Study of cox1 trans-splicing in Diplonema papillatum mitochondria

Diplonema papillatum est un organisme unicellulaire qui vit dans l’océan. Son génome mitochondrial possède une caractéristique spéciale: tous les gènes sont brisés en de multiples fragments qui s’appellent modules. Chaque module est codé par un chromosome différent. L’expression d’un gène exige des épissages-en-trans qui assemblent un ARN messager complet à partir de tous les modules du gène. Nous avons précédemment montré que le gène cox1 est encodé dans neuf modules avec six Us non encodés entre le module 4 et le module 5 de l’ARN messager mature [1]. Nous n’avons identifié aucune séquence consensus connue de site d’épissage près des modules. Nous spéculons qu’un ARN guide (gRNA) a dirigé l’épissage-en-trans du gène cox1 par un mécanisme qui est semblable à l’édition d’ARN par l’insertion/la suppression des Us chez les kinétoplastides, le groupe sœur des diplonémides. Nous avons trouvé que les six Us sont ajoutés au bout 3’ de l’ARN d’une façon semblable à ceux ajoutés par le TUTase lors de l’édition de l’insertion des Us chez les kinétoplastides. Nous avons construit des profils de gRNA de l’épissage-en-trans avec les expressions régulières basé sur notre connaissance des gRNAs dans l’édition d’ARN chez les kinétoplastides. Selon la complémentarité partielle entre le gRNA et les deux modules adjacents, nous avons généré des amorces pour RT-PCR visant à détecter des séquences qui sont assorties à un des profils de gRNA. Une expérience pilote in vitro n’a pas permis de reconstituer l’épissage-en-trans des modules 3, 4, et 5, suggérant que nous devons améliorer nos techniques.

Biogénèse des lipoprotéines de haute densité (HDL): implication du transporteur ABCA1

Les patients atteints de la maladie de Tangier présentent des niveaux très bas de lipoprotéines de haute densité (HDL), un facteur de risque pour le développement des maladies cardiovasculaires. In vivo, les HDL ont un effet protecteur important contre l’athérosclérose puisqu’elles effectuèrent le transport à rebours du cholestérol des tissus périphériques vers le foie. Or, la maladie de Tangier est causée par des mutations dans le gène du transporteur « ATP-binding cassette A1 » (ABCA1). Le modèle actuel stipule que ce transporteur assure la lipidation de l’apolipoprotéine A-I (apoA-I), la composante protéique majeure des HDL, pour former des particules HDL naissantes discoïdales. Un défaut dans la lipidation de l’apoA-I par l’ABCA1 abolit la biogénèse des HDL. Nous avons voulu étudier les sites d’interaction de l’ABCA1 avec son ligand (l’apoA-I), les voies de biogénèse impliquées, et l’implication des pré-β-HDL dans l’efflux du cholestérol par la voie de l’ABCA1. D’abord, nous avons utilisé un système de culture cellulaire (fibroblastes humaines et BHK-ABCA1-inductible) afin de déterminer les sites de liaison cellulaires de l’apoA-I, leurs localisations et l’implication de l’ABCA1. Nous avons trouvé que la majorité de l’apoA-I n’est pas associée à l’ABCA1 et, deux tiers de cet apoA-I, était à la membrane plasmique. Ensuite, Une étude plus détaillée examinait les voies de lipidation de l’apoA-I, soit au niveau de la membrane plasmique (MP), soit aux compartiments intracellulaires (CICs). Nous avons montré que la lipidation de l’apoA-I a lieu aux deux niveaux (MP et CICs) selon deux voies différentes cinétiquement. Finalement, nous avons montré que les pré-β-HDL effluent aussi (efficacement que l’apoA-I) le cholestérol par la voie de l’ABCA1. Ces observations réunies démontrent que 1) la majorité de l’apoA-I s’est trouvé non-associée à l’ABCA1; 2) deux tiers de l’apoA-I s’associent a la membrane plasmique; 3) la lipidation de l’apoA-I se fait en partie à la membrane plasmique et, par la voie de retro-endocytose du complexe apoA-I/ABCA1.

Phylogénomique des Archées

Les transferts horizontaux de gènes (THG) ont été démontrés pour jouer un rôle important dans l'évolution des procaryotes. Leur impact a été le sujet de débats intenses, ceux-ci allant même jusqu'à l'abandon de l'arbre des espèces. Selon certaines études, un signal historique dominant est présent chez les procaryotes, puisque les transmissions horizontales stables et fonctionnelles semblent beaucoup plus rares que les transmissions verticales (des dizaines contre des milliards). Cependant, l'effet cumulatif des THG est non-négligeable et peut potentiellement affecter l'inférence phylogénétique. Conséquemment, la plupart des chercheurs basent leurs inférences phylogénétiques sur un faible nombre de gènes rarement transférés, comme les protéines ribosomales. Ceux-ci n'accordent cependant pas autant d'importance au modèle d'évolution utilisé, même s'il a été démontré que celui-ci est important lorsqu'il est question de résoudre certaines divergences entre ancêtres d'espèces, comme pour les animaux par exemple. Dans ce mémoire, nous avons utilisé des simulations et analyser des jeux de données d'Archées afin d'étudier l'impact relatif des THG ainsi que l'impact des modèles d'évolution sur la précision phylogénétique. Nos simulations prouvent que (1) les THG ont un impact limité sur les phylogénies, considérant un taux de transferts réaliste et que (2) l'approche super-matrice est plus précise que l'approche super-arbre. Nous avons également observé que les modèles complexes expliquent non seulement mieux les données que les modèles standards, mais peuvent avoir un impact direct sur différents groupes phylogénétiques et sur la robustesse de l'arbre obtenu. Nos résultats contredisent une publication récente proposant que les Thaumarchaeota apparaissent à la base de l'arbre des Archées.

