Les effets de la distance physique sur les processus attentionnels sont dépendants de la similarité distracteur-cible : étude à partir des potentiels reliés aux évènements

L’attention visuelle est un processus cognitif qui priorise le traitement de l’information visuelle d’une région particulière du champ visuel. En électroencéphalographie, la méthode des potentiels reliés aux évènements permet l’extraction de composantes associées à divers processus cognitifs. La N2pc, une composante latéralisée caractérisée par une déflexion négative entre 180 et 300 ms post-stimulus du côté controlatéral à l’hémichamp dans lequel l’attention est déployée, reflète les processus impliqués dans le déploiement de l’attention visuo-spatiale. De nombreuses études antérieures ont soulevé plusieurs facteurs pouvant moduler cette composante, provenant d’autant de processus de bas niveau que de processus de haut niveau. Cette présente étude comporte une série d’expériences qui approfondit les connaissances sur le rôle de l’attention sur le traitement et la représentation des items dans les champs récepteurs des aires extrastriées du cortex visuel. Ces études démontrent ainsi que l’attention peut effectivement éliminer l’influence d’un distracteur dissimilaire à la cible lorsque celui-ci se retrouve dans le même champ visuel que l’item auquel l’attention est attribuée. Cependant, lorsque l’item est similaire à la cible, son influence ne peut être éliminée. De plus, cette présente étude identifie le rôle des filtres précoces et tardifs de haut niveau sur la sélection attentionnelle.

Role of EFNBs and EphB4 in T cell development and function

Eph kinases are the largest family of cell surface receptor tyrosine kinases. The ligands of Ephs, ephrins (EFNs), are also cell surface molecules. Ephs interact with EFNs and the receptors and ligands transmit signals in both directions, i.e., from Ephs to EFNs and from EFNs to Ephs. Ephs and EFNs are widely involved in various developmental, physiological pathophysiological processes. Our group and others have reported the roles of Ephs/EFNs in the immune system. To further investigate the function of EphBs/EFNBs in T cell development and responses, we generated EFNB1, EFNB2, EphB4 conditional gene knockout (KO) mice and EFNB1/2 double KO mice. In the projects using EFNB1 and EFNB2 knockout mice, we specifically deleted EFNB1 or EFNB2 in T cells. The mice had normal size and cellularity of the thymus and spleen as well as normal T cell subpopulations in these organs. The bone marrow progenitors from KO mice and WT mice repopulated the host lymphoid organs to similar extents. The activation and proliferation of KO T cells was comparable to that of control mice. Naïve KO CD4 cells differentiated into Th1, Th2, Th17 and Treg cells similar to naïve control CD4 cells. In EFNB2 KO mice, we observed a significant relative increase of CD4CD8 double negative thymocytes in the thymus. Flowcytometry analysis revealed that there was a moderate increase in the DN3 subpopulation in the thymus. This suggests that EFNB2 is involved in thymocyte development. Our results indicate that the functions of EFNB1 and EFNB2 in the T cell compartment could be compensated by each other or by other members of the EFN family, and that such redundancy safeguards the pivotal roles of EFNB1 and EFNB2 in T cell development and function. In the project using EFNB1/B2 double knockout (dKO) model, we revealed a novel regulatory function of EFNb1 and EFNb2 in stabilizing IL-7Rα expression on the T cell surface. IL-7 plays important roles in thymocyte development, T cell homeostasis and survival. IL-7Rα undergoes internalization upon IL-7 binding. In the dKO mice, we observed reduced IL-7Rα expression in thymocytes and T cells. Moreover, the IL-7Rα internalization was accelerated in dKO CD4 cells upon IL-7 stimulation. In T cell lymphoma cell line, EL4, over-expression of either EFNB1 or EFNB2 retarded the internalization of IL-7Rα. We further demonstrated compromised IL-7 signaling and homeostatic proliferation of dKO T cells. Mechanism study using fluorescence resonance energy transfer and immunoprecipitation demonstrated that physical interaction of EFNB1 and EFNB2 with IL-7Rα was likely responsible for the retarded IL-7Rα internalization. In the last project, using medullary thymic epithelial cell (mTEC)-specific EphB4 knockout mice, we investigated T cell development and function after EphB4 deletion in mTEC. EphB4 KO mice demonstrated normal thymic weight and cellularity. T cell development and function were not influenced by the EphB4 deletion. Lastly, the KO mice developed normal delayed type hypersensitivity. Overall, our results suggest that comprehensive cross interaction between Eph and EFN family members could compensate function of a given deleted member in the T cell development, and only simultaneous deletion of multiple EFNBs will reveal their true function in the immune system. In fact, such redundancy signifies vital roles of Ephs and EFNs in the immune system.

Le rôle du CD40 homodimère dans la réponse immunitaire

Le CD40 est une glycoprotéine transmembranaire de type I, appartenant à la famille des TNFRs, exprimée à la surface des cellules immunitaires, hématopoïétiques, vasculaires, épithéliales, et d’autres types de cellules, y compris les cellules tumorales. Le CD40 ne possédant pas de domaine kinase, pour induire un signal il interagit directement ou indirectement avec des protéines adaptatrices telles que les TRAFs et les JAKs. L’interaction du CD40 avec son principal ligand, le CD154, joue un rôle primordial dans la régulation de la réponse immunitaire et le maintien de l’homéostasie. L’activation du CD40 à la surface des cellules B augmente leur capacité de présentation d’antigène, en plus d’induire la prolifération, la commutation isotypique et l’apoptose. Les patients souffrant de mutations au niveau du gène codant pour le CD40 ou de son ligand sont immunosupprimés et sensibles à des infections opportunistes. Des études ont montré que le CD40 comme d’autres membres de la famille des TNFRs est capable de former des homodimères. Plus récemment, on a montré que la formation du CD40 homodimère est le résultat de son engagement sur les cellules B. En plus, cette homodimérisation du CD40 est importante pour la phosphorylation de l’Akt. L’interaction CD40/CD154 peut avoir un rôle direct dans l’immunothérapie par l’induction de l’apoptose de certaines cellules cancéreuses ou un rôle indirect en activant les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) afin d'augmenter l’efficacité de l’activation des cellules T cytotoxiques. Nos résultats montrent que l’induction de la mort cellulaire par le CD40 requiert la perméabilisation du lysosome, la libération de la cathepsine B, la présence de ROS et une interaction avec le TRAF6, cette mort cellulaire programmée est plus importante en présence de la forme monomérique du CD40, muté au niveau de la cystéine 238. Par ailleurs, l’homodimérisation du CD40 requerrait sa translocation vers les radeaux lipidiques et nécessiterait la présence des ROS. Cette homodimérisation du CD40 semble être importante pour l’activation des cellules B par le biais de l’induction de l’expression du CD23, CD69 et CD80. De plus, nos résultats montrent pour la première fois une implication du CD40 homodimère dans l’induction du CD23 par le biais du TLR4. Nos résultats soulignent l’importance du CD40 homodimère dans certaines voies de signalisation. Ainsi, ils mettent en évidence le rôle de la Cys-238 dans la coopération entre des récepteurs de la réponse immunitaire innée et adaptative. Toutes ces données permettraient une meilleure compréhension de certaines voies de signalisation impliquées dans plusieurs maladies auto-immunes et faisant objet de plusieurs essais thérapeutiques.

