Generation and screening of natural product-like compounds for antibiotic discovery

Avec l’apparition de plus en plus de souches de bactérie résistante aux antibiotiques, le développement de nouveaux antibiotiques est devenu une important problématique pour les agences de santé. C’est pour cela que la création de nouvelles plateformes pour accélérer la découverte de médicaments est devenu un besoin urgent. Dans les dernières décennies, la recherche était principalement orientée sur la modification de molécules préexistantes, la méta-analyse d’organismes produisant des molécules activent et l’analyse de librairies moléculaires pour trouver des molécules synthétiques activent, ce qui s’est avéré relativement inefficace. Notre but était donc de développer de nouvelles molécules avec des effets thérapeutiques de façon plus efficace à une fraction du prix et du temps comparé à ce qui se fait actuellement. Comme structure de base, nous avons utilisé des métabolites secondaires qui pouvaient altérer le fonctionnement des protéines ou l’interaction entre deux protéines. Pour générer ces molécules, j’ai concentré mes efforts sur les terpènes, une classe de métabolites secondaires qui possède un large éventail d’activités biologiques incluant des activités antibactériennes. Nous avons développé un système de chromosome artificiel de levure (YAC) qui permet à la fois l’assemblage directionnel et combinatoire de gènes qui permet la création de voies de biosynthèse artificielles. Comme preuve de concept, j’ai développé des YACs qui contiennent les gènes pour l’expression des enzymes impliquées dans la biosynthèse de la -carotène et de l’albaflavenone et produit ces molécules avec un haut rendement. Finalement, Des YACs produits à partir de librairies de gènes ont permis de créer une grande diversité de molécules.

Effet de Streptococcus Suis sur la capacité de présentation antigénique de cellules dendritiques

Streptococcus suis est un important pathogène porcin et humain, causant méningites et septicémies. Des études suggèrent que S. suis dispose de facteurs de virulence, notamment sa capsule polysaccharidique (CPS), qui lui permettent de moduler les fonctions des cellules dendritiques (DCs), situées à l’interface entre l’immunité innée et adaptative. Les difficultés à développer un vaccin efficace suggèrent aussi une altération de la voie T dépendante. L’objectif général du projet était d’évaluer l’effet de S. suis sur l’activation des cellules T CD4+ ainsi que sur la capacité de présentation antigénique des DCs. Nous avons étudié dans un modèle murin in vivo la réponse T CD4+ mémoire lors d’infections primaire et secondaire. Une faible réponse mémoire centrale a été obtenue, suggérant que la réponse adaptative générée contre S. suis est limitée. Étant donné l’importance du complexe majeur d’histocompatibilité (MHC) de classe II dans la présentation antigénique, nous avons évalué in vitro et in vivo l’expression de ces molécules chez les DCs. Une modulation de l’expression du MHC-II par S. suis a été observée. L’analyse de la transcription de gènes impliqués dans la régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle du MHC-II nous permet de suggérer que S. suis régule à la baisse la synthèse de nouvelles molécules et favorise leur dégradation lysosomale. Cette stratégie, dans laquelle la CPS ne jouerait qu’un rôle partiel, permettrait à S. suis d’échapper à la réponse adaptative T dépendante. Les résultats de cette étude fourniront de nouvelles perspectives dans la compréhension de la réponse adaptative lors de l’infection par S. suis.

Étude des voies de signalisation activées par la prostaglandine F2α dans les cellules de cancer colorectal

Le cancer colorectal représente la troisième forme de cancer la plus fréquente au Canada. Malgré les récents développements, aucun traitement curatif n’est disponible pour les patients diagnostiqués à un stade avancé de la maladie. Plusieurs évidences supportent un rôle important des prostaglandines dans cette maladie. En effet, une surexpression des récepteurs de type EP et FP est remarquée. Ces derniers ainsi que les molécules de signalisations intracellulaires qu’ils activent représentent donc de nouvelles cibles pour traiter ce cancer. Nous et d’autres groupes avons démontré que les protéines G monomériques sont des petits interrupteurs moléculaires importants dans la signalisation intracellulaire engagée par les récepteurs dans des cellules saines mais qu’un dérèglement de celles-ci est associé au cancer. L’objectif principal de ce projet de recherche vise donc à identifier les voies de signalisations par lesquelles le récepteur FP contribue aux capacités invasives des cellules tumorales d’origine colorectale. Notre hypothèse est que la protéine ARF6, une des 6 isoformes des ARFs, et la protéine RhoA, agissent pour coordonner l’activation des voies de signalisations associées à la migration et l’invasion cellulaire. Nos résultats ont indiqué que la stimulation des cellules HEK293 exprimant de façon stable le récepteur FP (HA-FP) ainsi que les cellules SW480, une lignée invasive de cancer colorectal, par le PGF2α augmentait les niveaux d’activation d’ARF6 mais également de la protéine RhoA. De plus, d’autres médiateurs et intermédiaires associés à la réorganisation du cytosquelette comme la cofiline et la chaine légère de la myosine (MLC) ont été hautement phosphorylés suite à la stimulation par la prostaglandine. Ces observations sont associées avec une augmentation des fibres de stress dans les cellules. Nous avons tenté de déterminer si l’inhibition de ces protéines G affectait la capacité du PGF2α à activer ces intermédiaires de signalisation ainsi que certains effets biologiques. Ainsi, nos expériences contribueront à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement du cancer colorectal.

