Caractérisation du système d’acquisition de fer codé par le locus iro chez Salmonella enterica sérovar Typhi

Le fer est un élément essentiel pour les bactéries. Puisqu’elles ne peuvent le synthétiser elles-mêmes, elles utilisent un ou plusieurs systèmes d’acquisition de fer afin de se le procurer dans l’environnement, ou chez l’hôte pour leurs propres métabolismes. Différentes stratégies coexistent chez les bactéries pathogènes dues à la faible concentration de cet élément, autant chez l’hôte que dans l’environnement. Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) est une entérobactérie Gram négative causant une maladie systémique, soit la fièvre typhoïde, qui est spécifique à l’homme. Les mécanismes de pathogènese de ce sérovar sont peu connus jusqu’à ce jour, puisque son tropisme pour l’humain empêche l’utilisation d’un modèle animal adéquat. L’objectif de cette recherche est de caractériser le système d’acquisition de fer chez S. Typhi encodé par le locus iro. Les gènes du locus, iroBCDEN ont fait l’objet de plusieurs recherches chez différents pathogènes, notamment E. coli et Salmonella Typhimurium. Bien qu’un rôle dans la virulence ait été établi pour ce locus chez ces bactéries, très peu d’informations sont disponibles quant au rôle chez S. Typhi, qui emprunte plutôt la voie systémique d’infection. Nous avons évalué le rôle de la synthèse, de l’exportation et de l’importation du sidérophore salmochéline, codé par les gènes iroBCDEN. En inactivant le locus puis par la suite les gènes de façon indépendante par échange allélique, il a été possible d’observer leurs implications in vitro lors d’infections de cellules humaines. Le rôle dans l’adhésion et l’invasion des cellules épithéliales ainsi que le rôle dans la phagocytose et la survie dans les macrophages ont donc été déterminés. De plus, le mécanisme de sécrétion par lequel la salmochéline peut traverser la membrane externe est inconnu à ce jour. La pompe à efflux TolC est responsable de la sécrétion de plusieurs molécules, y compris l’entérobactine, un sidérophore analogue à la salmochéline. Par mutagénèse, nous avons effectué un mutant de délétion tolC afin de vérifier son implication dans l’interaction avec les cellules épithéliales et les macrophages. Afin de caractériser in vitro les mutants, nous avons effectué des courbes de croissance dans différents milieux. La sensibilité au peroxyde d’hydrogène a été vérifiée par la suite, puis dû aux résultats d’infections, la mobilité de la souche ΔtolC a été évaluée. Ces différents tests nous ont permis de mieux comprendre l’implication du locus iro, de ses composantes et de la pompe à efflux TolC lors de l’interaction avec les cellules cibles d’une infection systémique causée par Salmonella Typhi.

Study of the subcellular localization of cell cycle regulator Cks1 and its impact on cancer

La progression dans le cycle cellulaire est contrôlée par de vagues oscillantes de cyclines et des kinases cycline-dépendantes (Cdk). Ces kinases sont régulées positivement par l’association des sous-unités cyclines régulatrices et négativement en se liant aux inhibiteurs de Cdk. Parmi ces derniers, p27 inhibe tous les complexes cycline-Cdk quelle que soit la phase cellulaire et agit en tant que régulateur négatif principal de la prolifération cellulaire dans une variété de cellules et de tissus. Intrinsèquement, p27 phosphorylé est ubiquitiné et dégradé par le complexe SCFSkp2-Cks1. Des études génétiques de la souris, ainsi que des examens cliniques chez l’homme, ont montré que p27 est un important suppresseur de tumeur. Le gène est rarement muté. Cependant, p27 est fréquemment réprimé dans les cancers humains en raison d’une augmentation de l’expression de Skp2 et de Cks1 dans le noyau, ce qui est généralement associée à un mauvais pronostic. La localisation subcellulaire de Cks1 est donc d'une importance primordiale dans le contrôle de la prolifération cellulaire. Les résultats récents de notre laboratoire ont montré une interaction entre Cks1 et les protéines de transport nucléaire importine α1 et β3. Aussi, l’analyse de la séquence primaire de Cks1 a également révélé un signal de localisation nucléaire classique (NLS) à son extrémité C-terminale. Des mutations ont été effectuées sur le NLS suspect pour déterminer si oui ou non l'import nucléaire de Cks1 était contrôlé par cette séquence. Un inhibiteur synthétique de l’importine β a également été utilisé pour étudier l’import de Cks1 dans le noyau. Les résultats indiquent que l’extrémité C-terminale de Cks1 est en effet un NLS puisque les mutations de Cks1 et l'inhibition de l’importine β conduisent, tous deux, à l'accumulation de Cks1 dans le cytoplasme. Ces résultats ont été utiles pour mieux comprendre le mécanisme régulant la localisation de Cks1. Toutefois, des travaux futurs sont nécessaires pour mieux comprendre l'impact de la séquestration cytoplasmique de Cks1 sur le cancer et ainsi espérer aboutir à l'identification de nouvelles cibles pharmacologiques impliqués dans la prolifération cellulaire.