Stabilité de l’acide ribonucléique pour la datation des fluides corporels en biologie judiciaire

Projet de recherche réalisé en collaboration avec la section Biologie/ADN du Laboratoire de sciences judiciaires et de médecine légale (LSJML) de Montréal.

Caractérisation de nouvelles lignées cellulaires pré-chimiothérapie et post-chimiothérapie du cancer épithélial de l'ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire (CÉO) est le cancer gynécologique le plus létal. Le CÉO de type séreux, la forme la plus commune avec plus de 50% des cas, est souvent diagnostiqué tardivement et associé à un mauvais pronostic. Le CÉO avancé, surtout traité par chimiothérapie, va devenir chimiorésistant chez la majorité des patientes traitées. Bien que des lignées cellulaires du CÉO aient été dérivées à partir de tumeurs solides et d’ascites de patientes ayant ou non subi une chimiothérapie, aucune des lignées cellulaires du CÉO provenant d’une même patiente avant et après ses traitements de chimiothérapie n’ont été établies précédemment. Notre laboratoire est le premier à développer de telles lignées cellulaires. Nos nouvelles lignées cellulaires sont dérivées de trois patientes différentes (1369, 2295 et 3133) et classées selon leur provenance, soit la tumeur solide (TOV) ou l’ascite (OV). Nous avons donc caractérisé ces nouvelles lignées de cellules pré-chimiothérapie (TOV1369TR, OV2295, TOV3133D et TOV3133G) et post-chimiothérapie (OV1369(2), OV2295(2), TOV2295, OV3133 et OV3133(2)) par diverses approches. Par immunohistochimie et immunobuvardage de type Western, nous avons caractérisé les niveaux d’expression de marqueurs épithéliaux typiques de kératines (KRT7, KRT8, KRT18, KRT19, KRT20) pour confirmer l’origine épithéliale et ovarienne des cellules. Nous avons également analysé le niveau d’expression de HER2 et p53, deux marqueurs importants dans le CÉO. Cependant, il ne semble pas y avoir d’expression différentielle évidente de ces marqueurs entre les lignées pré-chimiothérapie et post-chimiothérapie. Plus encore, nous avons étudié plusieurs caractéristiques tumorigéniques des lignées cellulaires, dont la prolifération cellulaire (par compte cellulaire), la migration cellulaire (par recouvrement de plaie), la capacité à former des sphéroïdes en 3D (par la méthode des gouttelettes inversées), et la formation de tumeurs in vivo dans des souris SCID (xénogreffes sous-cutanées). En général, il ne semble pas y avoir de différences claires entre les cellules pré-chimiothérapie et post-chimiothérapie au niveau du comportement cellulaire, à l’exception du fait qu’aucune des lignées post-chimiothérapie semblent être en mesure de former des structures tridimensionnelles compactes, contrairement à certaines lignées post-chimiothérapie. Nos résultats pourront servir à mieux comprendre les différents mécanismes régissant les tumeurs malignes du CÉO de type séreux et à mieux comprendre la progression de la maladie à travers les différents traitements, ce qui nous permettra d’acquérir des informations essentielles pour mieux évaluer et traiter différentes patientes.

Caractérisation structurale et fonctionnelle des interactions impliquant TFIIH et la machinerie de réparation de l’ADN