L'acide valproïque inhibe la progression dans le cycle cellulaire chez Saccharomyces cerevisiae

L’acétylation est une modification post-traductionnelle des protéines essentielles. Elle est impliquée dans bon nombre de processus cellulaires importants comme la régulation de la structure de la chromatine et le recrutement de protéines. Deux groupes d’enzymes, soient les lysines acétyltransférases et les lysines désacétylases, régulent cette modification, autant sur les histones que sur les autres protéines. Au cours des dernières années, de petites molécules inhibitrices des désacétylases ont été découvertes. Certaines d’entre elles semblent prometteuses contre diverses maladies telles le cancer. L’acide valproïque, un inhibiteur de deux des trois classes des désacétylases, a un effet antiprolifératif chez plusieurs organismes modèles. Toutefois, les mécanismes cellulaires sous-jacents à cet effet restent encore méconnus. Ce mémoire met en lumière l’effet pH dépendant de l’acide valproïque sur différentes voies cellulaires importantes chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Il démontre que ce composé a la capacité d’inhiber la transition entre les phases G1 et S par son action sur l’expression des cyclines de la phase G1. De plus, il inhibe l’activation de la kinase principale de la voie activée suite à un stress à la paroi cellulaire. L’acide valproïque occasionne également un arrêt dans la réplication de l’ADN sans y causer de dommage. Il s’agit là d’un effet unique qui, à notre connaissance, n’est pas observable avec d’autres agents qui inhibent la progression en phase S.

Proscillaridin A effects on histone acetylation and C-MYC degradation in acute lymphoblastic leukemia

La leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) représente environ 25% des cancers pédiatriques diagnostiqués chaque année. Dans 80 % des cas, une rémission complète est observée. Cependant, les patients résistants aux traitements ainsi que les patients en rechute présentent un mauvais pronostique. Les altérations épigénétiques sont des facteurs essentiels dans le développement et la progression de la maladie, ainsi qu’à la résistance aux traitements. Lors d’un criblage de médicaments approuvés par la FDA, nous avons découvert des molécules ayant des caractéristiques anticancéreux et épigénétiques. Pour évaluer l’activité de ces molécules, nous avons procédé à un criblage secondaire sur plusieurs lignées cellulaires leucémiques. Nous avons découvert qu’une de ces molécules, un glucoside cardiotonique appelé la proscillaridine A, avait une activité anticancéreuse spécifique pour des cellules leucémiques. Nous faisons donc l’hypothèse que la proscillaridine A pourrait avoir des effets épigénétiques et anticancéreux dans des modèles précliniques de LLA. Pour tester cette hypothèse, nous avons traité deux lignées cellulaires de LLA Nalm-6 (LLA pre-B) et Molt-4 (T-LLA) in vitro pendant 2 à 96 heures à des doses pertinentes sur le plan clinique. Nous avons alors pu observer une inhibition de croissance qui était dépendante de la dose administrée dans les deux lignées cellulaires, avec des valeurs de 50% d’inhibition de croissance (CI50) de 3.0 nM pour les Nalm-6 et de et 2.3 nM pour les Molt-4. De plus, nos études sur le cycle cellulaire par BrdU démontrent un arrêt en phase G2/M. Nous avons également détecté par immunobuvardage de type western des baisses significatives de l’acétylation de résidus de l’histone 3. Les niveaux d’expression des enzymes responsables de cette acétylation, les histones acétyltransférases CBP, P300 et TIP60 ainsi que de l’oncogène C-MYC étaient également diminuées. Par des analyses de séquençage de l’ARN, nous avons observé une augmentation de l’expression des gènes impliquées dans les processus d’apoptose et de différentiation cellulaire, ainsi qu’une diminution des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire comme en particulier les gènes cibles de C-MYC. Ces résultats prometteurs suggèrent le potentiel prometteur de la proscillaridine A comme nouvelle thérapie pour les patients atteints de LLA.

