The role of GAPDH in maintaining the functional state of the DNA repair enzyme APE1

Les sites apuriniques/apyrimidiniques (AP) sont des sites de l’ADN hautement mutagène. Les dommages au niveau de ces sites peuvent survenir spontanément ou être induits par une variété d’agents. Chez l’humain, les sites AP sont réparés principalement par APE1, une enzyme de réparation de l’ADN qui fait partie de la voie de réparation par excision de base (BER). APE1 est une enzyme multifonctionnelle; c’est une AP endonucléase, 3’-diestérase et un facteur redox impliqué dans l’activation des facteurs de transcription. Récemment, il a été démontré qu’APE1 interagit avec l’enzyme glycolytique GAPDH. Cette interaction induit l’activation d’APE1 par réduction. En outre, la délétion du gène GAPDH sensibilise les cellules aux agents endommageant l’ADN, induit une augmentation de formation spontanée des sites AP et réduit la prolifération cellulaire. A partir de toutes ces données, il était donc intéressant d’étudier l’effet de la délétion de GAPDH sur la progression du cycle cellulaire, sur la distribution cellulaire d’APE1 et d’identifier la cystéine(s) d’APE1 cible(s) de la réduction par GAPDH. Nos travaux de recherche ont montré que la déficience en GAPDH cause un arrêt du cycle cellulaire en phase G1. Cet arrêt est probablement dû à l’accumulation des dommages engendrant un retard au cours duquel la cellule pourra réparer son ADN. De plus, nous avons observé des foci nucléaires dans les cellules déficientes en GAPDH qui peuvent représenter des agrégats d’APE1 sous sa forme oxydée ou bien des focis de la protéine inactive au niveau des lésions d’ADN. Nous avons utilisé la mutagénèse dirigée pour créer des mutants (Cys en Ala) des sept cystéines d’APE1 qui ont été cloné dans un vecteur d’expression dans les cellules de mammifères. Nous émettons l’hypothèse qu’au moins un mutant ou plus va être résistant à l’inactivation par oxydation puisque l’alanine ne peut pas s’engager dans la formation des ponts disulfures. Par conséquent, on anticipe que l’expression de ce mutant dans les cellules déficientes en GAPDH pourrait restaurer une distribution cellulaire normale de APE1, libérerait les cellules de l’arrêt en phase G1 et diminuerait la sensibilité aux agents endommageant l’ADN. En conclusion, il semble que GAPDH, en préservant l’activité d’APE1, joue un nouveau rôle pour maintenir l’intégrité génomique des cellules aussi bien dans les conditions normales qu’en réponse au stress oxydatif.

Contribution de la Glycoprotéine M dans la Sortie de HSV-1

Le Virus Herpès Simplex de type 1 (HSV-1) est un agent infectieux qui cause l’herpès chez une grande proportion de la population mondiale. L’herpès est généralement considéré comme une maladie bénigne dont la forme la plus commune est l'herpès labial (communément appelé « bouton de fièvre »), mais elle peut se révéler très sérieuse et causer la cécité et l’encéphalite, voir létale dans certain cas. Le virus persiste toute la vie dans le corps de son hôte. Jusqu'à présent, aucun traitement ne peut éliminer le virus et aucun vaccin n’a été prouvé efficace pour contrôler l’infection herpétique. HSV-1 est un virus avec un génome d’ADN bicaténaire contenu dans une capside icosaèdrale entourée d’une enveloppe lipidique. Treize glycoprotéines virales se trouvent dans cette enveloppe et sont connues ou supposées jouer des rôles distincts dans différentes étapes du cycle de réplication viral, incluant l'attachement, l'entrée, l’assemblage, et la propagation des virus. La glycoprotéine M (gM) qui figure parmi ces glycoprotéines d’enveloppe, est la seule glycoprotéine non essentielle mais est conservée dans toute la famille herpesviridae. Récemment, l’homologue de gM dans le Pseudorabies virus (PRV), un autre herpesvirus, a été impliqué dans la phase finale de l’assemblage (i.e. l’enveloppement cytoplasmique) au niveau du réseau trans-Golgi (TGN) en reconnaissant spécifiquement des protéines tégumentaires et d’autres glycoprotéines d’enveloppe ([1]). Toutefois, il a été proposé que cette hypothèse ne s’applique pas pour le HSV-1 ([2]). De plus, contrairement à la localisation au TGN dans les cellules transfectées, HSV-1 gM se localise dans la membrane nucléaire et sur les virions périnucléaires durant une infection. L’objectif du projet présenté ici était d’éclaircir la relation de la localisation et la fonction de HSV-1 gM dans le contexte d’une infection. Dans les résultats rapportés ici, nous décrivons tout abord un mécanisme spécifique de ciblage nucléaire de HSV-1 gM. En phase précoce d’une infection, gM est ciblée à la membrane nucléaire d'une manière virus ii dépendante. Cela se produit avant la réorganisation du TGN normalement induite par l’infection et avant que gM n’entre dans la voie de sécrétion. Ce ciblage nucléaire actif et spécifique de gM ne semble pas dépendre des plusieurs des partenaires d’interaction proposés dans la littérature. Ces données suggèrent que la forme nucléaire de gM pourrait avoir un nouveau rôle indépendant de l’enveloppement final dans le cytoplasme. Dans la deuxième partie du travail présenté ici, nous avons concentré nos efforts sur le rôle de gM dans l’assemblage du virus en phase tardive de l’infection et en identifiant un domaine critique de gM. Nos résultats mettent en valeur l’importance du domaine carboxyl-terminal cytoplasmique de gM dans le transport de gM du réticulum endoplasmique (RE) à l’appareil de Golgi, dans l’enveloppement cytoplasmique et la propagation intercellulaire du virus. Ainsi, l’export du RE de gM a été complètement compromis dans les cellules transfectées exprimant un mutant de gM dépourvu de sa région C-terminale. La délétion la queue cytoplasmique de gM cause une réduction légère du titre viral et de la taille des plaques. L'analyse de ces mutants par microscopie électronique a démontré une accumulation des nucléocapsides sans enveloppe dans le cytoplasme par rapport aux virus de type sauvage. Étrangement, ce phénotype était apparent dans les cellules BHK mais absent dans les cellules 143B, suggérant que la fonction de gM dépende du type cellulaire. Finalement, le criblage de partenaires d’interaction du domaine C-terminal de gM identifiés par le système de double-hybride nous a permis de proposer plusieurs candidats susceptibles de réguler la fonction de gM dans la morphogénèse et la propagation de virus.