La réparation de l’ADN par excision des nucléotides (NER) est un mécanisme capable de retirer une large variété de lésions causant une distorsion de la double hélice, comme celles causées par les rayons ultraviolets (UV). Comme toutes les voies de réparation de l’ADN, la NER contribue à la prévention de la carcinogénèse en prévenant la mutation de l’ADN. Lors de ce processus, il y a d’abord reconnaissance de la lésion par la protéine XPC/Rad4 (humain/levure) qui recrute ensuite TFIIH. Ce complexe déroule l’ADN par son activité hélicase et recrute l’endonucléase XPG/Rad2 ainsi que d’autres protéines nécessaires à l’excision de l’ADN. Lors de son arrivée au site de lésion, XPG/Rad2 déplace XPC/Rad4. TFIIH agit également lors de la transcription de l’ADN, entre autres par son activité hélicase. Outre cette similarité de la présence de TFIIH lors de la transcription et la réparation, il est possible de se demander en quoi les deux voies sont similaires. Nous nous sommes donc intéressés aux interactions impliquant TFIIH et la machinerie de réparation de l’ADN. Nous avons donc entrepris une caractérisation structurale et fonctionnelle de ces interactions. Nous avons découvert que Rad2 et Rad4 possèdent un motif d’interaction en nous basant sur d’autres interactions de la sous-unité Tfb1 de TFIIH. Par calorimétrie à titrage isotherme, nous avons observé que les segments de ces deux protéines contenant ce motif interagissent avec une grande affinité au domaine PH de Tfb1. Le site de liaison de ces segments sur Tfb1PH est très semblable au site de liaison du domaine de transactivation de p53 et au domaine carboxy-terminal de TFIIEα avec Tfb1PH, tel que démontré par résonance magnétique nucléaire (RMN). De plus, tous ces segments peuvent faire compétition les uns aux autres pour la liaison à Tfb1PH. Nous avons aussi démontré in vivo chez la levure qu’une délétion de Tfb1PH crée une sensibilité aux radiations UV. De plus, la délétion de multiples segments de Rad2 et Rad4, dont les segments d’interaction à Tfb1PH, est nécessaire pour voir une sensibilité aux rayons UV. Ainsi, de multiples interactions sont impliquées dans la liaison de Rad2 et Rad4 à TFIIH. Finalement, les structures des complexes Rad2-Tfb1PH et Rad4-Tfb1PH ont été résolues par RMN. Ces structures sont identiques entre elles et impliquent des résidus hydrophobes interagissant avec des cavités peu profondes de Tfb1PH. Ces structures sont très semblables à la structure de TFIIEα-p62PH. Ces découvertes fournissent ainsi un lien important entre la transcription et la réparation de l’ADN. De plus, elles permettent d’émettre un modèle du mécanisme de déplacement de XPC/Rad4 par XPG/Rad2 au site de dommage à l’ADN. Ces connaissances aident à mieux comprendre les mécanismes de maintient de la stabilité génomique et peuvent ainsi mener à développer de nouvelles thérapies contre le cancer.

Regulation of lipid metabolism in adipocytes and hepatocytes by hexarelin through scavenger receptor CD36

Les sécrétines de l’hormone de croissance (GHRPs) sont de petits peptides synthétiques capables de stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance à partir de l’hypophyse via leur liaison au récepteur de la ghréline GHS-R1a. Le GHRP hexaréline a été utilisé afin d’étudier la distribution tissulaire de GHS-R1a et son effet GH-indépendant. Ainsi, par cette approche, il a été déterminé que l’hexaréline était capable de se lier à un deuxième récepteur identifié comme étant le récepteur scavenger CD36. Ce récepteur possède une multitude de ligands dont les particules oxLDL et les acides gras à longue chaîne. CD36 est généralement reconnu pour son rôle dans l’athérogénèse et sa contribution à la formation de cellules spumeuses suite à l’internalisation des oxLDL dans les macrophages/monocytes. Auparavant, nous avions démontré que le traitement des macrophages avec l’hexaréline menait à l’activation de PPARƔ via sa liaison à GHS-R1a, mais aussi à CD36. De plus, une cascade d’activation impliquant LXRα et les transporteurs ABC provoquait également une augmentation de l’efflux du cholestérol. Une stimulation de la voie du transport inverse du cholestérol vers les particules HDL entraînait donc une diminution de l’engorgement des macrophages de lipides et la formation de cellules spumeuses. Puisque CD36 est exprimé dans de multiples tissus et qu’il est également responsable du captage des acides gras à longue chaîne, nous avons voulu étudier l’impact de l’hexaréline uniquement à travers sa liaison à CD36. Dans le but d’approfondir nos connaissances sur la régulation du métabolisme des lipides par CD36, nous avons choisi des types cellulaires jouant un rôle important dans l’homéostasie lipidique n’exprimant pas GHS-R1a, soient les adipocytes et les hépatocytes. L’ensemble de mes travaux démontre qu’en réponse à son interaction avec l’hexaréline, CD36 a le potentiel de réduire le contenu lipidique des adipocytes et des hépatocytes. Dans les cellules adipeuses, l'hexaréline augmente l’expression de plusieurs gènes impliqués dans la mobilisation et l’oxydation des acides gras, et induit également l’expression des marqueurs thermogéniques PGC-1α et UCP-1. De même, hexaréline augmente l’expression des gènes impliqués dans la biogenèse mitochondriale, un effet accompagné de changements morphologiques des mitochondries; des caractéristiques observées dans les types cellulaires ayant une grande capacité oxydative. Ces résultats démontrent que les adipocytes blancs traités avec hexaréline ont la capacité de se transformer en un phénotype similaire aux adipocytes bruns ayant l’habileté de brûler les acides gras plutôt que de les emmagasiner. Cet effet est également observé dans les tissus adipeux de souris et est dépendant de la présence de CD36. Dans les hépatocytes, nous avons démontré le potentiel de CD36 à moduler le métabolisme du cholestérol. En réponse au traitement des cellules avec hexaréline, une phosphorylation rapide de LKB1 et de l’AMPK est suivie d’une phosphorylation inhibitrice de l’HMG-CoA réductase (HMGR), l’enzyme clé dans la synthèse du cholestérol. De plus, la liaison d'hexaréline à CD36 provoque le recrutement d’insig-2 à HMGR, l’étape d’engagement dans sa dégradation. La dégradation de HMGR par hexaréline semble être dépendante de l’activité de PPARƔ et de l’AMPK. Dans le but d’élucider le mécanisme d’activation par hexaréline, nous avons démontré d’une part que sa liaison à CD36 provoque une déphosphorylation de Erk soulevant ainsi l’inhibition que celui-ci exerce sur PPARƔ et d’autre part, un recrutement de l’AMPK à PGC-1α expliquant ainsi une partie du mécanisme d’activation de PPARƔ par hexaréline. Les résultats générés dans cette thèse ont permis d’élucider de nouveaux mécanismes d’action de CD36 et d'approfondir nos connaissances de son influence dans la régulation du métabolisme des lipides.

