ par phosphorylation de la sérine 87. Cette phosphorylation active ERβ et favorise l’expression du gène de CXCR4. La transcription de CXCR4 passe par la liaison de ERβ au niveau d’un élément de liaison ERE que nous avons identifié dans ce travail par la technique de ChIP. Ainsi, nous avons identifié une cible exacte de la régulation des récepteurs des chimiokines CXCR4 par le récepteur des estrogènes ERβ qui peut constituer une approche prometteuse pour contrer les pathologies associées au cancer du sein et ses métastases.

Mutations impliquées dans la progression du cancer épithélial de l'ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire (CEO) est le cancer gynécologique le plus létal. Plus de 70% des patientes diagnostiquées avec une tumeur de stade avancé rechutent suite aux traitements chimiothérapeutiques de première ligne, la survie à cinq ans étant ainsi très faible. Afin de mieux comprendre l’évolution de la maladie, nous avons recherché de nouveaux gènes, responsables de l’initiation et de la progression du CEO. Précédemment, des lignées cellulaires ont été dérivées à partir de la tumeur primaire et récurrente et/ou d’ascites de trois patientes. Le séquençage de l’ARN de ces lignées par la technologie de séquençage de nouvelle génération (TSNG) nous a permis d’identifier des mutations ponctuelles qui pourraient nous indiquer des gènes dérégulés dans le CEO. La TSNG est un bon outil qui permet d’identifier et de cribler à grande échelle des mutations. Nous avons sélectionné PLEC1, SCRIB, NCOR2, SEMA6C, IKBKB, GLCE et ITGAE comme gènes candidats présentant des mutations dans nos lignées et ayant une relation fonctionnelle avérée avec le cancer. Étant donné que la TSNG est une technique à taux de fiabilité limité, nous avons validé ces mutations par séquençage Sanger. Ensuite, nous avons étudié l’effet de ces mutations sur la structure protéique et l’expression de PLEC1, de SCRIB et de SEMA6C. Seules certaines mutations dans les gènes PLEC1, SCRIB et SEMA6C ont pu être confirmées. PLEC1 et SCRIB sont deux protéines d’échafaudage dont la mutation, rapportée dans plusieurs cancers, pourrait induire des changements de leurs conformations et affecter leurs interactions et leurs fonctions. Les conséquences de ces mutations sur la tumorigenèse de l’ovaire devront être étudiées.

Rôle du facteur de transcription BP1 dans la régulation des gènes du locus humain de beta-globine

Le facteur de transcription BP1 humain est exprimé dans les cellules érythroïdes pendant le développement fœtal mais son niveau d’expression est réduit au stade adulte. Les études antérieures in vitro ont montré que BP1 est un répresseur du gène adulte de β-globine mais sa fonction dans la régulation des gènes ε et γ n’a pas été abordée à ce jour. Dans notre étude, nos analyses de BP1 humain ont été menées in vivo au stade embryonnaire en utilisant une lignée de souris transgénique surexprimant BP1 dans les cellules érythroïdes définitives murines. Au niveau protéique, BP1 humain est exprimé aux âges E12.5 et E13.5 dans les cellules érythroïdes fœtales des embryons transgéniques. Toutefois, les niveaux de BP1 humain ne perturbent pas l’érythropoïèse définitive fœtale: les embryons transgéniques ne sont pas anémiques et ne meurent pas in utero. La surexpression de BP1 humain altère tout de même le niveau endogène des facteurs de transcription Ikaros et SOX6 impliqués dans la régulation des gènes de β-globine durant l’érythropoïèse définitive fœtale murine. Chez les embryons doubles transgéniques exprimant BP1 et les gènes humains de β-globine à E12.5, l’expression du gène adulte β est réduite alors que celle des gènes ε et γ est non réprimée. Les mesures d’expression des gènes humains de β-globine effectuées en absence d’Ikaros à E12.5 précisent le rôle de BP1 humain dans l’activation du gène embryonnaire ε. Dans les cellules érythroïdes fœtales murines dépourvues d’Ikaros à E12.5, BP1 humain augmente grandement l’expression des facteurs de transcription EKLF et BCL11A et semble déréprimer l’expression de SOX6, ce qui conduit à une répression des gènes fœtaux et une activation du gène adulte β au jour embryonnaire murin suivant. Puisque BP1 atténue l’altération de l’expression des gènes fœtaux et adultes causée par l’absence d’Ikaros, nous proposons que BP1 et Ikaros soient liés dans les mécanismes de transcription des gènes humains de β-globine.