Études sur la dérégulation des cytokines et des cellules Natural Killer chez les patients infectés par le VIH-1

La prolifération, la différenciation ainsi que les fonctions des cellules du système immunitaire sont contrôlées en partie par les cytokines. Lors de l’infection par le VIH-1, les défauts observés dans les fonctions, la maintenance, ainsi que la consistance des cellules du système immunitaire sont en large partie attribués à une production altérée des cytokines et à un manque d’efficacité au niveau de leurs effets biologiques. Durant ces études, nous nous sommes intéréssés à la régulation et aux fonctions de deux cytokines qui sont l’IL-18 et l’IL-21. Nous avons observé une corrélation inversée significative entre les concentrations sériques d’IL-18 et le nombre des cellules NK chez les patients infectés par le VIH-1. Nos expériences in vitro ont démontré que cette cytokine induit l’apoptose des cellules NK primaires et que cette mort peut être inhibée par des anticorps neutralisants spécifiques pour FasL et TNF-α. Cette mort cellulaire est due à l’expression de FasL sur les cellules NK et à la production de TNF-α par ces cellules. L’IL-18 augmente aussi la susceptibilité à la mort des cellules NK par un stimulus pro-apoptotique, en diminuant l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-XL. Nous démontrons aussi que, contrairement à l’IL-18, les niveaux d’IL-18BP sont plus faibles dans les sérum de patients infectés. Ceci résulte sur une production non coordonnée de ces deux facteurs, aboutissant à des niveaux élevés d’IL-18 libre et biologiquement active chez les patients infectés. L’infection de macrophages in vitro induit la production d’IL-18 et réduit celle d’IL-18BP. De plus, l’IL-10 et le TGF-β, dont les concentrations sont élevées chez les patients infectés, réduisent la production d’IL-18BP par les macrophages in vitro. Finalement, nous démontrons que l’IL-18 augmente la réplication du VIH-1 dans les lymphocytes T CD4+ infectés. Les niveaux élevés d’IL-18 libres et biologiquement actives chez les patients infectés contribuent donc à l’immuno-pathogénèse induite par le VIH-1 en perturbant l’homéostasie des cellules NK ainsi qu’en augmentant la réplication du virus chez les patients. Ces études suggèrent donc la neutralisation des effets néfastes de l’IL-18 en utilisant son inhibiteur naturel soit de l’IL-18BP exogène. Ceci permettrait de moduler l’activité de l’IL-18 in vivo à des niveaux souhaitables. L’IL-21 joue un rôle clef dans le contrôle des infections virales chroniques. Lors de ces études, nous avons déterminé la dynamique de la production d’IL-21 lors de l’infection par le VIH-1 et sa conséquence sur la survie des cellules T CD4+ et la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1. Nous avons démontré que sa production est compromise tôt au cours de l’infection et que les concentrations d’IL-21 corrèlent avec le compte de cellules T CD4+ chez les personnes infectées. Nos études ont démontré que le traitement antirétroviral restaure partiellement la production d’IL-21. De plus, l’infection par le VIH-1 de cellules T CD4+ humaines inhibe sa production en réduisant l’expression du facteur de transcription c-Maf. Nous avons aussi démontré que la fréquence des cellules T CD4+ spécifiques au VIH-1 qui produisent de l’IL-21 est réduite chez les patients virémiques. Selon nos résultats, l’IL-21 empêche l’apoptose spontanée des cellules T CD4+ de patients infectés et l’absence d’IL-21 réduit la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1 chez ces patients. Nos résultats démontrent que l'IL-21R est exprimé de façon égale sur tous les sous-types de cellules NK chez les donneurs sains et chez les patients infectés. L’IL-21 active les protéines STAT-3, MAPK et Akt afin d'augmenter les fonctions effectrices des cellules NK. L'activation de STAT-3 joue un rôle clef dans ces fonctions avec ou sans un traitement avec de l'IL-21. L'IL-21 augmente l'expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-XL, augmente la viabilité des cellules NK, mais ne possède aucun effet sur leur prolifération. Nous démontrons de plus que l'IL-21 augmente l'ADCC, les fonctions sécrétrices et cytotoxiques ainsi que la viabilité des cellules NK provenant de patients chroniquement infectés par le VIH-1. De plus, cette cytokine semble présenter ces effets sans augmenter en contrepartie la réplication du VIH-1. Elle permet donc d'inhiber la réplication virale lors de co-cultures autologues de cellules NK avec des cellules T CD4+ infectées d'une manière dépendante à l'expression de perforine et à l'utilisation de la protéine LFA-1. Les niveaux d’IL-21 pourraient donc servir de marqueurs biologiques pour accompagner les informations sur le taux de cellules T CD4+ circulantes en nous donnant des informations sur l’état de fonctionnalité de ce compartiment cellulaire. De plus, ces résultats suggèrent l’utilisation de cette cytokine en tant qu’agent immunothérapeutique pour restaurer les niveaux normaux d’IL-21 et augmenter la réponse antivirale chez les patients infectés par le VIH-1.

