Régulation de l’expression de HYAL-1 par le récepteur de l’oestrogène alpha

HYAL-1 (hyaluronidase-1) appartient à la famille des hyaluronidases connues pour leur rôle dans la dégradation de l’acide hyaluronique. L’expression de HYAL-1 est élevée dans de nombreux type de cancers, notamment dans le cancer de la prostate, de la vessie, des reins et du sein où il est impliqué dans la croissance tumorale et les métastases. Récemment notre laboratoire a aussi démontré une expression élevée de HYAL-1 dans le cancer épithélial de l’ovaire (CEO) de type mucineux et à cellules claires, expression qui est inversement corrélée à celle du récepteur de l’oestrogène alpha (REα). Cependant, malgré le fait que le rôle de HYAL-1 dans le cancer soit bien établit, le mécanisme de sa régulation reste encore inconnu. Le REα est un facteur de transcription qui suite à sa liaison avec son ligand va réguler l’expression de plusieurs gènes. Le REα ainsi stimulé par l’hormone va activer la transcription de ces gènes cibles mais il est connu maintenant qu’une grande partie des gènes régulés par le REα sont en réalité réprimés par ce récepteur. Dans ce travail nous proposons d’étudier le mécanisme de la régulation du gène HYAL-1 par le REα dans le CEO à cellules claires et dans le cancer du sein. L’expression ectopique du REα dans la lignée TOV21G (RE-) de même que le traitement de la lignée MCF-7 (RE+) avec de l’oestrogène a induit une diminution du niveau d’expression de l’ARN m de HYAL-1. Ces résultats nous ont permis de confirmer que HYAL-1 est un gène cible du REα. Il est aussi connu que le REα peut exercer son action par différents mécanismes d’action, entre autres en interagissant avec une séquence d’ADN appelée élément de réponse à l’oestrogène (ERE), retrouvé sur le promoteur des gènes cibles ou bien indirectement par des interactions protéine-protéine en se liant à d’autres facteur de transcription tels que Sp1. Après avoir identifiés de telles séquences sur le promoteur proximal de HYAL-1, (1 ERE proximal à -900 pb, 3 distaux à -32350 pb, 48430, -50130 pb du site d’initiation de la transcription) en plus des 2 Sp1 connus (-60 et – 1020pb), nous avons démontrés par immunoprécipitation de la chromatine que le REα est recruté sur le promoteur de HYAL-1 au niveau de l’ERE proximal -900 pb et du distal -32350 pb de même que sur le site Sp1 -1020 pb. De plus, l’activité biologique de l’ERE -900 pb et du ii Sp1-1020pb à été confirmée par des essais de gènes rapporteurs à la luciférase. Avec son rôle connu dans la tumorigenèse, l’identification de HYAL-1 comme gène cible du REα pourrait être une avenue intéressante pour le traitement des cancers hormono-indépendants.