Rôle des suppresseurs de tumeur PML et CHES1 dans la régulation de la sénescence et de la prolifération cellulaire

La sénescence est un mécanisme de défense antiprolifératif dont la cellule est munie afin de prévenir l’accumulation de mutations pouvant mener à sa transformation et l’éventuel développement d’une tumeur. Ce programme consiste en un arrêt permanent du cycle cellulaire. Il peut être activé par de nombreux stimuli tels que le raccourcissement des télomères, le stress oxydatif, ou l’expression d’un oncogène constitutivement actif. Sa régulation requiert l’activation de protéines appelées des suppresseurs de tumeur dont les plus importants sont p53 et RB. De manière plus spécifique, les sénescences induites par l’expression des oncogène RASV12 ou STAT5A(1*6) sont respectivement caractérisées par l’augmentation de l’expression des protéines PML et CHES1/FOXN3. Le but de cette thèse est, dans un premier temps, de mettre en évidence le mécanisme de régulation de la sénescence par PML. PML est un suppresseur de tumeur dont l’expression dans des cellules diploïdes normales est suffisante pour induire la sénescence. Cette protéine forme des corps nucléaires sphériques au sein desquels est recruté, parmi d’autres molécules, la protéine du rétinoblastome RB. RB est un régulateur négatif du cycle cellulaire capable de lier et inhiber les facteurs de transcription E2F dont les gènes cibles sont nécessaires à la prolifération. Nos travaux démontrent que le mécanisme d’induction de la sénescence par PML implique le recrutement du complexe RB/E2F aux corps de PML afin de renforcer l’inhibition de l’activité des E2F par RB. Également, les E2F sont recrutés aux corps de PML en compagnie de leurs promoteurs ce qui favorise la formation d’hétérochromatine au niveau de ces gènes, aidant à leur répression et donc à l’établissement de la sénescence. D’autre part, cette thèse a pour but de caractériser le rôle de CHES1/FOXN3 dans la régulation du cycle cellulaire. CHES1 est un facteur de transcription de la famille des Forkheads. Son expression dans des cellules cancéreuses provoque un ralentissement de leur prolifération. Afin de comprendre son mécanisme de fonctionnement, une analyse sur micropuce d’ADN de l’expression des gènes de cellules cancéreuses exprimant CHES1 a été réalisée. Cette analyse a montré que, dans la cellule, CHES1 joue un rôle de répresseur transcriptionnel. Plus précisément, CHES1 réprime, entre autres, l’expression de gènes nécessaires à la synthèse des protéines tels que PIM2 et DYRK3. De manière intéressante, la réexpression de PIM2 dans des cellules cancéreuses exprimant CHES1 permet de rétablir partiellement la prolifération cellulaire. Également, l’analyse sur micropuce a révélé que CHES1 régule l’expression de nombreux gènes impliqués dans la formation des cilia dont l’une des fonctions semble être de moduler la synthèse protéique. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que le mécanisme antitumoral de CHES1 consiste en une inhibition de la synthèse de protéines.

Modélisation des émotions de l’apprenant et interventions implicites pour les systèmes tutoriels intelligents

La modélisation de l’expérience de l’utilisateur dans les Interactions Homme-Machine est un enjeu important pour la conception et le développement des systèmes adaptatifs intelligents. Dans ce contexte, une attention particulière est portée sur les réactions émotionnelles de l’utilisateur, car elles ont une influence capitale sur ses aptitudes cognitives, comme la perception et la prise de décision. La modélisation des émotions est particulièrement pertinente pour les Systèmes Tutoriels Émotionnellement Intelligents (STEI). Ces systèmes cherchent à identifier les émotions de l’apprenant lors des sessions d’apprentissage, et à optimiser son expérience d’interaction en recourant à diverses stratégies d’interventions. Cette thèse vise à améliorer les méthodes de modélisation des émotions et les stratégies émotionnelles utilisées actuellement par les STEI pour agir sur les émotions de l’apprenant. Plus précisément, notre premier objectif a été de proposer une nouvelle méthode pour détecter l’état émotionnel de l’apprenant, en utilisant différentes sources d’informations qui permettent de mesurer les émotions de façon précise, tout en tenant compte des variables individuelles qui peuvent avoir un impact sur la manifestation des émotions. Pour ce faire, nous avons développé une approche multimodale combinant plusieurs mesures physiologiques (activité cérébrale, réactions galvaniques et rythme cardiaque) avec des variables individuelles, pour détecter une émotion très fréquemment observée lors des sessions d’apprentissage, à savoir l’incertitude. Dans un premier lieu, nous avons identifié les indicateurs physiologiques clés qui sont associés à cet état, ainsi que les caractéristiques individuelles qui contribuent à sa manifestation. Puis, nous avons développé des modèles prédictifs permettant de détecter automatiquement cet état à partir des différentes variables analysées, à travers l’entrainement d’algorithmes d’apprentissage machine. Notre deuxième objectif a été de proposer une approche unifiée pour reconnaître simultanément une combinaison de plusieurs émotions, et évaluer explicitement l’impact de ces émotions sur l’expérience d’interaction de l’apprenant. Pour cela, nous avons développé une plateforme hiérarchique, probabiliste et dynamique permettant de suivre les changements émotionnels de l'apprenant au fil du temps, et d’inférer automatiquement la tendance générale qui caractérise son expérience d’interaction à savoir : l’immersion, le blocage ou le décrochage. L’immersion correspond à une expérience optimale : un état dans lequel l'apprenant est complètement concentré et impliqué dans l’activité d’apprentissage. L’état de blocage correspond à une tendance d’interaction non optimale où l'apprenant a de la difficulté à se concentrer. Finalement, le décrochage correspond à un état extrêmement défavorable où l’apprenant n’est plus du tout impliqué dans l’activité d’apprentissage. La plateforme proposée intègre trois modalités de variables diagnostiques permettant d’évaluer l’expérience de l’apprenant à savoir : des variables physiologiques, des variables comportementales, et des mesures de performance, en combinaison avec des variables prédictives qui représentent le contexte courant de l’interaction et les caractéristiques personnelles de l'apprenant. Une étude a été réalisée pour valider notre approche à travers un protocole expérimental permettant de provoquer délibérément les trois tendances ciblées durant l’interaction des apprenants avec différents environnements d’apprentissage. Enfin, notre troisième objectif a été de proposer de nouvelles stratégies pour influencer positivement l’état émotionnel de l’apprenant, sans interrompre la dynamique de la session d’apprentissage. Nous avons à cette fin introduit le concept de stratégies émotionnelles implicites : une nouvelle approche pour agir subtilement sur les émotions de l’apprenant, dans le but d’améliorer son expérience d’apprentissage. Ces stratégies utilisent la perception subliminale, et plus précisément une technique connue sous le nom d’amorçage affectif. Cette technique permet de solliciter inconsciemment les émotions de l’apprenant, à travers la projection d’amorces comportant certaines connotations affectives. Nous avons mis en œuvre une stratégie émotionnelle implicite utilisant une forme particulière d’amorçage affectif à savoir : le conditionnement évaluatif, qui est destiné à améliorer de façon inconsciente l’estime de soi. Une étude expérimentale a été réalisée afin d’évaluer l’impact de cette stratégie sur les réactions émotionnelles et les performances des apprenants.