Étude de la collaboration entre les facteurs de transcription hématopoïétiques lors du développement et de la différenciation des cellules érythroïdes

La régulation transcriptionnelle des gènes est cruciale pour permettre le bon fonctionnement des cellules. Afin que les cellules puissent accomplir leurs fonctions, les gènes doivent être exprimés adéquatement dans le bon type cellulaire et au stade de développement et de différenciation approprié. Un dérèglement dans l’expression de un ou plusieurs gènes peut entraîner de graves conséquences sur le destin de la cellule. Divers éléments en cis (ex : promoteurs et enhancers) et en trans (machinerie transcriptionnelle et facteurs de transcription) sont impliqués dans la régulation de la transcription. Les gènes du locus humain beta-globine (hub) sont exprimés dans les cellules érythroïdes et sont finenement régulés lors du développement et de la différenciation. Des mutations dans différentes régions du locus causent entre autres les beta-thalassémies. Nous avons utilisé ce modèle bien caractérisé afin d’étudier différents mécanismes de régulation favorisés par les facteurs de transcription qui sont exprimés dans les cellules érythroïdes. Nous nous sommes intéressés à l’importance de l’élément en cis HS2 du Locus control region. Cet élément possède plusieurs sites de liaison pour des facteurs de transcription impliqués dans la régulation des gènes du locus hub. Nos résultats montrent que HS2 possède un rôle dans l’organisation de la chromatine du locus qui peut être dissocié de son rôle d’enhancer. De plus, HS2 n’est pas essentiel pour l’expression à haut niveau du gène beta alors qu’il est important pour l’expression des gènes gamma. Ceci suggère que le recrutement des différents facteurs au site HS2 lors du développement influence différement les gènes du locus. Dans un deuxième temps, nous avons investigué l’importance de HS2 lors de la différenciation des cellules érythroïdes. Il avait été rapporté que l’absence de HS2 influence grandement la potentialisation de la chromatine du gène beta. La potentialisation dans les cellules progénitrices favorise l’activation transcriptionnelle du gène dans les cellules matures. Nous avons caractérisé le recrutement de différents facteurs de transcription au site HS2 et au promoteur beta dans les cellules progénitrices hématopoïétiques (CPH) ainsi que dans les cellules érythroïdes matures. Nos résultats montrent que le facteur EKLF est impliqué dans la potentialisation de la chromatine et favorise le recrutement des facteurs BRG1, p45 et CBP dans les CPH. L’expression de GATA-1 dans les cellules érythroïdes matures permet le recrutement de GATA-1 au locus hub dans ces cellules. Ces données suggèrent que la combinaison de EKLF et GATA-1 est requise pour permettre une activation maximale du gène beta dans les cellules érythroïdes matures. Un autre facteur impliqué dans la régulation du locus hub est Ikaros. Nous avons étudié son recrutement au locus hub et avons observé que Ikaros est impliqué dans la répression des gènes gamma. Nos résultats montrent aussi que GATA-1 est impliqué dans la répression de ces gènes et qu’il interagit avec Ikaros. Ensemble, Ikaros et GATA-1 favorisent la formation d’un complexe de répression aux promoteurs gamma. Cette étude nous a aussi permis d’observer que Ikaros et GATA-1 sont impliqués dans la répression du gène Gata2. De façon intéressante, nous avons caractérisé le mécanisme de répression du gène Hes1 (un gène cible de la voie Notch) lors de la différenciation érythroïde. Similairement à ce qui a été observé pour les gènes gamma, Hes1 est aussi réprimé par Ikaros et GATA-1. Ces résultats suggèrent donc que la combinaison de Ikaros et GATA-1 est associée à la répression de plusieurs de gènes dans les cellules érythroïdes. Globalement cette thèse rapporte de nouveaux mécanismes d’action de différents facteurs de transcription dans les cellules érythroïdes. Particulièrement, nos travaux ont permis de proposer un modèle pour la régulation des gènes du locus hub lors du développement et de la différenciation. De plus, nous rapportons pour la première fois l’importance de la collaboration entre les facteurs Ikaros et GATA-1 dans la régulation transcriptionnelle de gènes dans les cellules érythroïdes. Des mutations associées à certains des facteurs étudiés ont été rapportées dans des cas de beta-thalassémies ainsi que de leucémies. Nos travaux serviront donc à avoir une meilleure compréhension des mécanismes d’action de ces facteurs afin de potentiellement pouvoir les utiliser comme cibles thérapeutiques.