Caractérisation pharmacologique et moléculaire des dyskinésies tardives chez un modèle de primate non humain

Les dyskinésies tardives (DT) sont des troubles moteurs associés à l’utilisation chronique des antagonistes des récepteurs dopaminergiques D2 tels que les antipsychotiques et le métoclopramide. Ces dyskinésies correspondent à une incoordination motrice portant préférentiellement sur la musculature oro-faciale. La gestion des DT s'est imposée comme défi de santé publique surtout en l’absence d’une alternative thérapeutique efficace et abordable. L’hypothèse classiquement avancée pour expliquer la physiopathologie des DT inhérente au traitement par les antipsychotiques s’articule autour de l’hypersensibilité des récepteurs dopaminergiques D2, cibles principales de ces molécules. Néanmoins, plusieurs données remettent la véracité de cette hypothèse en question. Hypothèse: nous proposons que le blocage chronique des récepteurs dopaminergiques soit effectivement responsable d’un phénomène d’hypersensibilisation mais contrairement à l’hypothèse classique, cette hypersensibilisation porterait sur des paramètres de la transmission dopaminergique autres que les récepteurs D2. De même nous postulons que cette hypersensibilisation se traduirait par des altérations des cascades signalétiques au niveau des cellules du striatum. Ces altérations aboutissent à des changements portant sur le récepteur nucléaire (Nur77), qui est hautement associé au système dopaminergique; l’induction de ces récepteurs déclencherait des cascades associées à la compensation ou à la genèse des DT. Matériels et méthodes: 23 femelles Cebus apella, réparties en 3 groupes: groupe halopéridol, groupe clozapine, et groupe contrôle, ont été exposées aux traitements respectifs pendant 6-36 mois. Après l’analyse comportementale, les animaux ont été décapités et leurs cerveaux isolés pour fin d’analyse. Hybridation in situ: nous avons fait appel à cette technique pour mesurer l’expression de l’ARNm de Nur77 et du neuropeptide enképhaline. Hybridation in situ double: nous avons exploités cette technique pour identifier les populations neuronales exprimant les récepteurs dopaminergiques D3 et localiser leur éventuelle induction. Autoradiographies des récepteurs dopaminergiques D1, D2 et D3 et autoradiographies des récepteurs i glutamatergiques mGluR5. Ces autoradiographies avaient pour objectif d’évaluer l’expression de ces différents récepteurs. Mutagenèse dirigée et transfection cellulaire: nous faisons appel à ces techniques pour reproduire le polymorphisme identifié au niveau de la région 3’UTR de l’ARNm Nur77 et évaluer l’impact que pourrait avoir ce polymorphisme sur la stabilité de l’ARNm Nur77 sinon sur l’expression de la protèine Nur77. Western Blot des kinases ERK 1 et 2: cette technique nous a servi comme moyen pour quantifier l’expression globale de ces kinases. Analyses statistiques: l’expression de l’ARNm Nur77 a été évaluée en utilisant l’analyse de la variance à un seul facteur (One way ANOVA). Nous avons procédé de la même façon pour mesurer l’expression des récepteurs D2, D3 et mGluR5. Résultats: le groupe des animaux traités par l’halopéridol montre une plus forte expression des récepteurs D3 par rapport aux sujets des autres groupes. Cette expression se produit au niveau des neurones de la voie directe. De plus, cette augmentation corrèle positivement avec la sévérité des DT. L’expression des récepteurs D2 et mGluR5 reste relativement inchangée entre les différents groupes, alors qu’un gradient d’expression a été observé pour le récepteur D1. Par ailleurs, Nur77 est induit par l’halopéridol, alors que son expression semble baisser chez les animaux traités par la clozapine. L’induction de l’expression de Nur77 par l’halopéridol est plus accrue chez les animaux non dyskinétiques. Les animaux traités par la clozapine démontrent une expression amoindrie de l’ARNm de Nur77 qui tend à être plus faible que l’expression de base. D’autre part, la présence du polymorphisme au niveau de la région 3’UTR semble affecter l’expression cellulaire de Nur77. Conclusion: ces résultats confortent notre hypothèse concernant l’existence d’un phénomène d’hypersensibilisation prenant place suite un traitement chronique par les antipsychotiques. Ce phénomène s’est traduit par une augmentation de l’expression des récepteurs D3 sans porter sur les récepteurs D2 tel que prôné classiquement. Cette hypersensibilisation des récepteurs D3 implique également l’existence d’un débalancement des voies striatales pouvant ainsi sous tendre l’apparition des DT. Ces résultats dévoilent ainsi un nouveau mécanisme qui pourrait contribuer à l’apparition des DT et pourraient permettre une meilleure gestion, nous l’espérons, des DT à l’échelle clinique.