Bioassay-guided fractionation of Larix laricina du Roi, and antidiabetic potentials of ethanol and hot water extracts of seventeen medicinal plants from the traditional pharmacopeia of the James Bay Cree

Nous avons utilisé une approche ethnobotanique pour identifier des espèces de plantes utilisées par les Cris afin de traiter les symptômes du diabète de type 2. Larix laricina du Roi (L. laricina) a récemment été identifiée comme une des meilleures plantes qui a stimulé le transport de glucose dans les cellules C2C12 et fortement potentialisé la différenciation des 3T3-L1 en indiquant une sensibilité potentiellement accrue à l’insuline. Ensuite, ces études de criblage ont été effectuées sur des extraits éthanolique (EE) en utilisant une série de bioessais in vitro. Cependant, les préparations traditionnelles des plantes sont souvent faites avec l’eau chaude. Le but de cette thèse de doctorat était d’isoler les principes actifs de L. laricina par un fractionnement guidé par l’adipogenèse; d’évaluer et de comparer l’activité et les mécanismes antidiabétiques des EE et des extraits aqueux (HWE) de ces 17 plantes. Pour le fractionnement de L. laricina, on a isolé plusieurs composés connus et identifié un nouveau composé actif cycloartane triterpene, qui a amélioré fortement l’adipogenèse et a été responsable en partie de l’activité adipogénique (potentiellement similaire à l’effet sensibilisateur à l’insuline des glitazone) de l’extrait éthanolique issu de l’écorce de L. laricina. Pour le métabolisme lipidique, nos résultats ont confirmé que 10 parmi les 17 EE ont augmenté la différenciation des adipocytes alors que 2 extraits seulement l’ont inhibée. Les HWE ont montré une faible activité adipogénique ou antiadipogénique. Les EE de R. groenlandicum et K. angustifolia ont le PPAR γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ), le SREBP-1 (sterol regulatory element binding protein-1) et le C/EBP (CCAAT-enhancer binding proteins) α, alors que ceux de P. balsamifera et A. incana les ont inhibés. L’effet inhibiteur de P. balsamifera a également été prouvé d’avoir impliqué l’activation de la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK). Les EE et HWE de R. groenlandicum ont stimulé les mêmes facteurs de transcription alors que les extraits aqueux d’autres plantes sélectionnées ont perdu ces effets en comparaison avec leurs extraits éthanoliques respectifs. L’analyse phytochimique a également identifié le groupe des espèces actives et inactives, notamment lorsque les espèces ont été séparées par famille de plante. Finalement concernant l’homéostasie de glucose, nos résultats ont confirmé que plusieurs EE ont stimulé le transport de glucose musculaire et inhibé l’activité de la glucose-6-phosphatase (G6Pase) hépatique. Certains des HWE ont partiellement ou complètement perdu ces activités antidiabétiques par rapport aux EE, tandis qu’une seule plante (R.groenlandicum) a juste conservé un potentiel similaire entre les EE et HWE dans les deux essais. Dans les cellules musculaires, les EE de R.groenlandicum, A. incana et S. purpurea ont stimulé le transport de glucose en activant la voie de signalisation de l’AMPK et en augmentant le niveau d’expression des GLUT4. En comparaison avec les EE, les HWE de R.groenlandicum ont montré des activités similaires; les HWE de A. incana ont complètement perdu leur effet sur tous les paramètres étudiés; les HWE de S. purpurea ont activé la voie de l’insuline au lieu de celle de l’AMPK pour augmenter le transport de glucose. Dans les cellules H4IIE, les EE et HWE des 5 plantes ont activé la voie de l’AMPK, et en plus les EE et HWE de 2 plantes ont activé la voie de l’insuline. La quercétine-3-O-galactoside et la quercétine 3-O-α-L-arabinopyranoside ont été identifiées comme des composés ayant un fort potentiel antidiabétique et donc responsables de l'activité biologique des plantes HWE actifs avec le transport du glucose. En conclusion, on a isolé plusieurs composés connus et identifié un nouveau triterpène actif à partir du fractionnement de L. laricina. Nous avons fourni également une preuve directe pour l'évaluation et la comparaison d'une action analogue à l'insuline ou insulino-sensibilisateur des EE et HWE de plantes médicinales Cris au niveau de muscle, de foie et de tissus adipeux. Une partie de leur action peut être liée à la stimulation des voies de signalisation intracellulaire insulino-dépendante et non-insulino-dépendante, ainsi que l’activation de PPARγ. Nos résultats indiquent que les espèces de plantes, les tissus ou les cellules cibles, ainsi que les méthodes d'extraction sont tous des déterminants significatifs de l'activité biologique de plantes médicinales Cris sur le métabolisme glucidique et lipidique.