Étude du rôle de Pax6 dans la gliogenèse

Les astrocytes sont des cellules gliales présentes dans le système nerveux central, qui exercent de nombreuses fonctions physiologiques essentielles et sont impliquées dans la réponse aux lésions et dans plusieurs pathologies du cerveau. Les astrocytes sont générés par les cellules de la glie radiale, les précurseurs communs de la plupart des cellules neuronales et gliales du cerveau, après le début de la production des neurones. Le passage de la neurogenèse à la gliogenèse est le résultat de mécanismes moléculaires complexes induits par des signaux intrinsèques et extrinsèques responsables du changement de propriété des précurseurs et de leur spécification. Le gène Pax6 code pour un facteur de transcription hautement conservé, impliqué dans plusieurs aspects du développement du système nerveux central, tels que la régionalisation et la neurogenèse. Il est exprimé à partir des stades les plus précoces dans les cellules neuroépithéliales (les cellules souches neurales) et dans la glie radiale, dérivant de la différenciation de ces cellules. L’objectif de cette étude est d’analyser le rôle de Pax6 dans la différenciation et dans le développement des astrocytes. À travers l’utilisation d’un modèle murin mutant nul pour Pax6, nous avons obtenu des résultats suggérant que la suppression de ce gène cause l'augmentation de la prolifération et de la capacité d'auto-renouvellement des cellules souches neurales embryonnaires. In vitro, les cellules mutantes prolifèrent de façon aberrante et sous-expriment les gènes p57Kip2, p16Ink4a, p19Arf et p21Cip1, qui inhibent la progression du le cycle cellulaire. De plus, Pax6 promeut la différenciation astrocytaire des cellules souches neurales embryonnaires et est requis pour la différenciation des astrocytes dans la moëlle épinière. Les mutants nuls pour Pax6 meurent après la naissance à cause de graves défauts développementaux dus aux fonctions essentielles de ce gène dans le développement embryonnaire de plusieurs organes. En utilisant un modèle murin conditionnel basé sur le système CRE/ loxP (hGFAP-CRE/ Pax6flox/flox) qui présente l’inactivation de Pax6 dans les cellules de la glie radiale, viable après la naissance, nous avons montré que Pax6 est impliqué dans la maturation et dans le développement post-natal des astrocytes. Le cortex cérébral des souris mutantes conditionnelles ne présente pas d’astrocytes matures à l’âge de 16 jours et une très faible quantité d’astrocytes immatures à l’âge de trois mois, suggérant que Pax6 promeut la différenciation et la maturation des astrocytes. De plus, Pax6 semble jouer un rôle même dans le processus de différenciation et de maturation de cellules gliales rétiniennes. L’étude des gènes et des mécanismes moléculaires impliqués dans la génération des astrocytes est crucial pour mieux comprendre le rôle physiologique et les altérations pathologiques des ces cellules.

Les voies de signalisation utérines à l'émergence de la diapause embryonnaire chez le vison américain

La diapause embryonnaire se manifeste par un arrêt réversible du développement embryonnaire durant la période de préimplantation et induit un retard de l’implantation. Chez le vison américain, une diapause embryonnaire obligatoire caractérise chaque gestation. Si les mécanismes de contrôle de la diapause embryonnaire obligatoire chez cette espèce sont bien connus, le rôle utérin impliqué dans la réactivation de l’embryon demeure, quant à lui, encore inconnu. Le sujet de ce doctorat a consisté dans un premier temps à explorer l’environnement utérin à la sortie de la diapause embryonnaire afin de caractériser, dans un deuxième temps, les principaux acteurs utérins qui provoquent la réactivation de l’embryon. Nous avons effectué une analyse du transcriptome utérin à l’émergence de la diapause embryonnaire ce qui a permis de construire une librairie de 123 séquences d’ADNc utérines différentiellement exprimées à la réactivation de l’embryon et homologues à des séquences de gènes connues chez d’autres espèces. Ces gènes sont impliqués dans la régulation du métabolisme (25 %), de l’expression génique (21 %), de la transduction de signal (15 %), du cycle cellulaire (15 %), du transport (10 %) et de la structure cellulaire (9 %), reflétant ainsi d’importantes modifications utérines à la réactivation embryonnaire. Nous avons validé l’expression différentielle de dix gènes ainsi identifiés : GDF3 (growth and differentiation 3), ALCAM (activated leukocyte cell adhesion molecule), ADIPOR1 (adiponectin receptor 1), HMGN1 (high mobility group N1), TXNL1 (thioredoxin like 1), TGM2 (tissue transglutaminase 2), SPARC (secreted protein acidic rich in cystein), et trois gènes codant pour AZIN1 (antizyme inhibitor 1), ODC1 (ornithine decarboxylase 1) et SAT1 (spermidine/spermine N1-acetyltransferase), des enzymes impliquées dans la biosynthèse des polyamines. Le patron de l’expression spatio-temporel de SPARC et d’HMGN1 illustrent spécifiquement un remodelage tissulaire et de la chromatine au niveau utérin à la sortie de la diapause embryonnaire. Ayant mesuré une augmentation des concentrations utérines en polyamines à la reprise du développement embryonnaire, nous avons émis l’hypothèse que les polyamines seraient impliquées dans les événements menant à la sortie de la diapause. L’inhibition de la biosynthèse des polyamines par un traitement à l’ α-difluoromethylornithine (DFMO) a provoqué une diminution significative de la proliferation cellulaire dans les embryons à la réactivation, un retard du moment de l’implantation, mais n’a pas affecté le succès de la reproduction. De manière similaire, nous avons induit un état de dormance dans les cellules de trophoblaste de vison en présence DFMO dans le milieu de culture, et constaté que cet état était réversible. En conclusion, cette étude a non seulement ouvert de nouveaux horizons quant à la compréhension du rôle utérin dans les événements menant à la sortie de la diapause embryonnaire, mais a démontré pour la première fois, l’existence de facteurs utérins indispensables à la réactivation de l’embryon: les polyamines.