Rôle de la ghréline dans la régulation du coactivateur transcriptionnel PGC-1alpha

L’adaptation de l’organisme à son environnement est essentielle à sa survie. L’homéostasie énergétique permet l’équilibre entre les apports, les dépenses et le stockage d’énergie. Un surplus calorique important dérègle ce processus et mène au développement du syndrome métabolique caractérisé, entre autres, par une obésité, un diabète de type II, des maladies cardiovasculaires et des dyslipidémies. La ghréline participe au maintien de l’équilibre énergétique durant le jeûne en stimulant la production de glucose par le foie et le stockage lipidique dans le tissu adipeux. Le coactivateur transcriptionnel PGC-1alpha, surexprimé en situation de jeûne, est impliqué dans l’induction de la production de glucose par le foie et l’oxydation des acides gras. Notre hypothèse est que ces deux acteurs clés du métabolisme énergétique constituent un axe de régulation commun. Dans cette étude, nous montrons que la ghréline participe à la régulation de PGC-1alpha. Son récepteur GHS-R1a, possédant une forte activité constitutive, est également impliqué de façon indépendante au ligand. GHS-R1a réduit l’activité transcriptionnelle de PGC-1alpha tandis que l’ajout du ligand inverse modérément cette action. L’effet de GHS-R1a corrèle avec l’acétylation de PGC-1alpha qui est fortement augmentée de façon dose-dépendante. La stabilité de PGC-1alpha est également augmentée par le GHS-R1a indépendamment de l’ubiquitine. La ghréline diminue la capacité de PGC-1alpha à lier PPARbeta, un récepteur nucléaire partenaire de PGC-1alpha. De plus, la ghréline réduit, de façon ligand-dépendante, la capacité de coactivation de PGC-1alpha sur PPARbeta dans les hépatocytes. L’ensemble de ces résultats identifie PGC-1alpha comme cible du signal de la ghréline et suggère un axe de régulation ghréline/PGC-1alpha/PPARbeta.Une meilleure compréhension de cet axe de régulation va permettre la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques pour faire face aux pathologies associées au syndrome métabolique.

Differential regulation of early response genes by fibroblast growth factor (FGF) 8 and FGF18 in bovine granulosa cells in vitro

Les « Facteurs de croissance des fibroblastes» (FGF) agissent comme des régulateurs locaux sur la qualité des follicules et sont connus pour promouvoir la prolifération des cellules de granulosa, réduire l’apoptose et la stéroïdogenèse. Parmi la sous-famille FGF8, FGF18 est une exception puisqu’il semblerait avoir une fonction pro-apoptotique alors que FGF8 n’a pas été jusqu’à présent rapporté comme altérant la viabilité des cellules de la granulosa. Ces deux ligands ont un mode d’activation similaire et il pourrait être proposé que toute la sous-famille FGF8 ait la même réponse. L’objectif de cette étude était de déterminer si FGF8 et FGF18 activaient la même réponse précoce de gènes dans des cultures de granulosa bovine. Pour répondre à cette question, nous avons cultivé des cellules de la granulosa dans du milieu de culture sans sérum pendant 5 jours. Le jour 5, les cellules ont été traitées avec FGF8 ou FGF18. Nous avons eu recours à une approche de « puce à ADN » afin d’identifier la réponse précoce de gènes induite par FGF8 et FGF18, et les données ont été confirmées par des PCRs en temps réel lors d’une expérience in vitro où les cellules de granulosa ont été traitées avec FGF8 et FGF18 pendant différents temps. L’analyse du puce à ADN a identifié 12 gènes surexprimés par FGF8, incluant SPRY2, NR4A1, XIRP1, BAMBI, EGR1, FOS et FOSL1. A l’inverse, FGF18 n’a régulé aucun gène de manière significative. Les analyses de PCR ont confirmé l’augmentation d’ARNm codant pour EGR1, EGR3, FOS, XIRP1, FOSL1, SPRY2, NR4A1 et BAMBI après 2 h de traitement. FGF18 a entrainé seulement une augmentation de l’expression de EGR1 après 2 h de traitement parmi tous les gènes testés. Ces résultats démontrent donc que FGF8 et FGF18, malgré leur similarité dans le mode d’activation de leurs récepteurs, agissent sur les cellules de la granulosa via différentes voies de signalisation. FGF8 et FGF18, sont donc tous les deux capables de stimuler l’expression de EGR1, mais les voies de signalisation induites par la suite divergent.

Étude des tachykinines et de leurs dérivés peptidiques associés à la douleur neuropathique grâce à l’utilisation de modèles animaux et de la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse

Thèse réalisée en co-tutelle avec l'Université Claude Bernard de Lyon 1, en France.

Carence en œstrogènes et bases moléculaires du métabolisme des triglycérides et du cholestérol dans le foie et l'intestin : effet de l'exercice physique