Facteurs génétiques de prédisposition à la maladie coeliaque et l'oesophagite éosinophilique

Les maladies immunitaires chroniques incluant les maladies auto-immunes et inflammatoires touchent 20 à 25% de la population des pays occidentaux. La comparaison des taux de concordance chez les jumeaux ou l’histoire familiale de sujets atteints de la maladie cœliaque (maladie auto-immune de l’intestin) ou de l’œsophagite éosinophilique (maladie inflammatoire de l’œsophage) indiquent que des facteurs génétiques et environnementaux interviennent dans la susceptibilité à ces maladies. Cependant, ces études ne distinguent pas de manière claire la prédisposition génétique selon l’hétérogénéité clinique (enfants versus adultes) ou ethnique (stratification des populations). Méthodes. Les haplotypes HLA de prédisposition à la maladie cœliaque et les polymorphismes des gènes candidats IL-13 (R130Q), IL-5 (-746 T/G) et IL-5R (-80A/G) impliqués dans la physiopathologie de l’œsophagite éosinophilique, ont été caractérisés par la technique PCR-SSP sur l’ADN génomique. Résultats: Nos études familiales et cas-contrôles réalisées chez une population Québécoises avec un fond génétique très homogène nous a permis : i) d’éviter le problème de stratification des populations, ii) de confirmer que les gènes HLA sont également associés à la maladie cœliaque (enfants et adultes) au Québec comme dans les autres populations Caucasiennes, iii) de mettre en évidence le rôle du gène IL-13 dans la prédisposition à l’œsophagite éosinophilique (garçons et filles) et d’exclure les gènes IL-5 et IL-5R comme facteurs de susceptibilité dans notre population. Conclusion: Ce travail confirme pour la première fois l’impact des gènes HLA dans la prédisposition à la maladie cœliaque et le rôle du facteur génétique dans l’œsophagite éosinophilique chez une population Canadienne Française avec un fond génétique ayant un fort effet fondateur.

Associations entre des polymorphismes génétiques des gènes CHRN et l'étourdissement ressenti lors de l'initiation à la nicotine

Objectifs: Plusieurs polymorphismes nucléaires localisés sur les gènes des récepteurs nicotiniques cholinergiques CHRN sont associés au tabagisme. Cependant, peu d’études ont examiné l’association entre les polymorphismes sur les gènes CHRN et l’étourdissement. Les polymorphismes et les symptômes subjectifs sont peu être lié à la dépendance à la nicotine et à l’étourdissement ressenti lors de l’initiation. Le but de cette étude est d’étudier l’association entre 61 polymorphismes sur huit gènes CHRN (CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5, CHRNA6, CHRNA7, CHRNB2, CHRNB3, CHRNB4) et l’étourdissement ressenti lors de l’initiation. Méthodes: Les données provenant d'une étude de cohorte longitudinale composée de 1293 étudiants, ont été analysées selon un devis d'étude gène-candidat. Les données ont été collectées par le biais de questionnaires auto-reportés aux troix mois, durant 5 ans. L’ADN provenent de la salive ou du sang a été génotypé pour 61 polymosphismes localisés sur les gènes CHRN ont été génotypés, à l'aide d'une stratégie de couverture maximale du gène. L'équation d'analyse est une régression logistique, incluant un ajustement sur l’âge, le sexe et l’origine ethnique. Résultats: Trois SNPs sur le gène CHRNA6 (rs7812298, rs2304297, rs7828365) sont associés à notre phénotype (OR (95% CI)= 0.54 (0.36, 0.81), 0.59 (0.40, 0.86) and 0.58 (0.36, 0.95, respectivement),. Trois autres polymorphismes (rs3743077 (CHRNA3), rs755204 (CHRNA4), rs7178176 (CHRNA7)) sont également associés à phénotype (OR (95% CI)=1.40 (1.02, 1.90), 1.85 (1.05, 3.27) and 1.51 (1.06, 2.15), respectivement) Conclusion: Plusieurs SNPs localisés sur les gènes CHRN sont associés à l'étourdissement, un phénotype de l'initiation qui est peut-être associé à la dépendance à la nicotine.