Caractérisation des complexes ribonucléoprotéiques de Staufen1 et Staufen2

Dans la cellule, chaque ARNm se doit d’être régulé finement au niveau transcriptionnel, bien entendu, mais également au niveau de sa traduction, de sa dégradation ainsi que de sa localisation intracellulaire, et ce, afin de permettre l’expression de chaque produit protéique au moment et à l’endroit précis où son action est requise. Lorsqu’un mécanisme physiologique est mis de l’avant dans la cellule, il arrive souvent que plusieurs ARNm se doivent d’être régulés simultanément. L’un des moyens permettant d’orchestrer un tel processus est de réguler l’action d’une protéine commune associée à chacun de ces ARNm, via un mécanisme post-traductionnel par exemple. Ainsi l’expression d’un groupe précis d’ARNm peut être régulée finement dans le temps et dans l’espace selon les facteurs protéiques auxquels il est associé. Dans l’optique d’étudier certains de ces complexes ribonucléoprotéiques (mRNP), nous nous sommes intéressés aux isoformes et paralogues de Staufen, une protéine à domaine de liaison à l’ARN double-brin (dsRBD) impliquée dans de nombreux aspects de la régulation post-transcriptionnelle, tels la dégradation, la traduction ou encore la localisation d’ARNm. Chez la drosophile, un seul gène Staufen est exprimé alors que chez les mammifères, il existe deux paralogues de la protéine, soit Stau1 et Stau2, tous deux possédant divers isoformes produits suite à l’épissage alternatif de leur gène. Stau1 et Stau2 sont identiques à 50%. Les deux isoformes de Stau2, Stau259 et Stau262 ne diffèrent qu’en leur extrémité N-terminale. En effet, alors que Stau259 arbore un dsRBD1 tronqué, celui de Stau262 est complet. Ces observations introduisent une problématique très intéressante à laquelle nous nous sommes attaqué : ces différentes protéines, quoique très semblables, font-elles partie de complexes ribonucléoprotéiques distincts ayant des fonctions propres à chacun ou, au contraire, vu cette similarité de séquence, travaillent-elles de concert au sein des mêmes complexes ribonucléoprotéiques? Afin d’adresser cette question, nous avons entrepris d’isoler, à partir de cellules HEK293T, les différents complexes de Stau1 et Stau2 par la technique d’immunoprécipitation. Nous avons isolé les ARNm associés à chaque protéine, les avons identifiés grâce aux micropuces d’ADN et avons confirmé nos résultats par RT-PCR. Malgré la présence d’une population commune d’ARNm associée à Stau1 et Stau2, la majorité des transcrits identifiés furent spécifiques à chaque orthologue. Cependant, nous avons remarqué que les diverses populations d’ARNm participaient aux mêmes mécanismes de régulation, ce qui suggère que ces deux protéines possèdent des rôles complémentaires dans la mise en œuvre de divers phénomènes cellulaires. Au contraire, les transcrits associés à Stau259 et Stau262 sont davantage similaires, indiquant que celles-ci auraient des fonctions plutôt semblables. Ces résultats sont très intéressants, car pour la première fois, nous avons identifié des populations d’ARNm associées aux isoformes Stau155, Stau259 et Stau262. De plus, nous les avons analysées en parallèle afin d’en faire ressortir les populations spécifiques à chacune de ces protéines. Ensuite, connaissant l’importance de Stau2 dans le transport dendritique d’ARNm, nous avons cherché à caractériser les complexes ribonucléoprotéiques neuronaux associés à celle-ci. Dans un premier temps et à l’aide de la technique d’immunoprécipitation, nous avons identifié une population d’ARNm neuronaux associés à Stau2. Plus de 1700 ARNm montraient une présence d’au moins huit fois supérieure dans le précipité obtenu avec l’anticorps anti-Stau2 par rapport à celui obtenu avec le sérum pré-immun. Ces ARNm codent pour des protéines impliquées dans des processus de modifications post-traductionnelles, de traduction, de transport intracellulaire et de métabolisme de l’ARN. De façon intéressante, cette population d’ARNm isolée du cerveau de rat est relativement différente de celle caractérisée des cellules humaines HEK293T. Ceci suggère que la spécificité d’association Stau2-ARNm peut diffèrer d’un tissu à un autre. Dans un deuxième temps, nous avons isolé les protéines présentes dans les complexes ribonucléoprotéiques obtenus de cerveaux de rat et les avons identifiées par analyse en spectrométrie de masse. De cette façon, nous avons identifié au sein des particules de Stau2 des protéines liant l’ARN (PABPC1, hnRNPH1, YB1, hsc70), des protéines du cytosquelette (α- et β-tubuline), de même que la protéine peu caractérisée RUFY3. En poussant davantage la caractérisation, nous avons établi que YB1 et PABPC1 étaient associées à Stau2 grâce à la présence de l’ARN, alors que la protéine hsc70, au contraire, interagissait directement avec celle-ci. Enfin, cette dernière association semble être modulable par l’action de l’ATP. Ce résultat offre de nombreuses possibilités quant à la régulation de la fonction de Stau2 et/ou de son mRNP. Entre autres, cette étude suggère un mécanisme de régulation de la traduction au sein de ces particules. Pour faire suite à la caractérisation des mRNP de Stau, nous avons voulu déterminer au niveau neurophysiologique l’importance de ceux-ci. Comme l’étude de Stau2 avait déjà été entreprise préalablement par un autre laboratoire, nous avons décidé de concentrer notre étude sur le rôle de Stau1. Ainsi, nous avons démontré que celle-ci était nécessaire à la mise en place d’une forme de plasticité synaptique à long terme, la forme tardive de potentialisation à long terme ou L-LTP, dépendante de la transcription et de l’activité des récepteurs NMDA. La transmission de base, de même que la faculté de ces épines à faire de la E-LTP, la forme précoce de potentialisation à long terme, et la dépression à long terme ou LTD sont conservées. Ceci indique que les épines conservent la capacité d’être modulées. Ainsi, l’inhibition de la L-LTP, suite à la sous-expression de Stau1, n’est pas simplement due à la perte d’éléments fonctionnels, mais réside plutôt dans l’incapacité de ceux-ci à induire les changements synaptiques spécifiquement nécessaires à la mise en place de la L-LTP. De plus, au niveau synaptique, la sous-expression de Stau1 réduit à la fois l’amplitude et la fréquence des mEPSC. Ces résultats concordent avec l’observation que la sous-expression de Stau1 augmente significativement la proportion d’épines allongées et filopodales, des épines formant des synapses dites silencieuses. Par le fait même, elle diminue le nombre d’épines fonctionnelles, de forme dite normale. Ainsi, nous avons été en mesure de démontrer que l’absence, au niveau neuronal, de la protéine Stau1 induisait un déficit probable dans la localisation et/ou la traduction d’ARNm responsable de la restructuration de l’épine et de facteurs nécessaires à la mise en place de la L-LTP. En conclusion, nous avons participé à lever le voile sur la composition et l’importance des complexes ribonucléoprotéiques de Stau1 et Stau2. Nous avons identifié des populations distinctes et communes d’ARNm associées aux différents isoformes de Stau, à partir des mRNP présents au sein des cellules HEK293. De plus, nous avons réussi à mettre à l’avant plan certaines composantes des mRNP neuronaux de Stau2, dont un partenaire protéique direct, hsc70, partenaire dont l’association est modulable par l’action de l’ATP, ainsi qu’une population neuronale de transcrits d’ARNm. Enfin, nous avons mis en lumière l’importance de Stau1 dans la morphologie des épines dendritiques ainsi que dans le phénomène de la plasticité synaptique.