La stéatose hépatique et la détérioration du profil lipidique plasmatique sont des pathologies métaboliques favorisées par la carence œstrogénique post-ménopausique. Cependant les mécanismes à la base de ces pathologies n’ont été que très peu étudiés. Le but de cette thèse a été d’investiguer les mécanismes moléculaires possibles à l’origine de l’hypercholestérolémie et de l’accumulation des lipides (triglycérides : TG et cholestérol) dans le foie en utilisant un modèle animal de la ménopause, la rate Sprague Dawley ovariectomisée (Ovx). Nous avons également examiné si le changement des habitudes de vie comme la pratique de l’exercice physique pouvait prévenir ou corriger les modifications induites par l’Ovx. Enfin, rosuvastatine (statine) a été utilisée comme thérapie pharmacologique de l’hypercholestérolémie dans le but de comprendre son effet au niveau moléculaire chez la rate Ovx. L’objectif de la première étude était de déterminer comment l’Ovx peut affecter les niveaux de TG et de cholestérol dans le foie des rates nourries avec une diète riche en lipides (HF : 42% gras). Les rates ont été soumises à la diète HF ou normale pendant 6 semaines avant d’être Ovx ou Sham (ovariectomie simulée), puis maintenues aux mêmes conditions diététiques pour 6 autres semaines. L’Ovx a provoqué une accumulation de TG dans le foie, mais pas la diète HF seule. Cependant, lorsque l’Ovx était combinée à la diète HF, l’accumulation des TG était beaucoup plus importante comparé à ce qui était observé chez les rates Ovx soumises à la diète normale. L’expression génique (ARNm) de CPT1 (Carnitine palmitoyltransferase 1), PGC1α (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1) et PPARα (Peroxysome proliferetor activated receptor alpha) intervenant dans l’oxydation des acides gras dans le foie était augmentée par la diète HF (p ˂ 0.001; p ˂ 0.01; p ˂ 0.05 respectivement) ; mais atténuée (p ˂ 0.05; p ˂ 0.05; p ˂ 0.07 respectivement) lorsque les rates ont été Ovx, favorisant ainsi l’accumulation des TG dans le foie. La combinaison de la diète HF à l’Ovx a également provoqué une hypercholestérolémie et une accumulation de cholestérol dans le foie malgré la diminution de l’expression de la HMGCoA-r (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase), enzyme clé de la synthèse du cholestérol. Ceci était associé à l’inhibition de l’expression génique de CYP7a1 (Cytochrome P450, family 7, subfamily a, polypeptide 1), suggérant une diminution de la synthèse des acides biliaires. Ayant constaté dans la première étude que l’Ovx élevait les niveaux de cholestérol hépatique et plasmatique, nous nous sommes fixés comme objectif dans la deuxième étude d’évaluer les effets de l’Ovx sur l’expression génique des transporteurs et enzymes responsables du métabolisme du cholestérol et des acides biliaires dans le foie et l’intestin, et de vérifier si l’exercice sur tapis roulant pouvait prévenir ou corriger les changements causés par l’Ovx. L’hypercholestérolémie constatée chez les rates Ovx comparativement aux Sham était accompagnée de la diminution de l’expression génique des récepteurs des LDL (R-LDL), des résidus de lipoprotéines (LRP1), de SREBP-2 (Sterol regulatory element binding protein 2) et de PCSK9 (Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) dans le foie, suggérant une défaillance dans la clairance des lipoprotéines plasmatiques. L’Ovx a aussi inhibé l’expression génique de la MTP (Microsomal triglyceride transfer protein) et stimulé celle de SR-B1 (Scavenger receptor class B, member 1); mais aucun changement n’a été observé avec CYP7a1. Ces changements moléculaires pourraient par conséquent favoriser l’accumulation de cholestérol dans le foie. L’exercice physique n’a pas corrigé les modifications causées par l’Ovx sur l’expression génique de ces molécules au niveau hépatique à l’exception de SREBP-2. Par contre, au niveau intestinal (iléum), l’exercice sur tapis roulant a inhibé l’expression génique des marqueurs moléculaires intervenant dans l’absorption des acides biliaires (OSTα/β, FXR, RXRα, Fgf15) et du cholestérol (LXRα, NCP1L1) au niveau de l’iléum chez les rates Sham entraînées. Ces adaptations pourraient prévenir le développement de l’hypercholestérolémie protégeant en partie contre la survenue de l’athérosclérose. Au vue des effets délétères (hypercholestérolémie et diminution de l’expression du R-LDL, PCSK9, LRP1, SREBP-2 et HMGCOA-r dans le foie) causés par l’Ovx sur le métabolisme du cholestérol constatés dans l’étude 2, la 3ième étude a été conçue pour évaluer l’efficacité de rosuvastatine (Ros) sur l’expression génique de ces marqueurs moléculaires chez les rates Ovx sédentaires ou soumises à l’entraînement volontaire. Ros a été administrée aux rates Ovx pendant 21 jours par voie sous-cutanée à la dose de 5mg/kg/j à partir de la 9ième semaine après l’Ovx. Ros n’a pas diminué la concentration plasmatique de LDL-C et de TC chez les rates Ovx. Par contre, Ros a stimulé (P ˂ 0.05) l’expression génique de PCSK9, SREBP-2, LRP1, HMGCoA-r et ACAT2 (Acyl-CoA cholesterol acyltransferase) mais pas significativement (P = 0.3) celle du R-LDL dans le foie des rates Ovx sédentaires et entraînées. Ros n’a pas réduit la concentration plasmatique de LDL-C probablement à cause de l’induction plus importante de PCSK9 par rapport au R-LDL. Cependant, la stimulation de LRP1 par Ros protège partiellement contre la survenue des maladies cardiovasculaires. En conclusion, les études de cette thèse indiquent que la baisse du niveau des œstrogènes entraîne des changements radicaux du métabolisme hépatique des TG et du cholestérol provoqués par des altérations de l’expression des gènes clés des voies métaboliques associées.

Les mécanismes de régulation du métabolisme lipidique par les peptides QRFP (pyroglutamylated RF-amide peptides)