Antigen and superantigen presentation as defined by the MHCII-accessory proteins and associated-peptides

MHCII molecules expose a weave of antigens, which send survival or activation signals to T lymphocytes. The ongoing process of peptide binding to the MHC class II groove implicates three accessory molecules: the invariant chain, DM and DO. The invariant chain folds and directs the MHCII molecules to the endosomal pathway. Then, DM exchanges the CLIP peptide, which is a remnant of the degraded invariant chain, for peptides of better affinity. Expressed in highly specialized antigen presenting cells, DO competes with MHCII molecules for DM binding and favors the presentation of receptor-internalized antigens. Altogether, these molecules exhibit potential immunomodulatory properties that can be exploited to increase the potency of peptide vaccines. DO requires DM for maturation and to exit the ER. Interestingly, it is possible to monitor this interaction through a conformation change on DOβ that is recognized by the Mags.DO5 monoclonal antibody. Using Mags.DO5, we showed that DM stabilizes the interactions between the DO α1 and β1 chains and that DM influences DO folding in the ER. Thus, the Mags.DO5+ conformation correlates with DO egress from the ER. To further evaluate this conformation change, directed evolution was applied to DO. Of the 41 unique mutants obtained, 25% were localized at the DM-DO binding interface and 12% are at the solvent-exposed β1 domain, which is thought to be the Mags.DO5 epitope. In addition, I used the library to test the ability of HLA-DO to inhibit HLA-DM and sorted for the amount of CLIP. Interestingly, most of the mutants showed a decrease inhibitory effect, supporting the notion that the intrinsic instability of DO is a required for its function. Finally, these results support the model in which DO competes against classical MHCII molecules by sequestering DM chaperone’s function. MHCII molecules are also characterized by their ability to present superantigens, a group of bacterial or viral toxins that coerces MHCII-TCR binding in a less promiscuous fashion than what is observed in a canonical setting. While the mechanism of how bacterial superantigens form trimeric complexes with TCR and MHCII is well understood, the mouse mammary tumor virus superantigens (vSAG) are poorly defined. In the absence of a crystal structure, I chose a functional approach to examine the relation between vSAG, MHCII and TCR with the goal of uncovering the overall trimolecular architecture. I showed that TCR concomitantly binds both the MHCII α chain and the vSAG and that TCR-MHCII docking is almost canonical when coerced by vSAGs. Because many peptides may be tolerated in the MHCII groove, the pressure exerted by vSAG seems to tweak conventional TCR-MHCII interactions. Furthermore, my results demonstrate that vSAG binding to MHCII molecules is conformation-dependent and abrogated by the CLIP amino-terminal residues extending outside the peptide-binding groove. In addition, they also suggest that vSAGs cross-link adjacent MHCIIs and activate T cells via a TGXY motif.

Les Déterminants Génétiques de la Pharmacocinétique du Busulfan et les Résultats de la Transplantation