The overexpression of the efflux pump Tpo1 leads to the bleomycin resistance in Saccharomyces cerevisiae.

La bléomycine est un antibiotique cytotoxique, son potentiel génotoxique est plus important quand elle est utilisée en combinaison avec des agents antinéoplasiques sur le cancer testiculaire, que sur les autres types qui développent souvent une résistance envers la drogue. Notre but consiste alors de mettre en évidence ce mécanisme de résistance en utilisant l’organisme modèle Saccharomyces cerevisiae. Nous avons démontré au sein de notre laboratoire, que les levures délétées au niveau de leur coactivateur transcriptionnel Imp2, présentent une hypersensibilité à la bléomycine, en raison de son accumulation toxique dans la cellule. Ceci suggère que Imp2 pourrait réguler l’expression d’une ou de plusieurs pompes à efflux, capables d’expulser la bléomycine à l’extérieur de la cellule. Pour tester notre hypothèse, nous avons recherché des suppresseurs multicopies capables de restaurer la résistance à la bléomycine chez le mutant imp2, et c’est ainsi que nous avons identifié l'activateur transcriptionnel Yap1. Ce dernier se lie à une région spécifique localisée au niveau du promoteur et permet d’activer l'expression d'un sous-ensemble de gènes, codant pour des pompes à efflux, impliquées dans la résistance aux drogues. Selon la littérature, au moins 27 pompes à efflux ont été identifiées chez la levure Saccharomyces cerevisiae, certaines d’entre elles disposent du site de liaison pour Yap1, tels que Qdr3, Tpo2 et Tpo1. Afin de déterminer si une de ces pompes expulse la bléomycine, nous avons créé des mutations simples et doubles en combinaison avec IMP2, aussi nous avons verifié si les mutants étaient sensibles à la drogue et enfin, nous avons testé si la surexpression de Yap1 pouvait restaurer le phénotype sauvage chez ces mutants, via l’activation de pompes à efflux.

Implications des canaux K+ sur la régulation génique du canal ENaC, et impact de l'hyperglycémie sur le transport ionique et la réparation de l'épithélium respiratoire

Dans mon projet de doctorat, j’ai étudié des fonctions primordiales de l’épithélium respiratoire telles que la régulation du transport ionique, la clairance liquidienne et la réparation épithéliale. J’ai particulièrement mis l’emphase sur le rôle des canaux potassiques qui interviennent dans ces trois fonctions de l’épithélium respiratoire. J’ai tout d’abord prouvé que la modulation des canaux potassiques régulait l’activité du promoteur de αENaC, en partie via la voie de signalisation ERK1/2, dans des cellules alvéolaires. Cette régulation entraîne une variation de l’expression génique et protéique du canal ENaC. Physiologiquement, il en résulte une augmentation du phénomène de clairance liquidienne suite à l’activation des canaux K+, tandis que l’inhibition de ces canaux la diminue sévèrement. J’ai aussi pu démontrer que l’absence de canal KvLQT1 entraînait une diminution du courant (ENaC) sensible à l’amiloride, dans les cellules de trachée en culture primaire, isolées de souris KO pour kcnq1. Dans la seconde partie de mon étude, j’ai évalué l’impact de l’hyperglycémie sur la capacité de transport ionique et de réparation de cellules épithéliales bronchiques saines ou Fibrose Kystique. Mes résultats montrent que l’hyperglycémie diminue le transport transépithélial de chlore et le transport basolatéral de potassium. Des études préalables du laboratoire ayant montré que les canaux K+ et Cl- contrôlent les processus de réparation, j’ai donc évalué si ceux-ci étaient modifiés par l’hyperglycémie. Et en effet, l’hyperglycémie ralentit la vitesse de réparation des cellules issues des voies aériennes (CFBE-wt et CFBE-ΔF508). J’ai donc démontré que le transport de potassium intervenait dans des fonctions clés de l’épithélium respiratoire, comme dans la régulation génique de canaux ioniques, le contrôle de la clairance liquidienne alvéolaire, et que l’hyperglycémie diminuait le transport ionique (K+ et Cl-) et la réparation épithéliale.

Effet de la température sur les interactions trophiques et intraguildes au sein d’un système plante-herbivore-ennemis naturels : modélisation et approches expérimentales

Doctorat réalisé en cotutelle entre l'Université de Montréal et l'Université Paul Sabatier-Toulouse III

Implication de la protéine tyrosine phosphatase DEP-1 dans la perméabilité vasculaire induite par le VEGF