Plusieurs cibles thérapeutiques dans le développement de médicaments contre l’obésité visent une diminution de l’appétit et de la masse adipeuse et à augmenter la dépense énergétique. L’appétit et le métabolisme énergétique sont régulés par certains neuropeptides qui agissent au niveau du système nerveux central, notamment dans l’hypothalamus. Parmi ces neuropeptides, les peptides RF-amide ou QRFP (pyroglutamylated RF-amide peptides), ainsi nommés par la présence du motif conservé Arg-Phe-NH2 dans le domaine C-terminal, induisent une hyperphagie et une augmentation de la masse adipeuse lorsqu’administrés par voie centrale. Les formes bioactives de ces peptides comprennent principalement 43 (QRFP-43) et 26 (QRFP-26) acides aminés. Outre les peptides QRFP, leurs récepteurs, les GPR103 de la famille des récepteurs à 7 passages transmembranaires couplés aux protéines G, sont exprimés dans l’hypothalamus. Plus récemment, des études ont montré la sécrétion de ces neuropeptides, et la présence du GPR103, dans le tissu adipeux. Cependant, le rôle de la voie signalétique (QRFP/GPR103) dans la régulation du métabolisme lipidique au niveau périphérique est peu connu. Les travaux de cette thèse ont porté sur la caractérisation des effets adipogéniques périphériques des neuropeptides QRFP. En premier lieu, nos travaux ont montré que les adipocytes 3T3-L1 et les adipocytes murins isolés des dépôts adipeux blancs expriment le prépro-QRFP et uniquement le récepteur GPR103B, un des deux sous-types de récepteurs présents chez la souris. De plus, nous avons montré que l’expression du récepteur est régulée par une diète riche en lipides réduisant l’expression du prépro-QRFP, mais augmentant celle du GPR103B dans les dépôts lipidiques. Chez l’humain, les adipocytes de l’omentum expriment autant le GPR103 que le prépro-QRFP. Nous avons de plus étudié la fonctionnalité du GPR103B dans les adipocytes 3T3-L1 par l’utilisation d’ARN interférents. Nous avons observé que ce récepteur médie les effets adipogéniques des QRFPs en augmentant l’expression du récepteur nucléaire PPAR-gamma (peroxisome proliferator-activated receptor gamma) et le facteur de transcription C/EBP-alpha (CCAAT-enhancer binding protein alpha) résultant en une accumulation des triglycérides. Nous avons aussi mis en évidence les effets anti-lipolytiques des QRFPs. En effet, les QRFP inhibent fortement la lipolyse induite avec l’isoprotérénol. L’étude des mécanismes moléculaires à l’origine des effets anti-lipolytiques du QRFP-43 a montré l’activation de la voie de signalisation PI3-K/PKB (phosphatidylinositol 3-kinase/protéine kinase B) en réponse à la stimulation du GPR103B. La réponse anti-lipolytique induite par le QRFP-43 est associée à une diminution de la phosphorylation de la périlipine A (PLIN1a) et de la lipase hormono-sensible (HSL). Nos études ont élucidé les mécanismes conduisant à l’inhibition de la phosphorylation de la PLIN1a en réponse à l’activation du GPR103B, impliquant l’inhibition de la migration de la cavéoline 1 et de la sous unité catalytique de la protéine kinase A (PKA) au niveau des gouttelettes lipidiques, ainsi que l’inhibition de l’activité des Src kinases et de la protéine kinase C (PKC). En conclusion, nos travaux ont montré que les QRFP-43 et -26 exercent un effet adipogénique et anti-lipolytique dans les adipocytes, mettant ainsi en évidence le rôle des neuropeptides QRFPs dans la régulation du métabolisme lipidique au niveau adipocytaire.

Profilage Moléculaire de la Scoliose Idiopathique de l’Adolescent

La scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est la déformation la plus fréquente en orthopédie pédiatrique. C'est une maladie qui génère des déformations complexes du rachis, du thorax et du bassin affectant plus sévèrement et majoritairement les filles à la puberté. Malgré de nombreuses années de recherches approfondies dans le domaine de la SIA, la cause n'a toujours pas été résolue. OBJECTIFS : Il a été démontré qu’il existe une dysfonction de la signalisation de la mélatonine par les protéines G inhibitrices (Gi) dans les ostéoblastes isolés de patients atteints de SIA. Ceci a conduit à une stratification des patients en trois groupes fonctionnels. Le but de ce projet de maîtrise est d’établir les profils d’expression moléculaire correspondant à chacun des groupes fonctionnels. Les objectifs spécifiques sont d’identifier les gènes responsables de l’initiation de la SIA et du défaut différentiel observé dans la signalisation des récepteurs couplés aux protéines Gi. MÉTHODES : Des ARNs ont été préparés à partir d’ostéoblastes isolés de patients atteints de SIA sélectionnés pour chaque groupe fonctionnel et comparés aux ARNs obtenus d’ostéoblastes de sujets sains. En plus, des cellules sanguines (PBMCs) isolées d’une paire de jumelles monozygotes discordantes pour la scoliose ont été étudiées pour comparer leur profil d’expression génétique. Nous avons utilisé des biopuces à ADN contenant un ensemble de 54,000 sondes permettant l’analyse du niveau d’expression de plus de 47,000 transcrits représentant 30,000 gènes humains bien caractérisés (Affymetrix, GeneChip® Human gene 1.0 ST array). Les gènes retenus ont par la suite été validés par qPCR sur un plus grand nombre de patients afin de tester la spécificité des profils d’expression pour chaque groupe de patients à partir des cellules osseuses dérivées lors de la chirurgie. RÉSULTATS: Le profilage moléculaire proposé permettra d’établir les fondements moléculaires de la SIA selon le test fonctionnel développé par le Dr Moreau et son équipe et d’identifier de nouveaux gènes associés à la SIA. Ce projet a permis de mettre en évidence des gènes possiblement impliqués dans le défaut de signalisation associé aux protéines Gi communs aux trois groupes, ainsi que des gènes spécifiques à certains groupes, pouvant contribuer au développement de certaines co-morbidités et/ou au risque d’aggravation des déformations rachidiennes. L’étude préliminaire des jumelles monozygotes discordantes pour la scoliose a mis en évidence un nombre limité de gènes possiblement associés au défaut de signalisation observé chez la jumelle scoliotique, gènes dont l’expression pourrait être influencée par des modifications d’ordre épigénétique liées à l’environnement. CONCLUSION: Les données obtenues par des approches de transcriptomiques dans le cadre de ce projet soutiennent notre méthode de stratification fonctionnelle des patients SIA et ont conduit à l’identification de nouveaux gènes associés à la SIA. Ces résultats jettent un éclairage nouveau sur la SIA et contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes et facteurs impliqués dans l’étiologie de la SIA. À cet égard, nos résultats permettront éventuellement d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles et des traitements personnalisés compte tenu des profils moléculaires distincts observés pour chaque groupe de patients.