Régulation moléculaire de la barrière hémo-encéphalique

La Sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune inflammatoire démyélinisante du système nerveux central (SNC), lors de laquelle des cellules inflammatoires du sang périphérique infiltrent le SNC pour y causer des dommages cellulaires. Dans ces réactions neuroinflammatoires, les cellules immunitaires traversent le système vasculaire du SNC, la barrière hémo-encéphalique (BHE), pour avoir accès au SNC et s’y accumuler. La BHE est donc la première entité que rencontrent les cellules inflammatoires du sang lors de leur migration au cerveau. Ceci lui confère un potentiel thérapeutique important pour influencer l’infiltration de cellules du sang vers le cerveau, et ainsi limiter les réactions neuroinflammatoires. En effet, les interactions entre les cellules immunitaires et les parois vasculaires sont encore mal comprises, car elles sont nombreuses et complexes. Différents mécanismes pouvant influencer la perméabilité de la BHE aux cellules immunitaires ont été décrits, et représentent aujourd’hui des cibles potentielles pour le contrôle des réactions neuro-immunes. Cette thèse a pour objectif de décrire de nouveaux mécanismes moléculaires opérant au niveau de la BHE qui interviennent dans les réactions neuroinflammatoires et qui ont un potentiel thérapeutique pour influencer les interactions neuro-immunologiques. Ce travail de doctorat est séparé en trois sections. La première section décrit la caractérisation du rôle de l’angiotensine II dans la régulation de la perméabilité de la BHE. La seconde section identifie et caractérise la fonction d’une nouvelle molécule d’adhérence de la BHE, ALCAM, dans la transmigration de cellules inflammatoires du sang vers le SNC. La troisième section traite des propriétés sécrétoires de la BHE et du rôle de la chimiokine MCP-1 dans les interactions entre la BHE et les cellules souches. Dans un premier temps, nous démontrons l’importance de l’angiotensinogène (AGT) dans la régulation de la perméabilité de la BHE. L’AGT est sécrété par les astrocytes et métabolisé en angiotensine II pour pouvoir agir au niveau des CE de la BHE à travers le récepteur à l’angiotensine II, AT1 et AT2. Au niveau de la BHE, l’angiotensine II entraîne la phosphorylation et l’enrichissement de l’occludine au sein de radeaux lipidiques, un phénomène associé à l’augmentation de l’étanchéité de la BHE. De plus, dans les lésions de SEP, on retrouve une diminution de l’expression de l’AGT et de l’occludine. Ceci est relié à nos observations in vitro, qui démontrent que des cytokines pro-inflammatoires limitent la sécrétion de l’AGT. Cette étude élucide un nouveau mécanisme par lequel les astrocytes influencent et augmentent l’étanchéité de la BHE, et implique une dysfonction de ce mécanisme dans les lésions de la SEP où s’accumulent les cellules inflammatoires. Dans un deuxième temps, les techniques établies dans la première section ont été utilisées afin d’identifier les protéines de la BHE qui s’accumulent dans les radeaux lipidiques. En utilisant une technique de protéomique nous avons identifié ALCAM (Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule) comme une protéine membranaire exprimée par les CE de la BHE. ALCAM se comporte comme une molécule d’adhérence typique. En effet, ALCAM permet la liaison entre les cellules du sang et la paroi vasculaire, via des interactions homotypiques (ALCAM-ALCAM pour les monocytes) ou hétérotypiques (ALCAM-CD6 pour les lymphocytes). Les cytokines inflammatoires augmentent le niveau d’expression d’ALCAM par la BHE, ce qui permet un recrutement local de cellules inflammatoires. Enfin, l’inhibition des interactions ALCAM-ALCAM et ALCAM-CD6 limite la transmigration des cellules inflammatoires (monocytes et cellules T CD4+) à travers la BHE in vitro et in vivo dans un modèle murin de la SEP. Cette deuxième partie identifie ALCAM comme une cible potentielle pour influencer la transmigration de cellules inflammatoires vers le cerveau. Dans un troisième temps, nous avons pu démontrer l’importance des propriétés sécrétoires spécifiques à la BHE dans les interactions avec les cellules souches neurales (CSN). Les CSN représentent un potentiel thérapeutique unique pour les maladies du SNC dans lesquelles la régénération cellulaire est limitée, comme dans la SEP. Des facteurs qui limitent l’utilisation thérapeutique des CSN sont le mode d’administration et leur maturation en cellules neurales ou gliales. Bien que la route d’administration préférée pour les CSN soit la voie intrathécale, l’injection intraveineuse représente la voie d’administration la plus facile et la moins invasive. Dans ce contexte, il est important de comprendre les interactions possibles entre les cellules souches et la paroi vasculaire du SNC qui sera responsable de leur recrutement dans le parenchyme cérébral. En collaborant avec des chercheurs de la Belgique spécialisés en CSN, nos travaux nous ont permis de confirmer, in vitro, que les cellules souches neurales humaines migrent à travers les CE humaines de la BHE avant d’entamer leur différenciation en cellules du SNC. Suite à la migration à travers les cellules de la BHE les CSN se différencient spontanément en neurones, en astrocytes et en oligodendrocytes. Ces effets sont notés préférentiellement avec les cellules de la BHE par rapport aux CE non cérébrales. Ces propriétés spécifiques aux cellules de la BHE dépendent de la chimiokine MCP-1/CCL2 sécrétée par ces dernières. Ainsi, cette dernière partie suggère que la BHE n’est pas un obstacle à la migration de CSN vers le SNC. De plus, la chimiokine MCP-1 est identifiée comme un facteur sécrété par la BHE qui permet l’accumulation et la différentiation préférentielle de cellules souches neurales dans l’espace sous-endothélial. Ces trois études démontrent l’importance de la BHE dans la migration des cellules inflammatoires et des CSN vers le SNC et indiquent que de multiples mécanismes moléculaires contribuent au dérèglement de l’homéostasie du SNC dans les réactions neuro-immunes. En utilisant des modèles in vitro, in situ et in vivo, nous avons identifié trois nouveaux mécanismes qui permettent d’influencer les interactions entre les cellules du sang et la BHE. L’identification de ces mécanismes permet non seulement une meilleure compréhension de la pathophysiologie des réactions neuroinflammatoires du SNC et des maladies qui y sont associées, mais suggère également des cibles thérapeutiques potentielles pour influencer l’infiltration des cellules du sang vers le cerveau

Une nouvelle approche computationnelle pour la découverte des sites de fixation de facteurs de transcription à l’ADN, adaptée aux données de ChIP-chip et de ChIP-séquençage