La perméabilité vasculaire est une caractéristique cruciale de l’angiogenèse. Les acteurs principaux sont les cellules endothéliales qui la régulent en réponse à divers facteurs perméabilisant, tels que le « Vascular Endothelial Growth Factor » (VEGF). Dans le contexte pathologique du cancer, les cellules tumorales produisent de grandes quantités de VEGF qui stimulent la perméabilité, ce qui leur permet d’infiltrer le réseau vasculaire. Il est connu que la tyrosine kinase Src contrôle cette modulation de la perméabilité. Puisque notre laboratoire a préalablement démontré que la phosphatase de type récepteur (PTP) DEP-1 est impliquée dans l’activation de Src en réponse au VEGF, nous avons émis l'hypothèse que DEP-1 pourrait aussi jouer un rôle dans la perméabilité des cellules endothéliales. Grâce à des expériences de transfections d’ARN interférant, nous démontrons que DEP-1 est important pour la régulation de la phosphorylation de la VE-Cadhérine, un médiateur critique de la perméabilité. L’impact de DEP-1 sur la dissociation de jonctions intercellulaires est également démontré par microscopie à immunofluorescence de cellules endothéliales. DEP-1 est également nécessaire à l’augmentation de la perméabilité induite par VEGF in vitro. Deux résidus tyrosine retrouvés dans la queue carboxy-terminale de DEP-1 sont essentiels à l’activation de Src en réponse au VEGF. Suite à la transfection d’un plasmide encodant DEP-1 muté pour ces deux résidus, nous démontrons aussi leur implication dans la régulation de la perméabilité in vitro par DEP-1. Ces travaux permettent ainsi d’approfondir nos connaissances sur un nouveau régulateur potentiel de la perméabilité vasculaire.

Identification de facteurs nucléaires modifiant l'activité des cellules souches hématopoïétiques

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont rares, mais indispensables pour soutenir la production des cellules matures du sang, un tissu en constant renouvellement. Deux caractéristiques principales les définissent; la propriété d’auto-renouvellement (AR), ou la capacité de préserver leur identité cellulaire suivant une division, et la multipotence, ce potentiel de différentiation leur permettant de générer toutes les lignée hématopoïétiques. De par leurs attributs, les CSH sont utilisée en thérapie cellulaire dans le domaine de la transplantation. Une organisation tissulaire hiérarchique est aussi préservée dans la leucémie, ou cancer du sang, une masse tumorale hétérogène devant être maintenue par une fraction de cellules au potentiel prolifératif illimité, les cellules souches leucémiques (CSL). Les travaux présentés dans ce manuscrit visent à explorer les bases moléculaires de l’AR, encore mal définies. Certains membres de la famille des facteurs de transcription à homéodomaine HOX sont impliqués dans la régulation de l’hématopoïèse normale, et leur dérégulation peut contribuer à la transformation leucémique. En particulier, la surexpression du gène Hoxb4 dans les CSH influence leur destin cellulaire, favorisant des divisions d’auto-renouvellement et leur expansion en culture et in vivo. En général, les CSH s’épuisent rapidement lorsque maintenue hors de leur niche ex vivo. Différents facteurs interagissent avec les HOX et modulent leur liaison à l’ADN, dont la famille des protéines TALE (Three Amino acid Loop Extension), comme MEIS1 et PBX1. En utilisant une stratégie de surexpression combinée de Hoxb4 et d’un anti-sens de Pbx1 dans les CSH, générant ainsi des cellules Hoxb4hiPbx1lo, il est possible de majorer encore d’avantage leur potentiel d’AR et leur expansion in vitro. Les CSH Hoxb4hiPbx1lo demeurent fonctionnellement intactes malgré une modulation extrême de leur destin cellulaire en culture. Les niveaux d’expressions de facteurs nucléaires, seules ou en combinaison, peuvent donc s’avérer des déterminants majeurs du destin des CSH. Afin d’identifier d’autres facteurs nucléaires potentiellement impliqués dans le processus d’AR des CSH, une stratégie permettant d’évaluer simultanément plusieurs gènes candidats a été élaborée. Les progrès réalisés en termes de purification des CSH et de leur culture en micro-puits ont facilité la mise au point d’un crible en RNAi (interférence de l’ARN), mesurant l’impact fonctionnel d’une diminution des niveaux de transcrits d’un gène cible sur l’activité des CSH. Les candidats sélectionnés pour cette étude font partie du grand groupe des modificateurs de la chromatine, plus précisément la famille des histones déméthylases (HDM) contenant un domaine catalytique Jumonji. Ce choix repose sur la fonction régulatrice de plusieurs membres de complexes méthyl-transférases sur l’AR des CSH, dont l’histone méthyl-transférases MLL (Mixed Lineage Leukemia). Cette stratégie a aussi été utilisée dans le laboratoire pour étudier le rôle de facteurs d’asymétrie sur le destin des CSH, en collaboration. Ces études ont permis d’identifier à la fois des régulateurs positifs et négatifs de l’activité des CSH. Entre autre, une diminution de l’expression du gène codant pour JARID1B, une HDM de la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4), augmente l’activité des CSH et s’accompagne d’une activation des gènes Hox. En conclusion, divers déterminants nucléaires, dont les facteurs de transcription et les modificateurs de la chromatine peuvent influencer le destin des CSH. Les mécanismes sous-jacents et l’identification d’autres modulateurs de l’AR demeurent des voies à explorer, pouvant contribuer éventuellement aux stratégies d’expansion des CSH ex vivo, et l’identification de cibles thérapeutiques contre les CSL. Mots-clés : cellules souches hématopoïétiques, Hoxb4, Pbx1, auto-renouvellement, histone déméthylases, RNAi