Impacts fonctionnels des variants génétiques dans les promoteurs des gènes associés à la survie et à la mort cellulaire

La régulation de l’apoptose est importante dans le maintient de l’homéostasie cellulaire et l’intégrité du matériel génétique. L’apoptose est un mécanisme cellulaire qui élimine les cellules endommagées. Le bon fonctionnement de cette voie biologique est crucial pour contrer la propagation des cellules avec leurs anomalies génétiques. La dérégulation des gènes codants pour des composantes de la voie intrinsèque de l’apoptose est fréquemment observée chez divers types de cancers, incluant la leucémie. Nous proposons que des polymor¬phis¬mes fonctionnels localisés dans la région régulatrice (rSNP) des gènes impliqués dans la voie d’apoptose intrinsèque auraient un impact significatif dans l’oncogenèse en modifiant le taux d’expression de ces gènes. Dans cette étude, nous avons validé, à l’aide d’une combinaison d’approches in silico et in vitro, l’impact fonctionnel de la variabilité génétique sous la forme d’haplotypes (rHAPs), au niveau du promoteur proximal, de 11 gènes codant pour des composantes de la voie intrinsèque de l’apoptose. Pour ce faire, nous avons sous-cloné les rHAPs majeurs dans un vecteur contenant le gène rapporteur luciférase (pGL3b). Ces constructions furent utilisées dans des essais de transfections transitoires dans 3 lignées cellulaires (Hela, Jeg3 et Jurkat). Nous avons observé qu’au moins 2 rHAPs influencent significativement l’activité transcriptionelle de façon allèle spécifique. Ces rHAPs sont associés aux gènes YWHAB et YWHAQ. Les analyses de retard sur gel d’électrophorèse (EMSA) ont permis d’identifier 2 sites de liaison ADN-protéine différentielles dans les rHAPs du gène YWHAB. La variabilité du niveau d’expression des gènes étudiés pourrait contribuer à la susceptibilité interindividuelle de développer un cancer, tel que la leucémie de l’enfant.

Contribution de l’hypoxie et du facteur hif1a à la guérison cutanée chez le cheval

Le cheval est souvent victime de plaies traumatiques, dont la guérison est fréquemment problématique, et ce, principalement quand la plaie survient sur le membre. Il est courant de voir chez le cheval le développement d’un tissu de granulation exubérant ou « bouton de chair », qui mène à une cicatrisation excessive due à la surproduction de tissu fibreux. Ce tissu cicatriciel, non épithélialisé, est caractérisé par une occlusion au niveau de la microcirculation due à l’hypertrophie des cellules endothéliales, qui laisse supposer la présence d’hypoxie tissulaire. Une hypoxie relative a effectivement été mesurée par spectroscopie dans le proche infrarouge au niveau des plaies appendiculaires prédisposées au développement de tissu de granulation exubérant, par rapport aux plaies corporelles. De plus, une étude thermographique a révélé un patron spatial similaire de la perfusion. Au niveau moléculaire, la littérature rapporte que le facteur de transcription «hypoxia inducible factor» (HIF) est à l’origine de plusieurs changements dans les niveaux d’expression de divers gènes régulés par l’hypoxie. L’objectif du présent projet de recherche était de définir la contribution de l’hypoxie à la guérison cutanée chez le cheval. Le premier volet (in vivo) du projet visait à mesurer l’expression protéique temporelle du HIF1A dans des échantillons tissulaires en provenance de plaies cutanées guérissant normalement et d’autres développant une cicatrisation excessive, selon divers sites anatomiques (tronc, membre). Les résultats obtenus suggèrent que la mesure de HIF1A, dans les échantillons pluricellulaires de cette étude, reflète l’épithélialisation de la plaie plutôt que les niveaux d’oxygène tissulaire. En effet, le HIF1A semble réguler l’homéostasie et la prolifération des kératinocytes. Le second volet (in vitro), consistait en la mise en culture de fibroblastes dermiques équins provenant du tronc ou du membre, en condition de normoxie ou d’hypoxie (à 1% d’O2 ou à l’aide d’un mimétique, le CoCl2) afin d’en étudier le comportement (capacités de prolifération et de synthèse protéique). Les résultats obtenus soutiennent une contribution de l’hypoxie à la cicatrisation extensive chez le cheval puisque l’hypoxie favorise la prolifération des fibroblastes en plus d’encourager la synthèse de collagène de type 1 et de diminuer la synthèse de la métalloprotéinase de type 2. Les changements observés semblent dépendre de facteurs extrinsèques (environnementaux) car les fibroblastes dermiques se comportent de façon similaire indépendamment de la provenance anatomique. En somme, les deux volets de l’étude ont permis d’élucider une part des mécanismes sous-jacents à la formation du tissu de granulation exubérant lors de guérison cutanée chez le cheval. La poursuite des recherches dans ce domaine mènera à une meilleure compréhension de la pathologie et ainsi, permettra de développer des méthodes de traitement spécifiques à la condition.

Génomique fonctionnelle des cellules corticotropes hypophysaires : contrôle génétique de la gestion systémique des stress