Effet des changements du ratio alimentaire oméga-3/oméga-6 dans un modèle d’infarctus du myocarde reperfusé chez le rat

Une mort cellulaire par apoptose impliquant un processus inflammatoire est observée dans le système limbique, suite à un infarctus du myocarde. Les oméga-3 et ses métabolites, en plus de leurs propriétés bénéfiques pour le système cardiovasculaire, réduisent l’inflammation, contrairement aux oméga-6 qui sont plus pro-inflammatoires. Comme le métabolisme de ces deux acides gras essentiels impliquent les mêmes enzymes, le ratio alimentaire oméga-3/6 aurait donc des impacts importants sur l'état inflammatoire et ainsi indirectement sur l'apoptose. Conséquemment, cette étude a pour but d'évaluer l'effet de différents ratios oméga-3/6 sur la taille de l’infarctus, l’inflammation et l’apoptose dans le système limbique suite à un infarctus du myocarde. Des rats Sprague-Dawley ont été aléatoirement distribués dans trois groupes contenant des ratios 1:1, 1:5 et 5:1 oméga-3/6. Ils ont été nourris pendant 2 semaines, suivie d’une occlusion de l’artère coronaire gauche descendante pendant 40 minutes et d’une période de reperfusion (15 min et 24 h). De hauts ratios d’oméga-3 (5:1 et 1:1) diminuent significativement la taille de l’infarctus de 32 % et augmentent l’activité d’Akt, impliquée dans la voie cardioprotectrice RISK, comparativement au ratio 1:5. Ils diminuent aussi la concentration plasmatique de TNF-D. Dans le système limbique, l’activité de la caspase-3 est augmentée dans la région CA1, après 15 min, et dans les régions du CA1 et du gyrus dentelé (Gd), après 24 h, avec la diète 1:5 en comparaison aux diètes 1:1 et 5:1. L’activité enzymatique de la caspase-8 est augmentée dans le Gd, alors que dans le CA1, il y a une activité plus importante de la caspase-9 aux temps de reperfusion étudiés. Conclusion: Les diètes élevées en oméga-3/oméga-6 réduisent la taille de l'infarctus, l’inflammation et diminuent l’apoptose dans le système limbique après un infarctus du myocarde.

Alternative strategies for deciphering the genetic architecture of childhood Pre-B acute lymphoblastic leukemia

La leucémie lymphoblastique aigüe (LLA) est une maladie génétique complexe. Malgré que cette maladie hématologique soit le cancer pédiatrique le plus fréquent, ses causes demeurent inconnues. Des études antérieures ont démontrées que le risque à la LLA chez l’enfant pourrait être influencé par des gènes agissant dans le métabolisme des xénobiotiques, dans le maintient de l’intégrité génomique et dans la réponse au stress oxydatif, ainsi que par des facteurs environnementaux. Au cours de mes études doctorales, j’ai tenté de disséquer davantage les bases génétiques de la LLA de l’enfant en postulant que la susceptibilité à cette maladie serait modulée, au moins en partie, par des variants génétiques agissant dans deux voies biologiques fondamentales : le point de contrôle G1/S du cycle cellulaire et la réparation des cassures double-brin de l’ADN. En utilisant une approche unique reposant sur l’analyse d’une cohorte cas-contrôles jumelée à une cohorte de trios enfants-parents, j’ai effectué une étude d’association de type gènes/voies biologiques candidats. Ainsi, j’ai évaluer le rôle de variants provenant de la séquence promotrice de 12 gènes du cycle cellulaire et de 7 gènes de la voie de réparation de l’ADN, dans la susceptibilité à la LLA. De tels polymorphismes dans la région promotrice (pSNPs) pourraient perturber la liaison de facteurs de transcription et mener à des différences dans les niveaux d’expression des gènes pouvant influencer le risque à la maladie. En combinant différentes méthodes analytiques, j’ai évalué le rôle de différents mécanismes génétiques dans le développement de la LLA chez l’enfant. J’ai tout d’abord étudié les associations avec gènes/variants indépendants, et des essaies fonctionnels ont été effectués afin d’évaluer l’impact des pSNPs sur la liaison de facteurs de transcription et l’activité promotrice allèle-spécifique. Ces analyses ont mené à quatre publications. Il est peu probable que ces gènes de susceptibilité agissent seuls; j’ai donc utilisé une approche intégrative afin d’explorer la possibilité que plusieurs variants d’une même voie biologique ou de voies connexes puissent moduler le risque de la maladie; ces travaux ont été soumis pour publication. En outre, le développement précoce de la LLA, voir même in utero, suggère que les parents, et plus particulièrement la mère, pourraient jouer un rôle important dans le développement de cette maladie chez l’enfant. Dans une étude par simulations, j’ai évalué la performance des méthodes d’analyse existantes de détecter des effets fœto-maternels sous un design hybride trios/cas-contrôles. J’ai également investigué l’impact des effets génétiques agissant via la mère sur la susceptibilité à la LLA. Cette étude, récemment publiée, fût la première à démontrer que le risque de la leucémie chez l’enfant peut être modulé par le génotype de sa mère. En conclusions, mes études doctorales ont permis d’identifier des nouveaux gènes de susceptibilité pour la LLA pédiatrique et de mettre en évidence le rôle du cycle cellulaire et de la voie de la réparation de l’ADN dans la leucémogenèse. À terme, ces travaux permettront de mieux comprendre les bases génétiques de la LLA, et conduiront au développement d’outils cliniques qui amélioreront la détection, le diagnostique et le traitement de la leucémie chez l’enfant.

La représentation sociale des soins palliatifs chez un groupe de professionels de CLSC

Dans le contexte social actuel, l’identification et la compréhension de la représentation que les intervenants ont des soins palliatifs constituent l’un des points d’ancrage de l’agir professionnel, de la formation et des modifications de structures de soins. Le but de cette étude était de décrire et de comprendre la représentation qu’un groupe d’intervenants travaillant en CLSC a des soins palliatifs, puis de proposer des interventions éducatives et organisationnelles susceptibles de favoriser une plus forte adhésion à la philosophie qui sous-tend ce type particulier de soins. Des entretiens semi dirigés et une analyse de contenu ont révélé un univers de représentations à la fois similaires et différents dans chaque sous-groupe. On constate que chaque thème exploré peut prendre des sens divers. On peut dire que la représentation des soins palliatifs chez le groupe de professionnels de CLSC ayant participé à la présente étude constitue un ensemble de savoirs à portée pratique très élevée faisant intervenir en grande majorité des savoirs de sens commun. Un point se révèle crucial : celui de la formation dans l’appropriation de la philosophie des soins palliatifs qui devrait être à la base de cette pratique; une formation qui doit prendre en compte les multiples composantes non scientifiques et les ambiguïtés du travail quotidien en soins palliatifs comme faisant partie intégrante des dynamiques du processus d’appropriation de la philosophie des soins palliatifs.