Écologie saisonnière des parasitoïdes des oeufs de l'arpenteuse de la pruche

Cette étude porte sur l’écologie saisonnière des parasitoïdes des œufs de l’arpenteuse de la pruche (Lepidoptera : Geometridae), un important défoliateur du Québec (Canada). Premièrement, nous décrivons les patrons saisonniers de parasitisme d’hôtes sentinelles par Telenomus coloradensis, T. droozi, T. flavotibiae (Hymenoptera : Scelionidae), et Trichogramma spp., dans la région du Bas-Saint-Laurent. Telenomus flavotibiae et Trichogramma spp. parasitent rarement les œufs de l’arpenteuse de la pruche alors que T. coloradensis et T. droozi sont très abondants au printemps. En laboratoire, la convenance des hôtes pour T. coloradensis diminue rapidement avec leur développement embryonnaire au printemps, affectant négativement les niveaux de parasitisme, ainsi que la survie, la taille, le temps de développement et la longévité de la progéniture. Telenomus coloradensis et T. droozi sont actifs très tôt en saison, alors que les températures sont froides (4°C) pour profiter du développement embryonnaire peu avancé de l’hôte. À partir de paramètres empiriques, nous estimons que la progéniture de T. coloradensis issue du parasitisme printanier émerge au milieu de l’été, alors que l’hôte est totalement absent de l’environnement forestier. La nouvelle génération de femelles serait donc susceptible d’entrer précocement en diapause reproductive. D’ailleurs, nos résultats de laboratoire démontrent qu’une période de privation d’hôtes affecte négativement l’activité parasitaire de T. coloradensis. Ce phénomène pourrait expliquer les niveaux très faibles de parasitisme des œufs de l’arpenteuse de la pruche à l’automne. Étonnamment toutefois, les hôtes en début de diapause (à l’automne) sont de meilleure qualité énergétique que les hôtes en post-diapause (au printemps). Alors que des études précédentes ont démontré que T. coloradensis peut survivre à l’hiver en tant qu’immature à l’intérieur des hôtes, nos résultats indiquent que ce sont principalement les femelles fertilisés qui passent l’hiver en diapause reproductive, avec un point de surfusion automnal moyen de -30,6°C.

The evolution of inter-genomic variation in arbuscular mycorrhizal fungi

Contexte: Les champignons mycorhiziens à arbuscules (AMF) établissent des relations symbiotiques avec la plupart des plantes grâce à leurs réseaux d’hyphes qui s’associent avec les racines de leurs hôtes. De précédentes études ont révélé des niveaux de variation génétique extrêmes pour des loci spécifiques permettant de supposer que les AMF peuvent contenir des milliers de noyaux génétiquement divergents dans un même cytoplasme. Si aucun processus de reproduction sexuée n’a jusqu’ici été observé chez ces mycorhizes, on constate cependant que des niveaux élevés de variation génétique peuvent être maintenus à la fois par l’échange de noyaux entre hyphes et par des processus fréquents de recombinaison entre noyaux. Les AMF se propagent par l’intermédiaire de spores qui contiennent chacune un échantillon d’une population initiale de noyaux hétérogènes, directement hérités du mycélium parent. À notre connaissance les AMF sont les seuls organismes qui ne passent jamais par un stade mononucléaire, ce qui permet aux noyaux de diverger génétiquement dans un même cytoplasme. Ces aspects singuliers de la biologie des AMF rendent l’estimation de leur diversité génétique problématique. Ceci constitue un défi majeur pour les écologistes sur le terrain mais également pour les biologistes moléculaires dans leur laboratoire. Au-delà même des problématiques de diversité spécifique, l’amplitude du polymorphisme entre noyaux mycorhiziens est mal connue. Le travail proposé dans ce manuscrit de thèse explore donc les différents aspects de l’architecture génomique singulière des AMF. Résultats L’ampleur du polymorphisme intra-isolat a été déjà observée pour la grande sous-unité d’ARN ribosomal de l’isolat Glomus irregulare DAOM-197198 (précédemment identifié comme G. intraradices) et pour le gène de la polymerase1-like (PLS) de Glomus etunicatum isolat NPI. Dans un premier temps, nous avons pu confirmer ces résultats et nous avons également pu constater que ces variations étaient transcrites. Nous avons ensuite pu mettre en évidence la présence d’un goulot d’étranglement génétique au moment de la sporulation pour le locus PLS chez l’espèce G. etunicatum illustrant les importants effets d’échantillonnage qui se produisaient entre chaque génération de spore. Enfin, nous avons estimé la différentiation génétique des AMF en utilisant à la fois les réseaux de gènes appliqués aux données de séquençage haut-débit ainsi que cinq nouveaux marqueurs génomiques en copie unique. Ces analyses révèlent que la différenciation génomique est présente de manière systématique dans deux espèces (G. irregulare et G. diaphanum). Conclusions Les résultats de cette thèse fournissent des preuves supplémentaires en faveur du scénario d’une différenciation génomique entre noyaux au sein du même isolat mycorhizien. Ainsi, au moins trois membres du genre Glomus, G. irregulare, G. diaphanum and G. etunicatum, apparaissent comme des organismes dont l’organisation des génomes ne peut pas être décrit d’après un modèle Mendélien strict, ce qui corrobore l’hypothèse que les noyaux mycorhiziens génétiquement différenciés forment un pangenome.