L'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HPA) permet de maintenir l'homéostasie de l'organisme face à divers stress. Qu'ils soient de nature psychologique, physique ou inflammatoire/infectieux, les stress provoquent la synthèse et la libération de CRH par l'hypothalamus. Les cellules corticotropes hypophysaires perçoivent ce signal et en réaction, produisent et sécrètent l'ACTH. Ceci induit la synthèse des glucocorticoïdes (Gc) par le cortex surrénalien; ces stéroïdes mettent le système métabolique en état d’alerte pour la réponse au stress et à l’agression. Les Gc ont le rôle essentiel de contrôler les défenses de l'organisme, en plus d'exercer une rétro-inhibition sur l'axe HPA. L'ACTH est une petite hormone peptidique produite par le clivage d'un précurseur: la pro-opiomélanocortine (POMC). À cause de sa position critique dans la normalisation de l'homéostasie, le contrôle transcriptionnel du gène Pomc a fait l'objet d'études approfondies au cours des dernières décennies. Nous savons maintenant que la région promotrice du gène Pomc permet une expression ciblée dans les cellules POMC hypophysaires. L'étude du locus Pomc par des technologies génomiques m'a permis de découvrir un nouvel élément de régulation qui est conservé à travers l'évolution des mammifères. La caractérisation de cet enhancer a démontré qu'il dirige une expression restreinte à l'hypophyse, et plus particulièrement dans les cellules corticotropes. De façon intéressante, l'activité de cet élément dépend d'un nouveau site de liaison recrutant un homodimère du facteur de transcription Tpit, dont l'expression est également limitée aux cellules POMC de l'hypophyse. La découverte de cet enhancer ajoute une toute nouvelle dimension à la régulation de l'expression de POMC. Les cytokines pro-inflammatoires IL6/LIF et les Gc sont connus pour leur antagonisme sur la réaction inflammatoire et sur le promoteur Pomc via l'action des facteurs de transcription Stat3 et GR respectivement. L'analyse génomique des sites liés ii par ces deux facteurs nous a révélé une interrelation complexe et a permis de définir un code transcriptionnel entre ces voies de signalisation. En plus de leur action par interaction directe avec l’ADN au niveau des séquences régulatrices, ces facteurs interagissent directement entre eux avec des résultats transcriptionnels différents. Ainsi, le recrutement de GR par contact protéine:protéine (tethering) sur Stat3 étant lié à l'ADN provoque un antagonisme transcriptionnel. Inversement, le tethering de Stat3 sur GR supporte une action synergique, tout comme leur co-recrutement à l'ADN sur des sites contigus ou composites. Lors d'une activation soutenue, ce synergisme entre les voies IL6/LIF et Gc induit une réponse innée de défense cellulaire. Ainsi lors d'un stress majeur, ce mécanisme de défense est mis en branle dans toutes les cellules et tissus. En somme, les travaux présentés dans cette thèse définissent les mécanismes transcriptionnels engagés dans le combat de l'organisme contre les stress. Plus particulièrement, ces mécanismes ont été décrits au niveau de la réponse globale des corticotropes et du gène Pomc. Il est essentiel pour l'organisme d'induire adéquatement ces mécanismes afin de faire face aux stress et d'éviter des dérèglements comme les maladies inflammatoires et métaboliques.

Réparation par excision de nucléotides des dommages induits par rayons ultraviolets dans les mélanomes humains

Les mélanomes malins (MM) constituent le deuxième type de cancer le plus fréquent chez les jeunes adultes canadiens (entre 20 et 44 ans) ainsi qu’un des rares cancers dont l’incidence augmente annuellement. À moins que les MM ne soient excisés à temps par chirurgie, les chances de survie des patients sont pratiquement nulles puisque ce type de tumeur est très réfractaire aux traitements conventionnels. Il est bien connu que l’exposition aux rayons ultraviolets (UV), induisant des photoproduits génotoxiques, est une déterminante majeure dans l’acquisition de MM. À cet effet, la réparation par excision de nucléotides (NER) est la ligne de défense principale contre le développement des mélanomes puisqu’elle est la voie de réparation prépondérante en ce qui a trait aux dits photoproduits. Malgré cela, la contribution potentielle de défauts de la NER au développement des MM dans la population normale n’est toujours pas bien établie. Notre laboratoire a précédemment développé une méthode basée sur la cytométrie de flux qui permet de mesurer la NER en fonction du cycle cellulaire. Cette méthode a déjà mise en évidence qu’une déficience de l’activité de la protéine ATR peut mener à une déficience de la NER exclusive à la phase S dans des fibroblastes humains. Pareillement, nous avons démontré que plusieurs lignées cellulaires cancéreuses modèles comportent une déficience en NER en phase S, suggérant qu’une telle déficience puisse caractériser certains types de cancers. Nous avons voulu savoir si une déficience en NER en phase S pouvait être associée à une proportion significative de mélanomes et si le tout pouvait être attribuable à une diminution de l’activité d’ATR. Nos objectifs ont donc été de : (i) mesurer l’efficacité de la NER en fonction du cycle cellulaire dans les MM en comparaison avec les mélanocytes primaires, (ii) vérifier si le niveau d’activité d’ATR corrèle avec l’efficacité de la NER en phase S dans les lignées de MM et (iii) voir si un gène fréquemment muté dans les mélanomes (tels PTEN et BRAF) pouvait coopérer avec ATR pour réguler la NER en phase S dans les mélanomes. Nous avons démontré que 13 lignées de MM sur 16 ont une capacité grandement diminuée à réparer les photoproduits induits par UV spécifiquement en phase S. De plus, cette déficience corrèle fortement avec une réduction de l’activation d’ATR et, dans plusieurs lignées de MM, avec une phosphorylation d’Akt plus importante. L’utilisation d’ARN interférent ou d’un inhibiteur du suppresseur de tumeurs PTEN, a permis, en plus d’augmenter la phosphorylation d’Akt, de réduire la réparation des photoproduits et l’activation d’ATR dans les cellules en phase S. En addition, (i) l’expression ectopique de la protéine PTEN sauvage dans des lignées déficientes en PTEN (mais pas d’une protéine PTEN sans activité phosphatase) ou (ii) l’inhibition pharmacologique d’Akt a permis d’augmenter la réparation en phase S ainsi que l’activation d’ATR. En somme, cette étude démontre qu’une signalisation d’ATR dépendante de PTEN/Akt amenant à une réparation déficiente des photoproduits génomiques causés par les UV en phase S peut être déterminante dans le développement des mélanomes induits par UV.