Régulation de l'activité transcriptionnelle du récepteur nucléaire FXR par la ghréline et les modifications post-traductionnelles

Le récepteur X des farnésoïdes (FXR) fait partie de la superfamille des récepteurs nucléaires et agit comme un facteur de transcription suite à la liaison d’un ligand spécifique. Le récepteur FXR, activé par les acides biliaires, joue un rôle essentiel dans le métabolisme des lipides et du glucose en plus de réguler l’homéostasie des acides biliaires. Notre laboratoire a récemment mis en évidence une nouvelle voie de régulation du récepteur PPARγ en réponse au récepteur de la ghréline. En effet, la ghréline induit l’activation transcriptionnelle de PPARγ via une cascade de signalisation impliquant les kinases Erk1/2 et Akt, supportant un rôle périphérique de la ghréline dans les pathologies associées au syndrome métabolique. Il est de plus en plus reconnu que la cascade métabolique impliquant PPARγ fait également intervenir un autre récepteur nucléaire, FXR. Dans ce travail, nous montrons que la ghréline induit l’activation transcriptionnelle de FXR de manière dose-dépendante et induit également la phosphorylation du récepteur sur ses résidus sérine. En utilisant des constructions tronquées ABC et CDEF de FXR, nous avons démontré que la ghréline régule l’activité de FXR via les domaines d’activation AF-1 et AF-2. L’effet de la ghréline et du ligand sélectif GW4064 sur l’induction de FXR est additif. De plus, nous avons démontré que FXR est la cible d’une autre modification post-traductionnelle, soit la sumoylation. En effet, FXR est un substrat cellulaire des protéines SUMO-1 et SUMO-3 et la sumoylation du récepteur est ligand-indépendante. SUMO-1 et SUMO-3 induisent l’activation transcriptionnelle de FXR de façon dose-dépendante. Nos résultats indiquent que la lysine 122 est le site prédominant de sumoylation par SUMO-1, quoiqu’un mécanisme de coopération semble exister entre les différents sites de sumoylation de FXR. Avec son rôle émergeant dans plusieurs voies du métabolisme lipidique, l’identification de modulateurs de FXR s’avère être une approche fort prometteuse pour faire face à plusieurs pathologies associées au syndrome métabolique et au diabète de type 2.

Étude de la fonction anti-apoptotique de la sous-unité R1 de la ribonucléotide réductase des virus de l’herpès simplex

L’élimination des cellules infectées par apoptose constitue un mécanisme de défense antivirale. Les virus de l’herpès simplex (HSV) de type 1 et 2 encodent des facteurs qui inhibent l’apoptose induite par la réponse antivirale. La sous-unité R1 de la ribonucléotide réductase d’HSV-2 (ICP10) possède une fonction anti-apoptotique qui protège les cellules épithéliales de l’apoptose induite par les récepteurs de mort en agissant en amont ou au niveau de l’activation de la procaspase-8. Puisqu’une infection avec un mutant HSV-1 déficient pour la R1 diminue la résistance des cellules infectées vis à vis du TNFα, il a été suggéré que la R1 d’HSV-1 (ICP6) pourrait posséder une fonction anti-apoptotique. Le but principal de cette thèse est d’étudier le mécanisme et le potentiel de la fonction anti-apoptotique de la R1 d’HSV-1 et de la R1 d'HSV-2. Dans une première étude, nous avons investigué le mécanisme de la fonction anti-apoptotique de la R1 d’HSV en utilisant le TNFα et le FasL, deux inducteurs des récepteurs de mort impliqués dans la réponse immune anti-HSV. Cette étude a permis d’obtenir trois principaux résultats concernant la fonction anti-apoptotique de la R1 d’HSV. Premièrement, la R1 d’HSV-1 inhibe l’apoptose induite par le TNFα et par le FasL aussi efficacement que la R1 d’HSV-2. Deuxièmement, la R1 d’HSV-1 est essentielle à l’inhibition de l’apoptose induite par le FasL. Troisièmement, la R1 d’HSV interagit constitutivement avec la procaspase-8 d’une manière qui inhibe la dimérisation et donc l’activation de la caspase-8. Ces résultats suggèrent qu’en plus d’inhiber l’apoptose induite par les récepteurs de mort la R1 d’HSV peut prévenir l’activation de la caspase-8 induite par d’autres stimuli pro-apoptotiques. Les ARN double-brins (ARNdb) constituant un intermédiaire de la transcription du génome des HSV et activant l’apoptose par une voie dépendante de la caspase-8, nous avons testé dans une seconde étude l’impact de la R1 d’HSV sur l’apoptose induite par l’acide polyriboinosinique : polyribocytidylique (poly(I:C)), un analogue synthétique des ARNdb. Ces travaux ont montré qu’une infection avec les HSV protège les cellules épithéliales de l’apoptose induite par le poly(I:C). La R1 d’HSV-1 joue un rôle majeur dans l’inhibition de l’activation de la caspase-8 induite par le poly(I:C). La R1 d’HSV interagit non seulement avec la procaspase-8 mais aussi avec RIP1 (receptor interacting protein 1). En interagissant avec RIP1, la R1 d’HSV-2 inhibe l’interaction entre RIP1 et TRIF (Toll/interleukine-1 receptor-domain-containing adapter-inducing interferon β), l’adaptateur du Toll-like receptor 3 qui est un détecteur d’ARNdb , laquelle est essentielle pour signaler l’apoptose induite par le poly(I:C) extracellulaire et la surexpression de TRIF. Ces travaux démontrent la capacité de la R1 d’HSV à inhiber l’apoptose induite par divers stimuli et ils ont permis de déterminer le mécanisme de l’activité anti-apoptotique de la R1 d’HSV. Très tôt durant l’infection, cFLIP, un inhibiteur cellulaire de la caspase-8, est dégradé alors que la R1 d’HSV s’accumule de manière concomitante. En interagissant avec la procapsase-8 et RIP1, la R1 d’HSV se comporte comme un inhibiteur viral de l’activation de la procaspase-8 inhibant l’apoptose induite par les récepteurs de mort et les détecteurs aux ARNdb.