Post orthodontic effects of SARPE on sleep-disordered breathing in young adults as observed in a sleep laboratory

Introduction: L’expansion palatine du maxillaire a beaucoup d’effets positifs sur la respiration et la qualité du sommeil, mais peu d'études ont examiné ces données sur des adultes ayant dépassé l’âge permettant de bénéficier d'une expansion palatine conventionnelle. Le but de cette recherche est d’évaluer la stabilité de l’EPRAC (expansion palatine rapide assistée chirurgicalement) et son effet sur les troubles respiratoires après l’ablation des appareils orthodontiques. Méthodes: Neuf patients (Âge moyen 21, entre 16-39 ans) nécessitant une EPRAC ont passé des nuits dans un laboratoire de sommeil, et ce avant l’EPRAC, après l’EPRAC, et après l’ablation des appareils fixes. Les radiographies céphalométriques postéroantérieures ainsi que les modèles d’étude ont été pris pendant ces trois périodes de temps. Résultats: L’analyse des modèles d’étude a démontré une récidive significative au niveau des distances inter-molaires et inter-canines au niveau du maxillaire seulement. Les analyses céphalométriques ont démontré une récidive au niveau de la largeur maxillaire. Aucun changement important n'a été observé dans les stades de sommeil, mais une réduction importante dans l’index de ronflement a été notée. De plus, il y avait moins de changements entre les stades de sommeil. Conclusions: La récidive squelettique est minime et cliniquement non significative. Par contre, les changements dans les distances intermolaires et intercanines sont cliniquement importants. Il semble également qu'une EPRAC ait un effet positif sur la qualité de sommeil par la réduction de l’indice de ronflement ainsi que sur la diminution des changements entre les stades de sommeil.

Implémentation de la répartition de charge et du mode TOT pour la simulation d’un détecteur Timepix à pixels

Les détecteurs à pixels Medipix ont été développés par la collaboration Medipix et permettent de faire de l'imagerie en temps réel. Leur surface active de près de $2\cm^2$ est divisée en 65536~pixels de $55\times 55\um^2$ chacun. Seize de ces détecteurs, les Medipix2, sont installés dans l'expérience ATLAS au CERN afin de mesurer en temps réel les champs de radiation produits par les collisions de hadrons au LHC. Ils seront prochainement remplacés par des Timepix, la plus récente version de ces détecteurs, qui permettent de mesurer directement l'énergie déposée dans chaque pixel en mode \textit{time-over-threshold} (TOT) lors du passage d'une particule dans le semi-conducteur. En vue d'améliorer l'analyse des données recueillies avec ces détecteurs Timepix dans ATLAS, un projet de simulation Geant4 a été amorcé par John Id\'{a}rraga à l'Université de Montréal. Dans le cadre de l'expérience ATLAS, cette simulation pourra être utilisée conjointement avec Athena, le programme d'analyse d'ATLAS, et la simulation complète du détecteur ATLAS. Sous l'effet de leur propre répulsion, les porteurs de charge créés dans le semi-conducteur sont diffusés vers les pixels adjacents causant un dépôt d'énergie dans plusieurs pixels sous l'effet du partage de charges. Un modèle effectif de cette diffusion latérale a été développé pour reproduire ce phénomène sans résoudre d'équation différentielle de transport de charge. Ce modèle, ainsi que le mode TOT du Timepix, qui permet de mesurer l'énergie déposée dans le détecteur, ont été inclus dans la simulation afin de reproduire adéquatement les traces laissées par les particules dans le semi-conducteur. On a d'abord étalonné le détecteur pixel par pixel à l'aide d'une source de $\Am$ et de $\Ba$. Ensuite, on a validé la simulation à l'aide de mesures d'interactions de protons et de particules $\alpha$ produits au générateur Tandem van de Graaff du Laboratoire René-J.-A.-Lévesque de l'Université de Montréal.

Caractérisation et délétion de tous les systèmes d'adhésion connus de Salmonella enterica sérovar Typhi