Les facteurs de transcription sont des protéines spécialisées qui jouent un rôle important dans différents processus biologiques tel que la différenciation, le cycle cellulaire et la tumorigenèse. Ils régulent la transcription des gènes en se fixant sur des séquences d’ADN spécifiques (éléments cis-régulateurs). L’identification de ces éléments est une étape cruciale dans la compréhension des réseaux de régulation des gènes. Avec l’avènement des technologies de séquençage à haut débit, l’identification de tout les éléments fonctionnels dans les génomes, incluant gènes et éléments cis-régulateurs a connu une avancée considérable. Alors qu’on est arrivé à estimer le nombre de gènes chez différentes espèces, l’information sur les éléments qui contrôlent et orchestrent la régulation de ces gènes est encore mal définie. Grace aux techniques de ChIP-chip et de ChIP-séquençage il est possible d’identifier toutes les régions du génome qui sont liées par un facteur de transcription d’intérêt. Plusieurs approches computationnelles ont été développées pour prédire les sites fixés par les facteurs de transcription. Ces approches sont classées en deux catégories principales: les algorithmes énumératifs et probabilistes. Toutefois, plusieurs études ont montré que ces approches génèrent des taux élevés de faux négatifs et de faux positifs ce qui rend difficile l’interprétation des résultats et par conséquent leur validation expérimentale. Dans cette thèse, nous avons ciblé deux objectifs. Le premier objectif a été de développer une nouvelle approche pour la découverte des sites de fixation des facteurs de transcription à l’ADN (SAMD-ChIP) adaptée aux données de ChIP-chip et de ChIP-séquençage. Notre approche implémente un algorithme hybride qui combine les deux stratégies énumérative et probabiliste, afin d’exploiter les performances de chacune d’entre elles. Notre approche a montré ses performances, comparée aux outils de découvertes de motifs existants sur des jeux de données simulées et des jeux de données de ChIP-chip et de ChIP-séquençage. SAMD-ChIP présente aussi l’avantage d’exploiter les propriétés de distributions des sites liés par les facteurs de transcription autour du centre des régions liées afin de limiter la prédiction aux motifs qui sont enrichis dans une fenêtre de longueur fixe autour du centre de ces régions. Les facteurs de transcription agissent rarement seuls. Ils forment souvent des complexes pour interagir avec l’ADN pour réguler leurs gènes cibles. Ces interactions impliquent des facteurs de transcription dont les sites de fixation à l’ADN sont localisés proches les uns des autres ou bien médier par des boucles de chromatine. Notre deuxième objectif a été d’exploiter la proximité spatiale des sites liés par les facteurs de transcription dans les régions de ChIP-chip et de ChIP-séquençage pour développer une approche pour la prédiction des motifs composites (motifs composés par deux sites et séparés par un espacement de taille fixe). Nous avons testé ce module pour prédire la co-localisation entre les deux demi-sites ERE qui forment le site ERE, lié par le récepteur des œstrogènes ERα. Ce module a été incorporé à notre outil de découverte de motifs SAMD-ChIP.

Use of cellular impedance to characterize ligand functional selectivity at G protein-coupled receptors

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) représentent la plus grande famille de cibles thérapeutiques pour le traitement d’une panoplie de pathologies humaines. Bien que plusieurs décennies de recherche aient permis de façonner nos connaissances sur ces protéines membranaires, notre compréhension des déterminants moléculaires de leur activité signalétique reste encore limitée. De ces domaines de recherche, une avancée récente a mis à jour un nouveau phénomène, appelé sélectivité fonctionnelle des ligands, qui a bouleversé les paradigmes décrivant leu fonctionnement de ces récepteurs. Ce concept émane d’observations montrant que l’activité pharmacologique de certains ligands n’est pas nécessairement conservée sur tout le répertoire signalétiques connu du récepteur et peu se restreindre à l'activation sélective d’un sous-groupe de voies de signalisation.Ce nouveau modèle pharmacologique de l'activation des RCPG ouvre de nouvelles possibilités pour la découverte de médicaments plus efficace et sûr, ciblant les RCPGs. En effet, il permet la conception de molécules modulant spécifiquement les voies signalétiques d’intérêt thérapeutique, sans engager les autres voies qui pourraient mener à des effets secondaires indésirables ou de la tolérance. Cette thèse décrit l'utilisation d'une nouvelle approche sans marquage, basée sur la mesure du changement l'impédance cellulaire. Par la mesure des changements cellulaires, comme la morphologie, l’adhésion et/ou la redistribution des macromolécules, cette approche permet de mesurer de façon simultanée l'activité de plusieurs voies de signalisation impliqués dans ces réponses. Utilisant le récepteur β2-adrénergique (β2AR) comme modèle, nous avons démontré que les variations dans l’impédance cellulaire étaient directement liées à l’activation de multiples voies de signalisation suite à la stimulation du récepteur par son ligand. L’agoniste type du β2AR, l’isoprotérénol, s’est avéré induire une réponse d’impédance dose-dépendante constituée, dans le temps, de plusieurs caractéristiques distinctes pouvant être bloquées de façon compétitive par l’antagoniste ICI118,551 Par l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs, nous avons été en mesure de déterminer la contribution de plusieurs voies signalétiques canoniques, comme les voies dépendantes de Gs et Gi, la production d’AMPc et l’activation de ERK1/2, sur ces changements. De plus, la dissection de la réponse d’impédance a permis d’identifier une nouvelle voie de mobilisation du Ca2+ contribuant à la réponse globale des changements initiés par la stimulation du β2AR. Dans une autre étude, nous avons rapporté que la réponse calcique induite par le β2AR serait attribuable à une transactivation Gs-dépendant du récepteur purinergique P2Y11, lui-même couplé à la protéine Gq. La mesure d’impédance permettant de distinguer et de décrire une pléiade d’activités signalétiques, nous avons émis l’hypothèse que des ligands arborant des profils signalétiques différents généreraient des réponses d’impédance distinctes. Le criblage d’une librairie de ligands spécifiques au β2AR a révélé une grande variété de signatures d’impédance. Grâce au développement d’une approche computationnelle innovatrice, nous avons été en mesure de regrouper ces signatures en cinq classes de composés, un regroupement qui s’est avéré hautement corrélé avec le profil signalétique des différents ligands. Nous avons ensuite combiné le criblage de composés par impédance avec l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs de voies signalétiques afin d’augmenter la résolution du regroupement. En évaluant l’impact d’une voie signalétique donnée sur la signature d’impédance, nous avons été en mesure de révéler une plus grande variété de textures parmi les ligands. De plus, cette méthode s’est avérée efficace pour prédire le profil signalétique d’une librairie de composés non caractérisés, ciblant le β2AR. Ces travaux ont mené à l’élaboration d’une méthode permettant d’exprimer visuellement la sélectivité fonctionnelle de ligands et ont révélé de nouvelles classes de composés pour ce récepteur. Ces nouvelles classes de composés ont ensuite été testées sur des cardiomyocytes humains, confirmant que les composés regroupés dans différentes classes produisent des effets distincts sur la contractilité de ces cellules. Globalement, ces travaux démontrent la pertinence de l’utilisation de l’impédance cellulaire pour une évaluation précise des différences fonctionnelles parmi les composés ciblant les RCPGs. En fournissant une représentation pluridimensionnelle de la signalisation émanant des RCPGs à l’aide d’un seul essai ne requérant pas de marquage, les signatures d’impédance représentent une stratégie simple et innovante pour l’évaluation de la fonctionnalité sélective des ligands. Cette méthode pourrait être d’une grande utilité dans le processus de découverte de nouveaux médicaments.