Fractionation, chemical and toxicological characterization of tobacco smoke components

La fumée du tabac est un aérosol extrêmement complexe constitué de milliers de composés répartis entre la phase particulaire et la phase vapeur. Il a été démontré que les effets toxicologiques de cette fumée sont associés aux composés appartenant aux deux phases. Plusieurs composés biologiquement actifs ont été identifiés dans la fumée du tabac; cependant, il n’y a pas d’études démontrant la relation entre les réponses biologiques obtenues via les tests in vitro ou in vivo et les composés présents dans la fumée entière du tabac. Le but de la présente recherche est de développer des méthodes fiables et robustes de fractionnement de la fumée à l’aide de techniques de séparation analytique et de techniques de détection combinés à des essais in vitro toxicologiques. Une étude antérieure réalisée par nos collaborateurs a démontré que, suite à l’étude des produits de combustion de douze principaux composés du tabac, l’acide chlorogénique s’est avéré être le composé le plus cytotoxique selon les test in vitro du micronoyau. Ainsi, dans cette étude, une méthode par chromatographie préparative en phase liquide a été développée dans le but de fractionner les produits de combustion de l’acide chlorogénique. Les fractions des produits de combustion de l’acide chlorogénique ont ensuite été testées et les composés responsables de la toxicité de l’acide chlorogénique ont été identifiés. Le composé de la sous-fraction responsable en majeure partie de la cytoxicité a été identifié comme étant le catéchol, lequel fut confirmé par chromatographie en phase liquide/ spectrométrie de masse à temps de vol. Des études récentes ont démontré les effets toxicologiques de la fumée entière du tabac et l’implication spécifique de la phase vapeur. C’est pourquoi notre travail a ensuite été focalisé principalement à l’analyse de la fumée entière. La machine à fumer Borgwaldt RM20S® utilisée avec les chambres d’exposition cellulaire de British American Tobacco permettent l’étude in vitro de l’exposition de cellules à différentes concentrations de fumée entière du tabac. Les essais biologiques in vitro ont un degré élevé de variabilité, ainsi, il faut prendre en compte toutes les autres sources de variabilité pour évaluer avec précision la finalité toxicologique de ces essais; toutefois, la fiabilité de la génération de la fumée de la machine n’a jamais été évaluée jusqu’à maintenant. Nous avons donc déterminé la fiabilité de la génération et de la dilution (RSD entre 0,7 et 12 %) de la fumée en quantifiant la présence de deux gaz de référence (le CH4 par détection à ionisation de flamme et le CO par absorption infrarouge) et d’un composé de la phase particulaire, le solanesol (par chromatographie en phase liquide à haute performance). Ensuite, la relation entre la dose et la dilution des composés de la phase vapeur retrouvée dans la chambre d’exposition cellulaire a été caractérisée en utilisant une nouvelle technique d’extraction dite par HSSE (Headspace Stir Bar Sorptive Extraction) couplée à la chromatographie en phase liquide/ spectrométrie de masse. La répétabilité de la méthode a donné une valeur de RSD se situant entre 10 et 13 % pour cinq des composés de référence identifiés dans la phase vapeur de la fumée de cigarette. La réponse offrant la surface maximale d’aire sous la courbe a été obtenue en utilisant les conditions expérimentales suivantes : intervalle de temps d’exposition/ désorption de 10 0.5 min, température de désorption de 200°C pour 2 min et température de concentration cryogénique (cryofocussing) de -75°C. La précision de la dilution de la fumée est linéaire et est fonction de l’abondance des analytes ainsi que de la concentration (RSD de 6,2 à 17,2 %) avec des quantités de 6 à 450 ng pour les composés de référence. Ces résultats démontrent que la machine à fumer Borgwaldt RM20S® est un outil fiable pour générer et acheminer de façon répétitive et linéaire la fumée de cigarette aux cultures cellulaires in vitro. Notre approche consiste en l’élaboration d’une méthodologie permettant de travailler avec un composé unique du tabac, pouvant être appliqué à des échantillons plus complexes par la suite ; ex : la phase vapeur de la fumée de cigarette. La méthodologie ainsi développée peut potentiellement servir de méthode de standardisation pour l’évaluation d’instruments ou de l’identification de produits dans l’industrie de tabac.

Analyse fonctionnelle du gène BMP-2 lors de la régénération du membre chez l’axolotl

Les amphibiens urodèles (e.g. les axolotls) possèdent la remarquable capacité de régénérer plusieurs parties de leur corps. Ils peuvent, entre autres, régénérer parfaitement un membre amputé par épimorphose, un processus biphasique comprenant une phase de préparation, spécifique à la régénération, et une phase de redéveloppement, commune à l’épimorphose et au développement embryonnaire. Durant la phase de préparation, les cellules du moignon se dédifférencient en cellules pseudo-embryonnaires, prolifèrent et migrent distalement au plan d’amputation pour former un blastème de régénération. Parmi les vertébrés, la dédifférenciation est unique aux urodèles. Afin de mieux comprendre le contrôle moléculaire de la régénération chez les urodèles, nous avons choisi d’étudier BMP-2, un facteur de croissance, en raison de son implication dans la régénération des phalanges distales chez les mammifères. Le facteur de transcription MSX-1 a également été sélectionné en raison de sa capacité à induire la dédifférenciation cellulaire in vitro et de son interaction potentielle avec la signalisation des BMPs. Les résultats présentés dans cette thèse démontrent que BMP-2 et MSX-1 sont exprimés lors des phases de préparation et de redéveloppement de l’épimorphose, et que leur profil d'expression spatio-temporel est très semblable, ce qui suggère une interaction de leurs signaux. En outre, chez les tétrapodes amniotes, l’expression de Shh est restreinte au mésenchyme postérieur des membres en développement et chevauche l’expression de BMP-2. Toutefois, l’expression de BMP-2 n’est pas restreinte à la région postérieure mais forme un gradient postéro-antérieur. Shh est le principal régulateur de la formation du patron de développement antéro-postérieur du ii membre. Étant donné les domaines d’expression chevauchants de BMP-2 et Shh et la restriction postérieure d’expression de Shh, on croit que Shh régule la formation du patron de développement de postérieur à antérieur par l’activation de l’expression de BMP-2. Fait intéressant, l’axolotl exprime également Shh dans la région postérieure, mais le développement des pattes se fait de la région antérieure à la région postérieure au lieu de postérieur à antérieur comme chez les autres tétrapodes, et ceci durant le développement et la régénération. Nous avons utilisé cette caractéristique de l’axolotl pour démontrer que la signalisation Shh ne structure pas l’autopode via BMP-2. En effet, l’expression de BMP-2 n'est pas régulée par l'inhibition de la signalisation Shh, et son expression est du côté opposé à celle de Shh durant le développement et la régénération des pattes de l’axolotl. Il a été observé durant le développement du membre chez la souris que MSX-1 est régulé par la signalisation Shh. Nos résultats ont démontrés que chez l’axolotl, MSX-1 ne semble pas régulé par l'inhibition de la signalisation Shh au cours de la régénération du membre. De plus, nous avons démontré que contrairement à l’expression de Shh, l’expression de BMP-2 est corrélée avec l’ordre de formation des phalanges, est impliquée dans la condensation cellulaire et dans l'apoptose précédant la chondrogenèse. L’ensemble de ces résultats suggère un rôle de BMP-2 dans l’initiation de l’ossification endochondrale. Enfin, nous avons démontré que la signalisation BMP est indispensable pour l’épimorphose du membre durant la phase de redéveloppement.