Mécanismes de régulation du trafic et de l’activité du récepteur GABAB

L’acide γ-aminobutyrique (GABA) est le principal neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central et est impliqué dans diverses pathologies incluant l’épilepsie, l’anxiété, la dépression et la dépendance aux drogues. Le GABA agit sur l’activité neuronale par l’activation de deux types de récepteurs; le canal chlorique pentamérique GABAA et l’hétérodimère obligatoire de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) GABAB. Chacun des récepteurs est responsable de phases distinctes de la réponse cellulaire au GABA. Lors d’une stimulation par le GABA, il est essentiel pour la cellule de pouvoir contrôler le niveau d’activité des récepteurs et au besoin, de limiter leur activation par des mécanismes de désensibilisation et de régulation négative. La désensibilisation nécessite le découplage du récepteur de ses effecteurs, ainsi que sa compartimentation hors de la membrane plasmique dans le but de diminuer la réponse cellulaire à l’agoniste. Les mécanismes de contrôle de l’activité de GABAB semblent anormaux pour un RCPG et sont encore mal moléculairement caractérisés. L’objet de cette thèse est d’étudier la régulation du récepteur GABAB et de sa signalisation par la caractérisation de nouvelles protéines d’interactions étant impliquées dans la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation du récepteur. Une première étude nous a permis d’identifier la protéine NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor) comme interagissant avec le récepteur hétérodimérique. Nous avons caractérisé le site d’interaction au niveau du domaine coiled-coil de chacune des deux sous-unités de GABAB et constaté la dépendance de cette interaction au statut de l’activité ATPasique de NSF. Nous avons observé que cette interaction pouvait être dissociée par l’activation de GABAB, induisant la phosphorylation du récepteur par la protéine kinase C (PKC) parallèlement à la désensibilisation du récepteur. L’activation de PKC par le récepteur est dépendante de l’interaction NSF-GABAB, ce qui suggère une boucle de rétroaction entre NSF et PKC. Nous proposons donc un modèle où, à l’état basal, le récepteur interagit avec NSF, lui permettant d’activer PKC en réponse à la stimulation par un agoniste, et où cette activation permet à PKC de phosphoryler le récepteur, induisant sa dissociation de NSF et sa désensibilisation. Nous avons par la suite étudié la dégradation et l’ubiquitination constitutive de GABAB et la régulation de celles-ci par PKC et l’enzyme de déubiquitination USP14 (ubiquitin-specific protease 14). Au niveau basal, le récepteur est ubiquitiné, et présente une internalisation et une dégradation rapide. L’activation de PKC augmente l’ubiquitination à la surface cellulaire et l’internalisation, et accélère la dégradation du récepteur. USP14 est en mesure de déubiquitiner le récepteur suite à l’internalisation, mais accélère aussi la dégradation par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique. Nos résultats suggèrent un mécanisme où l’ubiquitination promeut l’internalisation et où USP14 cible le récepteur ubiquitiné vers un processus de dégradation lysosomale. La troisième étude porte sur la régulation de la densité de récepteurs à la membrane plasmique par la protéine Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2). Nous avons déterminé que Grb2 interagit avec GABAB1 au niveau de la séquence PEST (riche en proline, glutamate, sérine et thréonine) du domaine carboxyl-terminal, et que cette interaction module l’expression à la surface du récepteur hétérodimérique en diminuant l’internalisation constitutive par un mécanisme encore inconnu. Cette inhibition de l’internalisation pourrait provenir d’une compétition pour le site de liaison de Grb2 à GABAB1, ce site étant dans une région interagissant avec plusieurs protéines impliquées dans le trafic du récepteur, tels le complexe COPI et la sous-unité γ2S du récepteur GABAA (1, 2). En proposant de nouveaux mécanismes moléculaires contrôlant l’activité et l’expression à la membrane du récepteur GABAB par les protéines NSF, PKC, USP14 et Grb2, les études présentées dans cette thèse permettent de mieux comprendre les processus d’internalisation et de dégradation, ainsi que du contrôle de l’activité de GABAB par la désensibilisation, ouvrant la porte à une meilleure compréhension de la signalisation GABAergique.

Caractérisation des processus moléculaires impliqués dans l’activation de la protéine IKKbeta par l'angiotensine II et son rôle dans la réponse phénotypique des CMLV.

Le système rénine-angiotensine-aldostérone (SRAA) régule l’homéostasie de la contraction des artères. Or, suivant la liaison de l’angiotensine II (Ang II) à son récepteur AT1, le SRAA est également impliqué dans l’activation de voies de signalisation à l’origine de l’inflammation et de l’hypertrophie des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV), soit deux processus participant au remodelage vasculaire caractéristique de diverses maladies cardiovasculaires, telles l’hypertension et l’athérosclérose. Ces pathologies sont les premières causes de mortalité naturelle en Amérique et les traitements les ciblant ne sont pas optimaux puisqu’ils visent seulement quelques facteurs de risque qui leur sont associés. Ainsi, la détermination des effecteurs intracellulaires régulant ces voies délétères est nécessaire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. L’inflammation Ang II-dépendante dans les CMLV est attribuée au facteur de transcription nuclear factor-kappa B (NF-κB). Cependant, les processus moléculaires couplant le récepteur AT1 à son activation sont peu caractérisés. L’étude abordant cette question démontre in vitro que NF-κB est activé par la protéine IκB kinase β (IKKβ) dans les CMLV exposées à l’Ang II et que cette kinase est régulée par deux voies de signalisation indépendantes, mais complémentaires afin d’assurer son activation rigoureuse et soutenue. L’une des voies est précoce et dépend des seconds messagers ainsi que de deux nouveaux effecteurs sous-jacents au récepteur AT1, soit la E3 ligase TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6) et la IKK kinase transforming growth factor-beta-activated kinase 1 (TAK1) tandis que la seconde est tardive et résulte de la signalisation mitogen-activated protein kinase kinase 1/2 (MEK1/2) - extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) - ribosomal S6 kinase (RSK). L’inhibition conjointe de ces voies abroge complètement la réponse inflammatoire, ce qui indique qu’elles en sont la seule source. Ainsi, l’inhibition d’IKKβ pourrait suffire à contrer l’inflammation impliquée dans le remodelage vasculaire associé à une suractivation du SRAA. Une découverte des plus novatrices découle de cette étude, qui veut que la E3 ligase TRAF6 est un nouvel effecteur des récepteurs couplés aux protéines G et est à l’origine de la formation d’un nouveau type de second messager, soit des chaînes libres de poly-ubiquitines. Les mécanismes moléculaires à la base de l’hypertrophie Ang II-dépendante dans les CMLV sont également peu définis. Or, suivant la parution d’un article démontrant qu’IKKβ dans les cellules cancéreuses participe aux mécanismes d’initiation de la traduction en réponse au facteur de nécrose tumorale α (TNFα) via la phosphorylation de la protéine Tuberous sclerosis 1 (TSC1) et donc l’activation du complexe mammalian target of rapamycin (mTORC1), une hypothèse a été émise selon laquelle cette kinase serait impliquée dans la synthèse protéique Ang II-dépendante dans les CMLV. Les expériences effectuées in vitro dans des CMLV exposées à l’Ang II démontrent qu’IKKβ induit la phosphorylation de TSC1 ainsi que l’activation de mTORC1 et de ses substrats S6 kinase 1 (S6K1) et translational regulators eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein (4E-BP1), deux protéines impliquées directement dans l’hypertrophie. Par ailleurs, la synthèse protéique au niveau des CMLV exposées à l’Ang II est réduite de 75% suivant la diminution de l’expression d’IKKβ et suivant la surexpression d’un mutant de TSC1 dont le site consensus d’IKKβ a été modifié, faisant de cette kinase un médiateur majeur au niveau de ce processus. Ainsi, in vitro IKKβ en réponse à l’Ang II est en amont de deux processus impliqués dans un remodelage vasculaire à l’origine de maladies cardiovasculaires. De plus, plusieurs facteurs de risque de ces pathologies convergent à l’activation d’IKKβ, ce qui en fait une cible thérapeutique particulièrement attrayante. Qui plus est, l’administration d’un inhibiteur d’IKKβ à des rats diminue non seulement la synthèse protéique dépendante de l’Ang II au niveau de l’aorte et des artères mésentériques, mais également la synthèse de la protéine pro-inflammatoire VCAM-1 par les cellules composant l’aorte, ce qui confirme son envergure en tant que cible.