L’exploitation d’un modèle de levure présentant une déficience de l’absorption des anthracyclines révèle qu’une protéine de Caenorhabditis elegans, OCT-1, est un transporteur fonctionnel d’anthracyclines

Les anthracyclines, comme la doxorubicine (DOX) ou la daunorubicine (DNR), sont utilisées dans le traitement d’une grande variété de cancers allant des lymphomes, au cancer du sein, en passant par certaines leucémies. Encore aujourd’hui, beaucoup pensent que les anthracyclines entrent dans les cellules par diffusion passive, toutefois, la plupart de ces mêmes personnes sont d’accord pour dire que la p-glycoprotéine est responsable d’exporter ces molécules hors de la cellule. Mais pourquoi une molécule aurait besoin d’un transporteur pour sortir de la cellule, et pas pour y entrer ? Qu’est-ce qui ferait que la diffusion passive fonctionnerait dans un sens, mais pas dans l’autre, d’autant que l’entrée des anthracyclines dans les cellules est très rapide ? Nous pensons qu’il existe bel et bien un transporteur responsable de faire passer les anthracyclines du milieu extracellulaire au cytoplasme, et nous voulons développer un modèle de levure qui permettrait de déterminer si une protéine, un transporteur, issue d’un autre organisme eucaryote est en mesure de transporter la DOX à l’intérieur de la cellule. Pour ce faire, nous avons rassemblé un groupe de mutants présentant une déficience dans l’absorption d’autres molécules chargées positivement telles que la bléomycine ou le NaD1 et avons déterminé le taux d’absorption de DOX de chacun de ces mutants. Les simples mutants sam3Δ ou dur3Δ n’ont montré qu’une faible réduction de l’absorption de DOX, voire, aucune, par rapport à la souche parentale. Si le double mutant sam3Δdur3Δ a montré une réduction relativement importante de l’absorption de DOX, c’est le mutant agp2Δ qui présentait la plus grande réduction d’absorption de DOX, ainsi qu’une résistance notable à son effet létal. Nous avons utilisé, par la suite, ce mutant pour exprimer, à l’aide d’un vecteur d’expression, une protéine du ver Caenorhabditis elegans, OCT-1 (CeOCT-1). Les résultats ont montré que cette protéine était en mesure de restaurer l’absorption de DOX, compromise chez le mutant agp2Δ ainsi que d’augmenter la sensibilité de la souche parentale à son effet létal, lorsqu’exprimée chez celle-ci. Cela suggère que CeOCT-1 est un transporteur fonctionnel de DOX et contredit également le dogme selon lequel les anthracyclines entrent dans les cellules par diffusion passive.

Les récepteurs GPR91 et GPR99 et leur implication dans le développement du système nerveux visuel

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) démontrent de plus en plus de capacités à activer des mécanismes jusqu’alors associés à des facteurs de transcription ou des molécules d’adhésion. En effet, de nouvelles preuves rapportent qu’ils pourraient également participer au guidage axonal qui est le mécanisme permettant aux axones de cellules nerveuses de rejoindre leur cible anatomique. Le guidage axonal se fait par l’interaction entre les molécules de guidage et une structure particulière présente à l’extrémité de l’axone, le cône de croissance. Par exemple, les RCPGs participent au guidage des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), dont les axones s’étendent de la rétine jusqu’au noyaux cérébraux associés à la vision. Cet effet est observé avec des RCPGs tels que les récepteurs aux cannabinoïdes (CB1 et CB2) et celui du lysophosphatidylinositol, le GPR55. Les RCPGs GPR91 et GPRG99, respectivement récepteurs au succinate et à l’α-cétoglutarate, se trouvent à la surface de ces CGRs, ce qui en font des candidats potentiels pouvant participer au guidage axonal. Dans ce mémoire, l’effet des ligands de ces récepteurs sur la croissance et la navigation des axones des CGRs fut analysé. L’impact produit par ces récepteurs ainsi que leurs ligands sur la morphologie des cônes de croissance fut déterminé en mesurant leur taille et le nombre de filopodes présents sur ces cônes. Pour évaluer le rôle du succinate et de l’a-cétoglutarate sur la croissance globale des axones de CGRs, la longueur totale des projections axonales d’explants rétiniens a été mesurée. L’effet de ces ligands des récepteurs GPR91 et GPR99 sur le guidage axonal a également été évalué en temps réel à l’aide d’un gradient créé par un micro injecteur placé à 45° et à 100µm du cône de croissance. La distribution in vivo des récepteurs GPR91 et GPR99 sur la rétine a été étudié à l’aide d’expériences d’immunohistochimie. Les résultats obtenus indiquent que l’ajout de 100µM de succinate produit une augmentation de la taille des cônes de croissance et du nombre de filopodes présents à leur surface. Il augmente également la croissance des axones. Ce type de réponse fut également observé lorsque les cellules furent soumises à 200µM d’α-cétoglutarate. Fait à noter, les deux récepteurs n’ont pas d’impact sur le guidage axonal. Ces résultats indiquent donc que les agonistes des récepteurs GPR91 et GPR99 augmentent la croissance des cellules ganglionnaires lorsqu’ils sont présents lors du développement. Par contre, ils n’ont pas d’influence sur la direction prise par les cônes de croissance. Ces nouvelles données sont un pas de plus dans la compréhension des mécanismes qui gèrent et participent au développement et la croissance des CGRs, ce qui pourrait donner de nouvelles cibles thérapeutique pouvant mener à la régénération de nerfs optiques endommagés.