Le busulfan (Bu) est un composé clé de la phase de conditionnement chez les enfants subissant une transplantation des cellules souches hématopoïétiques (TCSH). Les différences inter-individuelles de la pharmacocinétique (PK) du Bu pourraient affecter son efficacité et sa toxicité. Le Bu est principalement métabolisé par la glutathion-S-transférase (GST). Nous avons étudié la relation des génotypes GSTA1, GSTM1 et GSTP1 avec la PK de la première dose de Bu et la relation avec les résultats de la TCSH chez 69 enfants recevant un régime de conditionnement myéloablatif. Le génotype GSTM1 nul a corrélé avec une exposition élevée du Bu et une faible clairance (CL) chez les patients âgés de 4 ans (p ≤ 0,04). Dans le respect du rôle fonctionnel suggéré d’haplotype GSTA1 *A2, il a été associé à des niveaux plus faibles de médicaments et des niveaux élevés de CL (p ≤ 0,03). L’effet Gène-dose a également été observé (p = ≤ 0,007). L’haplotype de GSTA1 était associé avec les résultats de la TCSH. Les porteurs de deux copies d’haplotype *A2 avaient une meilleure survie sans événement (p = 0,03). En revanche, les individus homozygotes pour haplotypes * B et *B1 ont un risque plus élevé d’atteindre la maladie veino-occlusive (MVO) (p = 0,009). Les individus porteurs de GSTM1 nul âgés de 4 ans possèdent un risque plus fréquent d’avoir la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD) (p = 0,03). En conclusion, nous avons montré que les variantes génétiques de GST influencent la PK du BU et les résultats de la TCSH chez les enfants. Pour l'ajustement de la posologie, un modèle avec l'inclusion des facteurs génétiques et non génétiques devrait être évalué et validé dans une étude prospective.

Identification et caractérisation d’une souris mutante Skam26Jus comme un nouveau modèle des anomalies du tube neural

Les anomalies du tube neural (ATN) sont des malformations congénitales très fréquentes chez l’humain en touchant 1-2 nouveau-nés sur 1000 naissances. Elles résultent d’une fermeture incomplète du tube neural lors de l’embryogenèse. L’étiologie des ATN est complexe impliquant des facteurs environnementaux et des facteurs génétiques. La souris représente un outil puissant afin de mieux comprendre la génétique des ATN. Particulièrement, la souris modèle a impliqué fortement la voie de la polarité cellulaire planaire (PCP) dans ces malformations. Dans cette étude, nous avons identifié et caractérisé une nouvelle souris mutante, Skam26Jus dans le but d’identifier un nouveau gène causant les ATN. Skam26Jus a été générée par l’agent mutagène N-Ethyl-N-Nitrosuera. Cette souris est caractérisée par une queue en forme de boucle ou de crochet, soit un phénotype associé aux ATN. La complémentation génétique de la souris Skam26Jus avec une souris mutante d’un gène de la voie PCP Vangl2 (Looptail) a montré une interaction génétique entre le gène muté chez Skam26Jus et Vangl2, suggérant que ces deux gènes fonctionnent dans des voies de signalisation semblables ou parallèles. Un total de 50% des embryons doubles hétérozygotes avec un phénotype de la queue présentent un spina bifida. La cartographie par homozygotie du génome entier suivie par un clonage positionnel a permis d’identifier Lrp6 comme le gène muté chez Skam26Jus. Une mutation homozygote, p.Ile681Arg, a été identifiée dans Lrp6 chez les souris ayant une queue en boucle/crochet. Cette mutation était absente dans 30 souches génétiques pures indiquant que cette mutation est spécifique au phénotype observé. Une étude de phénotype-génotype évalue la pénétrance à 53 % de la mutation Ile681Arg. Lrp6 est connu pour activer la voie canonique Wnt/β-caténine et inhiber la voie non canonique Wnt/PCP. Le séquençage de la région codante et de la jonction exon-intron de LRP6 chez 268 patients a mené à l’identification de quatre nouvelles rares mutations faux sens absentes chez 272 contrôles et de toutes les bases de données publiques. Ces mutations sont p.Tyr306His ; p.Tyr373Cys ; p.Val1386Ile; p.Tyr1541Cys et leur pathogénicité prédite in silico indiquent que p.Val1386Ile est bénigne, et que p.Tyr306Hiset p.Tyr373Cys et p.Tyr1541Cys sont i possiblement dommageables. Les mutations p.Tyr306His, p.Tyr373Cys et p.Tyr1541Cys ont affecté l’habilité de LRP6 d’activer la voie Wnt/β-caténine en utilisant le système rapporteur luciférase de pTOPflash. Nos résultats suggèrent que LRP6 joue un rôle dans le développement des ATN chez une petite fraction de patients ayant une ATN. Cette étude présente aussi Skam26Jus comme un nouveau modèle pour étudier les ATN chez l’humain et fournit un outil important pour comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine des A TN.