The role of Caulobacter crescentus XerC and XerD recombinases in site-specific recombination

XerC et XerD, deux recombinases impliquées dans la recombinaison site spécifique, résolvent les multimères d’ADN en monomères. Cette réaction se produit au niveau du site dif du chromosome, et nécessite le domaine C-terminale de la protéine de division cellulaire FtsK. Caulobacter crescentus est une bactérie aquatique de type Gram-négative qui se retrouve dans plusieurs environnements. Elle présente un cycle cellulaire asymétrique avec deux types de cellules distinctes. Cette propriété peut être utilisée pour synchroniser la croissance d’une population bactérienne pour permettre l’étude de l’expression de gènes à travers le temps et les liens entre le cycle cellulaire et le développement de la bactérie. La liaison à l’ADN et la capacité de former des complexes covalents (phosphotyrosyl) avec le site dif de C. crescentus (ccdif) ont été testé pour les recombinases de C. crescentus (ccXerC et ccXerD). Les deux recombinases ont eu une meilleure liaison au demi-site gauche de ccdif et sont incapable d’effectuer une liaison coopérative, contrairement à ce qui se produit au niveau du site dif de E. coli. La formation de complexes covalents a été testé en utilisant des «substrats suicides avec bris» marqués à la fluorescence ainsi que des protéines de fusion (marquées ou non à la fluorescence). Des complexes ADN-protéines résistants à la chaleur et au SDS ont été observé lors de la réaction de ccXerC et ccXerD de type sauvage avec ccdif, mais pas lors de la réaction de mutants avec le même ADN. Des complexes covalents phosphotyrosine sont formés de façon plus efficace sur les substrats suicides avec un bris au niveau du brin supérieur que ceux ayant un bris au niveau du brin inférieur. Dans les deux cas, c’est ccXerC qui est resté lié de façon covalente à l’ADN de ccdif.

Communication, développement et appropriation des médias émergents en Afrique francophone subsaharienne : approche critique

Cette thèse porte sur l’appropriation de l’Internet et du multimédias dans la population universitaire d’Afrique francophone, en l’an 2001. Elle couvre six pays : le Bénin, le Burkina Faso, le Cameroun, la Côte d’Ivoire, le Mali et le Togo. La recherche porte sur le recensement des centres de recherche démographique en Afrique francophone subsaharienne et sur une enquête auprès des universités de Yaoundé II et de Douala au Cameroun. La problématique de l’accès et de l’usage est centrale dans notre démarche. Elle est traduite dans la question de recherche suivante : « Dans un contexte dominé par les représentations des NTIC comme symboles de modernité et facteurs d’intégration à l’économie mondiale, quelles sont les modalités d’appropriation de ces technologies par les universitaires des institutions de l’enseignement et de la recherche en Afrique considérées dans cette étude ? » Pour aborder le matériel empirique, nous avons opté pour deux approches théoriques : les théories du développement en lien avec les (nouveaux) médias et la sociologie des innovations techniques. Enracinées dans la pensée des Lumières, complétée et affinée par les approches évolutionnistes inspirées de Spencer, le fonctionnalisme d’inspiration parsonienne et l’économie politique axée sur la pensée de W. W. Rostow, les théories du développement ont largement mis à contribution les théories de la communication pour atteindre leur objet. Alors que la crise de la modernité occidentale menace de délégitimer ces paradigmes, les technologies émergentes leur donnent une nouvelle naissance : dans la continuité de la pensée d’Auguste Comte, le développement est désormais pensé en termes d’intégration à un nouveau type de société, la société de l’information. Cette nouvelle promesse eschatologique et cette foi dans la technique comme facteur d’intégration à la société et à l’économie en réseau habitent tous les projets menés sur le continent, que ce soit le NEPAD, le Fond de solidarité numérique, le projet d’ordinateur à 100$ pour les enfants démunis ou le projet panafricain de desserte satellitaire, le RASCOM. Le deuxième volet de notre cadre de référence théorique est axé sur la sociologie des innovations techniques. Nous mobilisons la sociopolitique des usages de Vedel et Vitalis pour ramener la raison critique dans le débat sur le développement du continent africain, dans l’optique de montrer que la prérogative politique assumée par les États a encore sa place, si l’on veut que les ressources numériques servent à satisfaire les demandes sociales et non les seules demandes solvables essentiellement localisées dans les centres urbains. En refusant le déterminisme technique si courant dans la pensée sur le développement, nous voulons montrer que le devenir de la technique n’est pas inscrit dans son essence, comme une ombre portée, mais que l’action des humains, notamment l’action politique, peut infléchir la trajectoire des innovations techniques dans l’optique de servir les aspirations des citoyens. Sur le plan méthodologique, la démarche combine les méthodes quantitatives et les méthodes qualitatives. Les premières nous permettront de mesurer la présence d’Internet et du multimédia dans l’environnement des répondants. Les secondes nous aideront à saisir les représentations développées par les usagers au contact de ces outils. Dans la perspective socioconstructiviste, ces discours sont constitutifs des technologies, dans la mesure où ils sont autant de modalités d’appropriation, de construction sociale de l’usage. Ultimement, l’intégration du langage technique propre aux outils multimédias dans le langage quotidien des usagers traduit le dernier stade de cette appropriation. À travers cette recherche, il est apparu que les usagers sont peu nombreux à utiliser les technologies audiovisuelles dans le contexte professionnel. Quand à l’Internet et aux outils multimédias, leur présence et leurs usages restent limités, l’accès physique n’étant pas encore garanti à tous les répondants de l’étude. Internet suscite de grandes espérances, mais reste, là aussi, largement inaccessible en contexte professionnel, la majorité des usagers se rabattant sur les lieux publics comme les cybercafés pour pallier l’insuffisance des ressources au sein de leurs institutions d’appartenance. Quant aux représentations, elles restent encore largement tributaires des discours politiques et institutionnels dominants, selon lesquels l’avenir sera numérique ou ne sera pas. La thèse va cependant au-delà de ces données pour dessiner la carte numérique actuelle du continent, en intégrant dans la nouvelle donne technologique la montée fulgurante de la téléphonie cellulaire mobile. Il nous est apparu que l’Internet, dont la diffusion sur le continent a été plus que modeste, pourrait largement profiter de l’émergence sur le continent de la culture mobile, que favorise notamment la convergence entre les mini-portables et la téléphonie mobile.