L'épigénétique, moteur de l'évolution d'un vertébré asexué

L’objectif de cette thèse est de déterminer l’étendue de la variabilité épigénétique, plus particulièrement du polymorphisme de méthylation de l’ADN, non liée à la variabilité génétique dans les populations asexuées en milieu naturel. Cette évaluation nous a permis de mieux cerner l’importance que peuvent avoir les processus épigénétiques en écologie et en évolution. Le modèle biologique utilisé est l’hybride clonal du complexe gynogénétique Chrosomus eos-neogaeus. Malgré une homogénéité génétique, une importante variabilité phénotypique est observée entre les hybrides d’une même lignée clonale mais retrouvés dans des environnements différents. L’influence des processus épigénétiques apporte une explication sur ce paradoxe. L’épigénétique se définit comme une modification de l’expression des gènes sans changement de la séquence d’ADN. La diversité des phénotypes peut entre autre s’expliquer par des patrons de méthylation différentiels des gènes et/ou des allèles des gènes entre les hybrides génétiquement identiques. La diversité des lignées épiclonales peut quant à elle s’expliquer par la colonisation de plusieurs lignées épiclonales, s’établir en réponse à l’environnement ou de façon aléatoire. Plusieurs méthodes seront utilisées afin de survoler le génome des hybrides clonaux pour mettre en évidence le polymorphisme de méthylation de l’ADN à l’échelle de l’individu et entre les individus de différentes populations.

Implication de MEK1 et MEK2 dans l'initiation et la progression du cancer colorectal

Une dérégulation de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK1/2 est observée dans plus de 30% des cancers et des mutations activatrices de RAS sont observées dans 30% à 50% des adénomes colorectaux. À la suite d’une analyse extensive de biopsies de tumeurs colorectales humaines par micromatrices tissulaires (TMA), nous avons observé que 44% des tissus cancéreux exprimaient MEK1/2 phosphorylés, contre 10% des tissus normaux. L'analyse des TMA a également révélé que 79% des tumeurs arboraient un marquage nucléaire de MEK1/2 phosphorylés, contre 4 % pour les tissus normaux. Bien que la voie MEK/ERK1/2 soit fréquemment activée dans les cancers, le rôle précis des isoformes de MEK1 et de MEK2 n'a jamais été clairement établie. De même, l'impact de cette localisation nucléaire aberrante de phospho-MEK1/2, dans l'initiation et la progression des cancers colorectaux, est inconnu. Lors d'un premier projet, nous avons démontré, que l’expression de MEK1 ou MEK2 activé est suffisante pour transformer in vitro des cellules intestinales épithéliales de rat (IEC-6). L'expression des mutants actifs de MEK1 ou MEK2 est suffisante pour induire une dérégulation de la prolifération cellulaire et engendrer la formation d'adénocarcinomes invasifs dans un modèle de greffe orthotopique du côlon chez la souris. Nous avons également démontré que l'inhibition de MEK2 par shRNA supprime complètement la prolifération des lignées humaines de cancer du côlon, alors que la suppression de MEK1 a peu d'effet sur la capacité de prolifération. Le deuxième projet, nous a permis d'observer que l'expression d'un mutant nucléaire de MEK1 dans les cellules IEC-6 transforme drastiquement les cellules. Une augmentation de prolifération, une résistance à l'anoikose, un dérèglement du cycle cellulaire, de l'instabilité chromosomique (CIN), de la tétra/aneuploïdie sont observés. La caractérisation des mécanismes responsables de cette localisation aberrante de MEK1/2 phosphorylés, a permis d'identifier la protéine Sef, un régulateur de la localisation cytoplasmique de MEK/ERK1/2. Nous avons démontré que l'expression d'une forme oncogénique de Ras (H-RasV12) inhibe l'expression de Sef, engendrant alors une accumulation nucléaire de MEK1/2 activés. Plus encore, la réexpression de Sef restaure la localisation cytoplasmique de MEK1/2 et renverse les propriétés tumorigéniques ainsi que l'aneuploïdie induite par Ras activé. Un troisième projet, visant la caractérisation des mécanismes associés à la CIN et à l'aneuploïde engendrés par l'activation aberrante de la voie de Ras-ERK1/2, a permis d'observer que l'hyperactivation de ERK1/2 induit des anomalies mitotiques menant à la binucléation. Une localisation erronée et une surexpression de la kinase Aurora A, de même que des protéines de passage du complexe chromosomique (CPC), Aurora B, Survivine et INCENP, sont observées. L'inhibition partielle de l'activation de ERK1/2 par de faible dose de PD184352, un inhibiteur de MEK1/2, est suffisante pour renverser la surexpression de ces régulateurs mitotiques, de même que corriger les anomalies de la mitose et réduire la tétra/aneuploïdie engendrée par Ras oncogénique. Ainsi, nous avons démontré, pour la première fois, que la voie des MAP kinases ERK1/2 est impliquée dans la CIN, la tétraploïdie et l'aneuploïdie. Nos résultats suggèrent que la perte de Sef est un événement oncogénique précoce, qui contribue à la localisation nucléaire aberrante de MEK1/2 qui est observée dans les tumeurs colorectales. Cette localisation anormale de MEK1/2 est associée à l'initiation de la transformation, la progression tumorale et la CIN, via l'activité soutenue de ERK1/2. Ces informations sont capitales et démontrent l’importance de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK1/2 dans le processus de tumorigénèse colorectale.