Caractérisation photométrique et spectroscopique de compagnons sous-stellaires de faible masse autour d'étoiles de la région de formation Upper Scorpius

Suite à la découverte d’environ 2000 naines brunes au cours des deux dernières décennies, on commence à bien comprendre la physique de ces objets de masse intermédiaire entre les étoiles et les planètes. Malgré tout, les modèles d’atmosphère et d’évolution de ces objets peu massifs peinent toujours à reproduire fidèlement leurs caractéristiques pour les âges les plus jeunes. Ce travail propose la caractérisation de quatre compagnons de masse sous-stellaire (8-30 MJup) en orbite à grande séparation (300-900 UA) autour d'étoiles jeunes (5 Ma) de la région de formation Upper Scorpius. De nouveaux spectres (0,9-2,5 um) et de nouvelles mesures photométriques (YJHKsL') sont présentés et analysés, dans le but de déterminer la masse, température effective, luminosité et gravité de surface de ces compagnons, tout en évaluant la fidélité avec laquelle les spectres synthétiques tirés de deux modèles d’atmosphère récents reproduisent les spectres observés.

Identification et caractérisation de gènes chez Salmonella enterica sérovar Typhi impliqués dans l’interaction avec les macrophages humains.

Le genre bactérien Salmonella regroupe plus de 2500 sérovars, mais peu sont responsables de pathologies humaines. Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) est reconnu pour son importance médicale à travers le globe. S. Typhi cause la fièvre typhoïde chez l’Homme, une maladie infectieuse létale caractérisée par la dissémination systémique de la bactérie vers des organes du système réticulo-endothélial. La fièvre typhoïde représente un fardeau pour la santé mondiale, notamment auprès des pays en développement où les conditions sanitaires sont désuètes. La situation se complique davantage par l’apparition de souches résistantes aux antibiotiques. De plus, les deux vaccins licenciés sont d’efficacité modérée, présentent certaines contraintes techniques et ne sont pas appropriés pour les jeunes enfants et nourrissons. La phase systémique de l’infection par Salmonella repose sur sa survie dans les macrophages du système immunitaire. Dans ce compartiment intracellulaire, la bactérie module les défenses antimicrobiennes grâce à de multiples facteurs de virulence encodés dans son génome. Les mécanismes moléculaires sollicités sont complexes et finement régulés. Malgré les progrès scientifiques réalisés précédemment, plusieurs incompréhensions persistent au sujet de l’adaptation de ce pathogène dans les macrophages de l’hôte. Pour mieux concevoir les déterminants génétiques de S. Typhi impliqués dans l’interaction avec ces cellules, une stratégie de sélection négative a été appliquée afin de vérifier systématiquement l’effet direct des gènes pendant l’infection. En premier temps, une librairie de mutants par transposon chez S. Typhi a été créée pour l’infection de macrophages humains en culture. Après 24 heures d’infection, la présence des mutants fut évaluée simultanément par analyse sur des biopuces de Salmonella. Au total, 130 gènes ont été sélectionnés pour leur contribution potentielle auprès des macrophages infectés. Ces gènes comptaient des composantes d’enveloppe bactérienne, des éléments fimbriaires, des portions du flagelle, des régulateurs, des facteurs de pathogenèse et plusieurs protéines sans fonction connue. En deuxième temps, cette collection de gènes a dirigé la création de 28 mutants de délétion définie chez S. Typhi. Les capacités d’entrée et de réplication intracellulaire de ces mutants au sein des macrophages humains ont été caractérisées. D’abord, les macrophages ont été co-infectés avec les mutants en présence de la souche sauvage, pour vérifier la compétitivité de chacun d’eux envers cette dernière. Ensuite, les mutants ont été inoculés individuellement chez les macrophages et leur infectivité fut mesurée comparativement à celle de la souche sauvage. Sommairement, 26 mutants ont présenté des défauts lorsqu’en compétition, tandis que 14 mutants se sont montrés défectueux lorsque testés seuls. Par ailleurs, 12 mutants ont exposé une déficience lors de l’infection mixte et individuelle, incluant les mutants acrA, exbDB, flhCD, fliC, gppA, mlc, pgtE, typA, waaQGP, STY1867-68, STY2346 et SPI-4. Notamment, 35 nouveaux phénotypes défectueux d’entrée ou de survie intracellulaire chez Salmonella ont été révélés par cette étude. Les données générées ici offrent plusieurs nouvelles pistes pour élucider comment S. Typhi manipule sa niche intracellulaire, menant à l’infection systémique. Les gènes décrits représentent des cibles potentielles pour atténuer la bactérie chez l’humain et pourraient contribuer au développement de meilleures souches vaccinales pour immuniser contre la fièvre typhoïde.