Dégradation des membres de la famille du LDLR par la convertase PCSK9 : troisième locus de l'hypercholestérolémie familiale

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont les principales causes de mortalité et de morbidité à travers le monde. En Amérique du Nord, on estime à 90 millions le nombre d’individus ayant une ou plusieurs MCV, à près de 1 million le nombre de décès reliés par année et à 525 milliards de dollars les coûts directs et indirects en 2010. En collaboration avec l’équipe du Dre. Boileau, notre laboratoire a récemment identifié, le troisième locus impliqué dans l’hypercholestérolémie familiale. Une étude publiée dans le New Engl J Med a révélé que l’absence de la convertase PCSK9 réduit de 88% le risque de MCV, corrélé à une forte réduction du taux de cholestérol plasmatique (LDL-C). Il fut démontré que PCSK9 lie directement le récepteur aux lipoprotéines de faible densité (LDLR) et, par un mécanisme méconnu, favorise sa dégradation dans les endosomes/lysosomes provoquant ainsi une accumulation des particules LDL-C dans le plasma. Dans cet ouvrage, nous nous sommes intéressés à trois aspects bien distincts : [1] Quels sont les cibles de PCSK9 ? [2] Quelle voie du trafic cellulaire est impliquée dans la dégradation du LDLR par PCSK9 ? [3] Comment peut-on inhiber la fonction de PCSK9 ? [1] Nous avons démontré que PCSK9 induit la dégradation du LDLR de même que les récepteurs ApoER2 et VLDLR. Ces deux membres de la famille du LDLR (fortes homologies) sont impliqués notamment dans le métabolisme des lipides et de la mise en place de structures neuronales. De plus, nous avons remarqué que la présence de ces récepteurs favorise l’attachement cellulaire de PCSK9 et ce, indépendamment de la présence du LDLR. Cette étude a ouvert pour la première fois le spectre d’action de PCSK9 sur d’autres protéines membranaires. [2] PCSK9 étant une protéine de la voie sécrétoire, nous avons ensuite évalué l’apport des différentes voies du trafic cellulaire, soit extra- ou intracellulaire, impliquées dans la dégradation du LDLR. À l’aide de milieux conditionnées dérivés d’hépatocytes primaires, nous avons d’abord démontré que le niveau extracellulaire de PCSK9 endogène n’a pas une grande influence sur la dégradation intracellulaire du LDLR, lorsqu’incubés sur des hépatocytes provenant de souris déficientes en PCSK9 (Pcsk9-/-). Par analyses de tri cellulaire (FACS), nous avons ensuite remarqué que la surexpression de PCSK9 diminue localement les niveaux de LDLR avec peu d’effet sur les cellules voisines. Lorsque nous avons bloqué l’endocytose du LDLR dans les cellules HepG2 (lignée de cellules hépatiques pour l’étude endogène de PCSK9), nous n’avons dénoté aucun changement des niveaux protéiques du récepteur. Par contre, nous avons pu démontrer que PCSK9 favorise la dégradation du LDLR par l’intermédiaire d’une voie intracellulaire. En effet l’interruption du trafic vésiculaire entre le réseau trans-Golgien (RTG) et les endosomes (interférence à l’ARN contre les chaînes légères de clathrine ; siCLCs) prévient la dégradation du LDLR de manière PCSK9-dépendante. [3] Par immunobuvardage d’affinité, nous avons identifié que la protéine Annexine A2 (AnxA2) interagit spécifiquement avec le domaine C-terminal de PCSK9, important pour son action sur le LDLR. Plus spécifiquement, nous avons cartographié le domaine R1 (acides aminés 34 à 108) comme étant responsable de l’interaction PCSK9AnxA2 qui, jusqu’à présent, n’avait aucune fonction propre. Finalement, nous avons démontré que l’ajout d’AnxA2 prévient la dégradation du LDLR induite par PCSK9. En somme, nos travaux ont pu identifier que d’autres membres de la famille du LDLR, soit ApoER2 et VLDLR, sont sensibles à la présence de PCSK9. De plus, nous avons mis en évidence que l’intégrité du trafic intracellulaire est critique à l’action de PCSK9 sur le LDLR et ce, de manière endogène. Finalement, nous avons identifié l’Annexine A2 comme unique inhibiteur naturel pouvant interférer avec la dégradation du LDLR par PCSK9. Il est indéniable que PCSK9 soit une cible de premier choix pour contrer l’hypercholestérolémie afin de prévenir le développement de MCV. Cet ouvrage apporte donc des apports considérables dans notre compréhension des voies cellulaires impliquées, des cibles affectées et ouvre directement la porte à une approche thérapeutique à fort potentiel.