Points quantiques : caractérisation et applications en sciences pharmaceutiques

L’imagerie médicale a longtemps été limitée à cause des performances médiocres des fluorophores organiques. Récemment la recherche sur les nanocristaux semi-conducteurs a grandement contribué à l’élargissement de la gamme d’applications de la luminescence dans les domaines de l’imagerie et du diagnostic. Les points quantiques (QDs) sont des nanocristaux de taille similaire aux protéines (2-10 nm) dont la longueur d’onde d’émission dépend de leur taille et de leur composition. Le fait que leur surface peut être fonctionnalisée facilement avec des biomolécules rend leur application particulièrement attrayante dans le milieu biologique. Des QDs de structure « coeur-coquille » ont été synthétisés selon nos besoins en longueur d’onde d’émission. Dans un premier article nous avons modifié la surface des QDs avec des petites molécules bi-fonctionnelles portant des groupes amines, carboxyles ou zwitterions. L’effet de la charge a été analysé sur le mode d’entrée des QDs dans deux types cellulaires. À l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques spécifiques à certains modes d’internalisation, nous avons déterminé le mode d’internalisation prédominant. L’endocytose par les radeaux lipidiques représente le mode d’entrée le plus employé pour ces QDs de tailles similaires. D’autres modes participent également, mais à des degrés moindres. Des disparités dans les modes d’entrée ont été observées selon le ligand de surface. Nous avons ensuite analysé l’effet de l’agglomération de différents QDs sur leur internalisation dans des cellules microgliales. La caractérisation des agglomérats dans le milieu de culture cellulaire a été faite par la technique de fractionnement par couplage flux-force (AF4) associé à un détecteur de diffusion de la lumière. En fonction du ligand de surface et de la présence ou non de protéines du sérum, chacun des types de QDs se sont agglomérés de façon différente. À l'aide d’inhibiteur des modes d’internalisation, nous avons corrélé les données de tailles d’agglomérats avec leur mode d’entrée cellulaire. Les cellules microgliales sont les cellules immunitaires du système nerveux central (CNS). Elles répondent aux blessures ou à la présence d’inflammagènes en relâchant des cytokines pro-inflammatoires. Une inflammation non contrôlée du CNS peut conduire à la neurodégénérescence neuronale et est souvent observée dans les cas de maladies chroniques. Nous nous sommes intéressés au développement d’un nanosenseur pour mesurer des biomarqueurs du début de l’inflammation. Les méthodes classiques pour étudier l’inflammation consistent à mesurer le niveau de protéines ou molécules relâchées par les cellules stressées (par exemple monoxyde d’azote, IL-1β). Bien que précises, ces méthodes ne mesurent qu’indirectement l’activité de la caspase-1, responsable de la libération du l’IL-1β. De plus ces méthode ne peuvent pas être utilisées avec des cellules vivantes. Nous avons construit un nanosenseur basé sur le FRET entre un QD et un fluorophore organique reliés entre eux par un peptide qui est spécifiquement clivé par la caspase-1. Pour induire l’inflammation, nous avons utilisé des molécules de lipopolysaccharides (LPS). La molécule de LPS est amphiphile. Dans l’eau le LPS forme des nanoparticules, avec des régions hydrophobes à l’intérieure. Nous avons incorporé des QDs dans ces régions ce qui nous a permis de suivre le cheminement du LPS dans les cellules microgliales. Les LPS-QDs sont internalisés spécifiquement par les récepteurs TLR-4 à la surface des microglies. Le nanosenseur s’est montré fonctionnel dans la détermination de l’activité de la caspase-1 dans cellules microgliales activées par le LPS. Éventuellement, le senseur permettrait d’observer en temps réel l’effet de thérapies ciblant l’inflammation, sur l’activité de la caspase-1.