Les fimbriae sont des structures protéiques extracellulaires retrouvées chez une vaste diversité de bactéries. Ces structures ont fait l’objet de nombreuses études et sont maintenant reconnus pour leur implication dans l’adhésion et l’invasion aux cellules eucaryotes, mais aussi dans la production de biofilms. Ils sont groupés selon leur voie de sécrétion. Certains utilisent une machinerie spécifique et individuelle, c’est le cas des pili de type IV, tandis que d’autres utilisent la voie de sécrétion générale suivit d’une voie spécifique telle que la voie du chaperon-placier (« Chaperon Usher Pathway ») (fimbriae CUP) ou la voie de nucléation précipitation (« nucleation precipitation pathway ») (Curli). Malgré toutes les connaissances actuelles concernant les fimbriae, très peu d’informations sont disponibles quant aux fimbriae de Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi). Ce pathogène unique à l’homme est l’agent étiologique de la fièvre typhoïde. Puisque les fimbriae sont reconnus pour être impliqués dans l’adaptation à l’hôte, nous avons décidé d’étudier davantage l’arsenal fimbriaire de S. Typhi, dans l’espoir d’identifier des facteurs de virulence uniques à S. Typhi et impliqués dans la ségrégation de l’hôte. La souche S. Typhi ISP1820 possède 14 opérons codant pour des systèmes d’adhésion, mais plusieurs contiennent des pseudogènes et leur expression n’a jamais été observée in vitro. Afin d’étudier les systèmes d’adhésion de S. Typhi, nous avons supprimé chaque opéron du génome individuellement et cumulativement à l’aide une technique de mutagénèse par échange allélique. Ainsi, nous avons testé chaque mutant individuel et la souche mutante pour tous les systèmes d’adhésion dans plusieurs essais tels que des infections de cellules épithéliales et de macrophages, de mobilité et de formation de biofilm. Nous avons aussi évalué l’expression des fimbriae lors de différentes conditions de croissance en laboratoire par RT-PCR. Tous les tests réalisés nous ont permis de découvrir que plusieurs opérons fimbriaires de S. Typhi sont opérationnels et utilisés pour différentes fonctions par la bactérie.

Importance des protéines cellulaires incorporées dans les virions matures d’HSV-1

Pour compléter leur cycle de vie, les virus interagissent avec de nombreux facteurs de la cellule-hôte. Le virus Herpès simplex de type 1 (HSV-1) ne fait pas exception. Une récente étude protéomique du virus effectuée par notre laboratoire a permis d’identifier 49protéines cellulaires potentiellement incorporées dans les virions matures d’HSV-1 [1]. Étant donné que certaines de ces protéines peuvent jouer des rôles importants au cours du cycle de vie du virus, elles constituent des cibles de choix pour identifier et caractériser de nouvelles interactions hôte-pathogène dans le contexte d’HSV-1. D’ailleurs le laboratoire a été effectué un criblage aux petits ARN d’interférence qui a démontré qu'au moins 15 des protéines incorporées sont impliqués dans le cycle de réplication de HSV-1 en culture cellulaire (Annexe 1). Des nombreuses études rapportent l'incorporation des protéines de l'hôte dans les virions matures mais très peu abordent l'importance de la fraction des protéines cellulaires incorporée dans les virions pour le cycle virale. Pour vérifier ça, nous avons déplété ces protéines des virions matures extracellulaires en utilisant des petits ARN d’interférence. Par la suite, nous avons utilisé ces virus déplétés pour réinfecter des cellules déplétées ou normales. Cette méthode nous a permis d'identifier pour la première fois 8 protéines (DDX3X, HSPA8, KRT10, MIF, Rab5A, Rab6A, Rab10 et 14-3-3ζ) dont l'absence dans les virions réduit la production virale d'au moins 50%. Pour mieux comprendre à quelle étape du cycle viral ces protéines sont nécessaires, nous avons aussi quantifié les virus intracellulaires, produits des cellules déplétées individuellement des quinze protéines cellulaires. Ainsi, nous avons trouvé que dans nos conditions 7 de ces 8 protéines cellulaires (DDX3X, HSPA8, KRT10, MIF, Rab5A, Rab6A et Rab10) semblent impliquées dans la production des virus intracellulaires, ce qui nous a stimulés à débuter une série de tests plus approfondis de l’entrée d’HSV-1. Les résultats préliminaires, démontrent l’implication dans l’entrée d’HSV-1 d’au moins 3 à 4 de ces protéines (HSPA8, KRT10, Rab5A et Rab10).

Étude de la variante d’histone H2A.Z et du cycle de phosphorylation de l’ARN polymérase II chez Saccharomyces cerevisiae