Étude électrophysiologique de l’impact de la couleur dans le déploiement attentionnel

L’influence de la couleur dans les mécanismes perceptuels et attentionnels a été étudiée. Quatre couleurs (le rouge, le vert, le bleu et le jaune) ont été calibrées individuellement à travers la technique heterochromatic flicker photometry. Suivant cela, les participants ont déployé leur attention à une cible (un cercle de couleur avec une ligne orientée). Les données électrophysiologiques ont été enregistrées pendant que les sujets performaient la tâche de recherche visuelle, et les analyses ont été basées sur les potentiels évoqués (PÉs). Trois composantes des PÉs ont été examinées : la posterior contralateral positivity (Ppc); la N2pc, reflétant le déploiement de l’attention visuo-spatiale et la temporal and contralateral positivity (Ptc). Des conditions dans lesquelles la cible était bleu ou rouge, lorsque comparées à des conditions avec une cible jaune ou verte suscitaient une N2pc plus précoce. Une amplitude plus élevée est aussi observée pour les cibles rouges pour les composantes Ppc et Ptc, reflétant une sélectivité pré-attentionelle. Ces résultats suggèrent de la prudence dans l’interprétation de données comparant des cibles de différentes couleurs dans des tâches de PÉs, et ce même lorsque les couleurs sont équiluminantes.

Résiliences et équilibres en Côte d’Ivoire post-crise

La résilience en Côte d’Ivoire implique des mesures ciblées et pertinentes. Le pardon, le dialogue et la réconciliation ne signifient pas un oubli extrême. La cicatrice n’empêche pas le retour vers un équilibre de cohésion sociale via la stabilité sociopolitique. Le contexte de construction démocratique interroge les valeurs éthiques mobilisables, comme la justice, la capacité collective de dépassement du traumatisme, et les relations communautaires. Nous les passons en revue en introduisant l’altruisme et le capital social de façon polyvalente, aussi bien dans leurs aspects positifs que négatifs. La résilience ne peut être imposée, elle doit respecter les préférences des personnes et donc rester optimale.

Effet de la mutation du gène lrpprc sur l'activité de l'AMPK dans les fibroblastes des patients atteints du syndrome de Leigh, type canadien français

Le syndrome de Leigh, type canadien français (LSFC) est une maladie infantile orpheline causée par une mutation du gène lrpprc. Elle se caractérise par une déficience tissu spécifique de cytochrome c oxydase (COX), une dysfonction mitochondriale et la survenue de crises d’acidose lactique fatales dans plus de 80% de cas. Selon les familles des patients, ces crises apparaissent lors d’une demande excessive d’énergie. Malheureusement, les mécanismes sous-jacents à l’apparition des crises et notamment la physiopathologie du LSFC demeurent inconnus. Afin de mieux comprendre les mécanismes de régulation du métabolisme énergétique chez les patients LSFC, nous avons examiné la régulation de la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK), une enzyme clé de l'homéostasie énergétique, de même que certaines de ses voies cibles (SIRT1/PGC1α et Akt/mTOR) dans les fibroblastes de patients LSFC et de témoins en conditions basales et conditions de stress. En conditions basales, l’activité de l’AMPK était similaire dans les cellules LSFC et les témoins. Par contre, les cellules LSFC montraient une surexpression significative des voies Akt/mTOR et SIRT1/PGC1α comparativement aux cellules témoins. Nous avons aussi examiné ces voies de signalisation suite à une incubation de 4h avec 10 mM de lactate et 1 mM de palmitate (LP), nous permettant de mimer les conditions de « crise ». Nos résultats ont démontré que le LP augmentait les niveaux de phosphorylation de l’AMPK de 90% (p<0,01) dans les cellules témoins mais pas dans les cellules LSFC. Pourtant, l’AMPK est activée dans les cellules LSFC en réponse à une hypoxie chimique induite par le 2,4 dinitrophénol. Dans les cellules témoins, le LP augmentait aussi les niveaux d’expression de SIRT1 (57%, p<0,05), de LRPPRC (23%, p=0,045) et de COXIV (19%, p<0,05). Un prétraitement de 48h au ZMP, un activateur pharmacologique de l’AMPK, a eu un effet additif avec le LP et des augmentations de SIRT1 phosphorylée (120%, p<0,05), de SIRT1 total (75%, p<0,01), de LRPPRC (63%, p<0,001) et de COXIV (38%, p<0,001) ont été observées. Tous ces effets étaient aussi abolis dans les cellules LSFC. En conclusion, nos résultats ont démontré des altérations importantes de la régulation du métabolisme énergétique dans les fibroblastes de patients LSFC.