Effets motivationnels des cannabinoïdes dans un modèle animal de la schizophrénie

Depuis quelques décennies, la consommation de cannabis et son usage thérapeutique sont le sujet de nombreux débats. Le cannabis est la drogue illicite la plus consommée au monde et cette consommation se trouve dix fois plus élevée chez les patients atteints de schizophrénie que dans la population générale. L’hypothèse d’une automédication initialement proposée afin d’expliquer la consommation élevée de cannabis chez les patients atteints de schizophrénie est maintenant remise en question. En effet, les rapports indiquant une aggravation des symptômes plutôt qu’une amélioration suite à une consommation à long terme sont de plus en plus nombreux. Sachant que le cannabis peut induire des effets soit plaisants soit aversifs, la question se pose à savoir si une prédominance de la valence motivationnelle positive ou une diminution de la valence négative du cannabis peut expliquer la consommation élevée parmi les individus ayant un diagnostic de schizophrénie? Bien qu’un grand nombre de recherches pré-cliniques aient été menées chez l’animal normal pour évaluer l’effet motivationnel du Δ9-tétrahydrocannabinol (THC) et autres cannabinoïdes synthétiques, aucune n’a abordé cette problématique dans un modèle animal de la schizophrénie. Cette lacune nous a donc amené à étudier la valence motivationnelle du THC et de l’agoniste cannabinoïde WIN55,212-2 (WIN) dans un modèle animal de la schizophrénie: la lésion néonatale de l’hippocampe ventral (NVHL). Dans le premier article, nous présentons les résultats de quatre expériences. Une première avait pour objectif de déterminer si la procédure expérimentale que nous avons utilisée permettait de reproduire des signes distinctifs du modèle animal de la schizophrénie. Par la suite, nous avons évalué i) l’effet d’une dose de WIN sur l’activité locomotrice spontanée et ii) la valence motivationnelle du THC (0.5 mg/kg, i.p) et du WIN (1 mg/kg, i.p) chez les rats adolescents (jour post-natal 28-40, PD28-40) et adultes (PD56) au moyen du paradigme de préférence de place conditionnée (PPC). Tel qu’attendu, la réponse locomotrice à l’amphétamine (0.75 et 1.5 mg/kg) chez les rats NVHL adultes était supérieure à celle des rats contrôles (test distinctif du modèle). Le THC a induit une tendance aversive chez les rats contrôles adultes. Enfin, le WIN a stimulé l’activité locomotrice et induit une aversion significative chez les rats adultes NVHL. Dans un deuxième article, nous avons évalué la valence motivationnelle du THC (0.5 mg/kg), du WIN (1 et 3 mg/kg) et l’effet de l’amphétamine au moyen du paradigme d’autostimulation électrique intracérébrale (ASI). Les résultats montrent que : i) l’effet amplificateur de l’amphétamine sur l’ASI était de plus courte durée chez les rats NVHL; ii) le THC produit une légère atténuation de la récompense chez les rats contrôles tandis que le WIN a produit une atténuation plus prononcée de la récompense chez les rats NVHL, un effet qui a été bloqué par l’antagoniste aux récepteurs CB1, le AM251 (3 mg/kg). Pour la première fois les résultats suggèrent une altération du système endocannabinoïde dans un modèle animal de la schizophrénie. Ils indiquent qu’une exposition aigüe conduit à une prédominance de la valence négative. Bien qu’en apparente contradiction avec les études cliniques, ces résultats soulignent l’importance du contexte socio-environnemental pour expliquer les effets du cannabis chez les patients. De plus ils encouragent les futures études à évaluer cette valence sur un modèle d’exposition chronique.

L’impact de l’inhibition de la iNOS et de la kininase I dans les effets délétères du récepteur B1 des kinines dans le diabète de type 2

Les kinines sont des peptides vasoactifs et des neuromédiateurs centraux impliqués dans un bon nombre de processus biologiques et inflammatoires. Elles agissent sur deux types de récepteurs (R) couplés aux protéines G, le RB2 constitutif et le RB1 qui est induit par le stress oxydatif et les cytokines pro-inflammatoires via le facteur de transcription nucléaire, le NF-kB. Le RB1 est un puissant activateur de la iNOS et il augmente son expression chez le rat insulino-résistant. Dans ce modèle de rats soumis à une diète riche en D-glucose, un traitement d’une semaine avec un antagoniste non peptidique du RB1, le SSR240612, renverse la plupart des complications diabétiques. Ces travaux nous mènent à émettre l’hypothèse que la iNOS contribue aux effets délétères du RB1 chez le rat insulino-résistant. Nous avons donc évalué les effets d’un traitement prolongé d’une semaine soit avec le 1400W (1 mg/kg x 2 fois/jour), un inhibiteur sélectif de la iNOS, ou avec le Mergetpa (1mg/kg x 2 fois/jour), un inhibiteur non sélectif de la carboxypeptidase M (CPM) qui supprime la formation d’agonistes du RB1. Ces deux traitements devraient reproduire les effets bénéfiques de l’antagoniste du RB1 (SSR240612). En effet, le 1400W et le Mergetpa corrigent l’hyperglycémie, la résistance à l’insuline (l’indice HOMA), l’allodynie au froid et l’expression de plusieurs marqueurs de l’inflammation (Cox-2, iNOS, RB1, IL-1, anion superoxyde). Ces résultats confirment la contribution de la iNOS dans les effets délétères du RB1 chez le rat insulino-résistant. Dans un autre volet, ce mémoire vise à mieux comprendre l’impact de l’inhibition du RB1 par le SSR240612 (10 μg/g/jour) combiné ou pas avec le Pioglitazone (1.6 mg/g/jour) (un anti-diabétique de la famille des thiazolidinediones, le TZD) dans un modèle de diabète de type 2 associé à l’obésité chez la souris C57BL/6J soumise à une diète riche vi en gras pendant vingt semaines. Un traitement pendant deux semaines avec le TZD corrige l’intolérance au glucose et réduit les taux plasmatiques d’insuline alors que le SSR n’a pas d’effet. Les traitements combinés du TZD avec le SSR corrigent davantage la perte de la sensibilité à l’insuline et réduisent les taux plasmatiques de leptine. Les résultats obtenus suggèrent que le SSR n’apporte pas l’effet bénéfique souhaité, dans ce modèle avancé de diabète de type 2, contrairement au modèle des rats insulino-résistants (pré-diabétiques).