Conséquences fonctionnelles de mutations affectant le récepteur de la vasopressine de type 2 et implications thérapeutiques

Le récepteur de la vasopressine de type 2 (V2R) joue un rôle crucial dans l’homéostasie hydrique. Exprimé principalement au niveau du rein, son activation par l’hormone antidiurétique arginine-vasopressine (AVP) favorise la réabsorption d’eau, participant ainsi à diminuer la diurèse. Plus de 200 mutations dans le gène du V2R ont été associées au diabète néphrogénique insipide congénital (DINc), une maladie causée par une perte de fonction du récepteur. À l’opposé, trois mutations découvertes récemment induisent un gain de fonction du V2R, et sont la cause du syndrome néphrogénique de l’anti-diurèse inappropriée (NSIAD). Les travaux de cette thèse visent à mieux comprendre les bases moléculaires responsables de la perte ou du gain de fonction des récepteurs mutants associés à ces deux maladies. Dans plus de 50% des cas, les mutations faux-sens affectent négativement l’adoption d’une conformation native par le V2R, provoquant la reconnaissance et la rétention intracellulaire des mutants par le système de contrôle de qualité du réticulum endoplasmique. Nos résultats ont démontré que l’interaction entre les récepteurs mutants et le chaperon moléculaire calnexine est dépendante de N-glycosylation et que sa durée varie en fonction de la mutation. De plus, l’importance de cette modification co-traductionnelle et des interactions lectines-sucres dans le processus de maturation d’un mutant donné s’est avérée une caractéristique intrinsèque, puisque l’absence de N-glycosylation n’a pas affecté le mutant Y128S (phénotype léger) tandis que la maturation du mutant W164S (phénotype sévère) a été totalement abolie. Nos résultats suggèrent aussi que l’action des chaperons pharmacologiques (CP), molécules favorisant la maturation des mutants du V2R, peut survenir à différentes étapes au cours du processus de maturation, selon le mutant réchappé. Ces différences entre muta nts suggèrent des processus biosynthétiques ‘personnalisés’ dictés par la nature de la mutation impliquée et pourraient expliquer la différence de sévérité des manifestations cliniques chez les patients porteurs de ces mutations. Bien qu’une récupération de fonction ait été obtenue pour les mutants Y128S et W164S par un traitement au CP, il n’en est pas de même pour toutes les mutations occasionnant un défaut conformationnel. C’est ce que nous avons démontré pour le mutant V88M, affligé de deux défauts, soit une faible efficacité de maturation combinée à une basse affinité pour l’AVP. Dans ce cas, et malgré une augmentation du nombre de récepteurs mutants la surface cellulaire, la diminution de l’affinité apparente du récepteur mutant pour l’AVP a été exacerbée par la présence résiduelle de CP à son site de liaison, rendant impossible l’activation du récepteur aux concentrations physiologiques d’AVP. Les mutants R137C et R137L ont une activité constitutive élevée et mènent au NSIAD tandis que la substitution de cette même arginine par une histidine (R137H) mène au DINc. Ces trois mutants se sont avéré partager plusieurs caractéristiques, dont une efficacité de maturation réduite et une désensibilisation spontanée élevée. La seule différence iden tifiée entre ces mutants est leur niveau d’activité constitutive. Le CP utilisé dans nos études possède aussi la propriété d’agoniste inverse, mais n’a pourtant pas diminué l’activité constitutive des mutants R137C/L, suggérant une conformation active ‘figée’. Seul l’effet chaperon a été observé, entraînant la hausse de récepteurs à la surface cellulaire, qui se traduit par une augmentation de la production de second messager. Nous avons par contre suggéré l’utilisation d’AVP puisqu’il favorise l’endocytose des récepteurs R137/L sans promouvoir leur activation, diminuant ainsi le nombre de récepteurs actifs à la surface cellulaire. Nous avons identifié la première mutation occasionnant un gain de fonction du V2R qui n’implique pas l’arginine 137. Le mutant F229V a une activité constitutive élevée et, contrairement aux R137C et R137L, il n’est pas sujet à une désensibilisation spontanée accrue. L’observation que des agonistes inverses sont aptes à inhiber l’activité constitutive de ce nouveau mutant est une découverte importante puisque l’insuccès obtenu avec les mutations précédentes suggérait que ces molécules n’étaient pas utiles pour le traitement du NSIAD. Considérés globalement, ces travaux illustrent le caractère particulier des formes mutantes du V2R et l’importance de bien cerner les conséquences fonctionnelles des mutations afin d’apporter aux patients atteints de DINc ou NSIAD une thérapie personnalisée, et de développer de nouveaux agents thérapeutiques adaptés aux besoins.