La chromatine est plus qu’un système d’empaquetage de l’ADN ; elle est le support de toutes les réactions liées à l’ADN dans le noyau des cellules eucaryotes et participe au contrôle de l’accès de l’ARN polymérase II (ARNPolII) à l’ADN. Responsable de la transcription de tous les ARNm des cellules eucaryotes, l’ARNPolII doit, suivant son recrutement aux promoteurs des gènes, transcrire l’ADN en traversant la matrice chromatinienne. Grâce au domaine C-terminal (CTD) de sa sous-unité Rpb1, elle coordonne la maturation de l’ARNm en cours de synthèse ainsi que les modifications de la chromatine, concomitantes à la transcription. Cette thèse s’intéresse à deux aspects de la transcription : la matrice, avec la localisation de la variante d’histone H2A.Z, et la machinerie de transcription avec le cycle de phosphorylation du CTD de l’ARNPolII. Suivant l’introduction, le chapitre 2 de cette thèse constitue un protocole détaillé et annoté de la technique de ChIP-chip, chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Cette technique phare dans l’étude in vivo des phénomènes liés à l’ADN a grandement facilité l’étude du rôle de la chromatine dans les phénomènes nucléaires, en permettant de localiser sur le génome les marques et les variantes d’histones. Ce chapitre souligne l’importance de contrôles adéquats, spécifiques à l’étude de la chromatine. Au chapitre 3, grâce à la méthode de ChIP-chip, la variante d’histone H2A.Z est cartographiée au génome de la levure Saccharomyces cerevisiae avec une résolution d’environ 300 paires de bases. Nos résultats montrent que H2A.Z orne un à deux nucléosomes au promoteur de la majorité des gènes. L’enrichissement de H2A.Z est anticorrélé à la transcription et nos résultats suggèrent qu’elle prépare la chromatine pour l’activation des gènes. De plus H2A.Z semble réguler la localisation des nucléosomes. Le chapitre suivant s’intéresse à la transcription sous l’angle de la machinerie de transcription en se focalisant sur le cycle de phosphorylation de l’ARN polymérase II. Le domaine C-terminal de sa plus large sous-unité est formé de répétitions d’un heptapeptide YSPTSPS dont les résidus peuvent être modifiés au cours de la transcription. Cette étude localise les marques de phosphorylation des trois résidus sérine de manière systématique dans des souches mutantes des kinases et phosphatases. Nos travaux confirment le profil universel des marques de phosphorylations aux gènes transcrits. Appuyés par des essais in vitro, ils révèlent l’interaction complexe des enzymes impliqués dans la phosphorylation, et identifient Ssu72 comme la phosphatase de la sérine 7. Cet article appuie également la notion de « variantes » des marques de phosphorylation bien que leur étude spécifique s’avère encore difficile. La discussion fait le point sur les travaux qui ont suivi ces articles, et sur les expériences excitantes en cours dans notre laboratoire.

Activités inflammatoires des angiopoïétines sur les neutrophiles

L’angiogenèse, caractérisée par la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants, est un processus accompagné par l’inflammation, impliquant la synthèse et la relâche de différents facteurs de croissance par les cellules inflammatoires. Parmi ces facteurs, seuls le vascular endothelial growth factor (VEGF) et les angiopoïétines (Ang1 et Ang2) peuvent participer à la régulation de l’inflammation et de l’angiogenèse. La famille des angiopoïétines comporte quatre membres, desquels l’Ang1 et l’Ang2 ont été les plus étudiés. Ces deux médiateurs inflammatoires sont capables d’activer le récepteur Tie2, dont l’expression a initialement été rapportée sur les cellules endothéliales (CE). Notre laboratoire a été le premier à démontrer l’expression de Tie2 à la surface des neutrophiles, ainsi que sa capacité, suite à son activation par l’Ang1 ou l’Ang2, à induire la synthèse du facteur d’activation plaquettaire (PAF), l’activation de la β2-intégrine, la migration des neutrophiles ainsi que leur adhésion aux CE. D’autres études ont montré que les CE emmagasinent et relâchent le VEGF et l’Ang2, tandis que les péricytes et les cellules musculaires lisses contiennent l’Ang1. Puisque les neutrophiles relâchent le VEGF et que les deux angiopoïétines ont la capacité d’activer Tie2 sur ces derniers, nous avons voulu déterminer si les neutrophiles contiennent l’Ang1 et/ou l’Ang2 et si elles peuvent être relâchées suite à une stimulation avec des agonistes proinflammatoires. Nous avons découvert que l’Ang1, mais pas l’Ang2 est présente dans les neutrophiles, et qu’elle est relâchée suite à une stimulation au phorbol myristate acetate (PMA). De plus, nous avons démontré que l’Ang1 est localisée au niveau du cytosol et que sa relâche est calcium-indépendante, contrairement au VEGF, qui est localisé dans les granules β et sa relâche est calcium-dépendante. Cette étude démontre pour la première fois l’expression et la localisation de l’Ang1 dans les neutrophiles. Une récente étude effectuée dans notre laboratoire a démontré que les angiopoïétines induisent la migration des neutrophiles en activant le récepteur Tie2 et la voie de la PI3K. De plus, les angiopoïétines ont potentialisé la migration induite par l’IL-8. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que l’Ang1 et/ou l’Ang2 seraient capables d’induire la relâche et/ou la synthèse de l’IL-8 par les neutrophiles. Nous avons démontré pour la première fois, la capacité de l’Ang1 à induire l’expression de l’ARNm, ainsi que la synthèse et la relâche d’IL-8 par les neutrophiles. Cependant, un traitement avec l’Ang2 seule ou en combinaison avec l’Ang1 n’a eu aucun effet sur les activités mentionnées ci-dessus. Nous avons aussi observé que la synthèse et la relâche d’IL-8 induite par l’Ang1 requièrent la transcription de l’ADN en ARNm, suivie par la stabilisation de ce dernier, qui ultimement induit la traduction de l’ARNm de l’IL-8 en sa protéine. Finalement, nous avons démontré que la stimulation des neutrophiles avec l’Ang1 induit ces activités en activant la voie de la p42/44 MAPK, tout en étant indépendantes de la p38 MAPK et la PI3K/Akt. Ces résultats sont en lien direct avec une récente étude dans laquelle nous avons observé que l’Ang1, mais pas l’Ang2 est capable d’augmenter la survie des neutrophiles via la relâche d’IL-8.