Caractérisation pharmacologique et moléculaire des dyskinésies tardives chez un modèle de primate non humain

Les dyskinésies tardives (DT) sont des troubles moteurs associés à l’utilisation chronique des antagonistes des récepteurs dopaminergiques D2 tels que les antipsychotiques et le métoclopramide. Ces dyskinésies correspondent à une incoordination motrice portant préférentiellement sur la musculature oro-faciale. La gestion des DT s'est imposée comme défi de santé publique surtout en l’absence d’une alternative thérapeutique efficace et abordable. L’hypothèse classiquement avancée pour expliquer la physiopathologie des DT inhérente au traitement par les antipsychotiques s’articule autour de l’hypersensibilité des récepteurs dopaminergiques D2, cibles principales de ces molécules. Néanmoins, plusieurs données remettent la véracité de cette hypothèse en question. Hypothèse: nous proposons que le blocage chronique des récepteurs dopaminergiques soit effectivement responsable d’un phénomène d’hypersensibilisation mais contrairement à l’hypothèse classique, cette hypersensibilisation porterait sur des paramètres de la transmission dopaminergique autres que les récepteurs D2. De même nous postulons que cette hypersensibilisation se traduirait par des altérations des cascades signalétiques au niveau des cellules du striatum. Ces altérations aboutissent à des changements portant sur le récepteur nucléaire (Nur77), qui est hautement associé au système dopaminergique; l’induction de ces récepteurs déclencherait des cascades associées à la compensation ou à la genèse des DT. Matériels et méthodes: 23 femelles Cebus apella, réparties en 3 groupes: groupe halopéridol, groupe clozapine, et groupe contrôle, ont été exposées aux traitements respectifs pendant 6-36 mois. Après l’analyse comportementale, les animaux ont été décapités et leurs cerveaux isolés pour fin d’analyse. Hybridation in situ: nous avons fait appel à cette technique pour mesurer l’expression de l’ARNm de Nur77 et du neuropeptide enképhaline. Hybridation in situ double: nous avons exploités cette technique pour identifier les populations neuronales exprimant les récepteurs dopaminergiques D3 et localiser leur éventuelle induction. Autoradiographies des récepteurs dopaminergiques D1, D2 et D3 et autoradiographies des récepteurs i glutamatergiques mGluR5. Ces autoradiographies avaient pour objectif d’évaluer l’expression de ces différents récepteurs. Mutagenèse dirigée et transfection cellulaire: nous faisons appel à ces techniques pour reproduire le polymorphisme identifié au niveau de la région 3’UTR de l’ARNm Nur77 et évaluer l’impact que pourrait avoir ce polymorphisme sur la stabilité de l’ARNm Nur77 sinon sur l’expression de la protèine Nur77. Western Blot des kinases ERK 1 et 2: cette technique nous a servi comme moyen pour quantifier l’expression globale de ces kinases. Analyses statistiques: l’expression de l’ARNm Nur77 a été évaluée en utilisant l’analyse de la variance à un seul facteur (One way ANOVA). Nous avons procédé de la même façon pour mesurer l’expression des récepteurs D2, D3 et mGluR5. Résultats: le groupe des animaux traités par l’halopéridol montre une plus forte expression des récepteurs D3 par rapport aux sujets des autres groupes. Cette expression se produit au niveau des neurones de la voie directe. De plus, cette augmentation corrèle positivement avec la sévérité des DT. L’expression des récepteurs D2 et mGluR5 reste relativement inchangée entre les différents groupes, alors qu’un gradient d’expression a été observé pour le récepteur D1. Par ailleurs, Nur77 est induit par l’halopéridol, alors que son expression semble baisser chez les animaux traités par la clozapine. L’induction de l’expression de Nur77 par l’halopéridol est plus accrue chez les animaux non dyskinétiques. Les animaux traités par la clozapine démontrent une expression amoindrie de l’ARNm de Nur77 qui tend à être plus faible que l’expression de base. D’autre part, la présence du polymorphisme au niveau de la région 3’UTR semble affecter l’expression cellulaire de Nur77. Conclusion: ces résultats confortent notre hypothèse concernant l’existence d’un phénomène d’hypersensibilisation prenant place suite un traitement chronique par les antipsychotiques. Ce phénomène s’est traduit par une augmentation de l’expression des récepteurs D3 sans porter sur les récepteurs D2 tel que prôné classiquement. Cette hypersensibilisation des récepteurs D3 implique également l’existence d’un débalancement des voies striatales pouvant ainsi sous tendre l’apparition des DT. Ces résultats dévoilent ainsi un nouveau mécanisme qui pourrait contribuer à l’apparition des DT et pourraient permettre une meilleure gestion, nous l’espérons, des DT à l’échelle clinique.

Rôle de la ghréline dans la régulation du coactivateur transcriptionnel PGC-1alpha

L’adaptation de l’organisme à son environnement est essentielle à sa survie. L’homéostasie énergétique permet l’équilibre entre les apports, les dépenses et le stockage d’énergie. Un surplus calorique important dérègle ce processus et mène au développement du syndrome métabolique caractérisé, entre autres, par une obésité, un diabète de type II, des maladies cardiovasculaires et des dyslipidémies. La ghréline participe au maintien de l’équilibre énergétique durant le jeûne en stimulant la production de glucose par le foie et le stockage lipidique dans le tissu adipeux. Le coactivateur transcriptionnel PGC-1alpha, surexprimé en situation de jeûne, est impliqué dans l’induction de la production de glucose par le foie et l’oxydation des acides gras. Notre hypothèse est que ces deux acteurs clés du métabolisme énergétique constituent un axe de régulation commun. Dans cette étude, nous montrons que la ghréline participe à la régulation de PGC-1alpha. Son récepteur GHS-R1a, possédant une forte activité constitutive, est également impliqué de façon indépendante au ligand. GHS-R1a réduit l’activité transcriptionnelle de PGC-1alpha tandis que l’ajout du ligand inverse modérément cette action. L’effet de GHS-R1a corrèle avec l’acétylation de PGC-1alpha qui est fortement augmentée de façon dose-dépendante. La stabilité de PGC-1alpha est également augmentée par le GHS-R1a indépendamment de l’ubiquitine. La ghréline diminue la capacité de PGC-1alpha à lier PPARbeta, un récepteur nucléaire partenaire de PGC-1alpha. De plus, la ghréline réduit, de façon ligand-dépendante, la capacité de coactivation de PGC-1alpha sur PPARbeta dans les hépatocytes. L’ensemble de ces résultats identifie PGC-1alpha comme cible du signal de la ghréline et suggère un axe de régulation ghréline/PGC-1alpha/PPARbeta.Une meilleure compréhension de cet axe de régulation va permettre la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques pour faire face aux pathologies associées au syndrome métabolique.