Caractérisation du rôle et des mécanismes d’action des gènes Hoxa dans l’hématopoïèse adulte

Chez les humains, un large pourcentage de leucémies myéloïdes et lymphoïdes exprime des gènes Homéobox (Hox) de façon aberrante, principalement ceux du groupe des gènes Hoxa. Cette dérégulation de l’expression des gènes Hox peut provenir directement des translocations impliquant des gènes Hox ou indirectement par d’autres protéines ayant un potentiel oncogénique. De plus, plusieurs études indiquent que les gènes Hox jouent un rôle essentiel dans l'initiation de diverses leucémies. Comprendre le fonctionnement des gènes Hox dans l'hématopoïèse normale est donc une condition préalable pour élucider leurs fonctions dans les leucémies, ce qui pourrait éventuellement conduire à l’élaboration de nouveaux traitements contre cette maladie. Plusieurs études ont tenté d’élucider les rôles exacts des gènes Hox dans l'hématopoïèse via l’utilisation de souris mutantes pour un seul gène Hox. Or, en raison du phénomène de redondance fonctionnelle chez cette famille de gènes, ces études ont été peu concluantes. Il a été précédemment démontré que dans une population de cellules enrichies en cellules souches hématopoïétiques (CSH), les gènes du cluster Hoxa sont plus exprimés que les gènes Hox des autres clusters. Aussi, il a été établi que les gènes du cluster Hoxb sont non essentiels à l’hématopoïèse définitive puisque les CSH mutantes pour les gènes Hoxb1-9 conservent leur potentiel de reconstitution à long terme. En nous basant sur ces données, nous avons émis l'hypothèse suivante : les gènes Hoxa sont essentiels pour l'hématopoïèse normale adulte. Pour tester notre hypothèse, nous avons choisi d’utiliser un modèle de souris comportant une délétion pour l’ensemble des gènes Hoxa. Dans le cadre de cette recherche, nous avons démontré que les CSH, les progéniteurs primitifs et les progéniteurs des cellules B sont particulièrement sensibles au niveau d'expression des gènes Hoxa. Plus particulièrement, une baisse de la survie et une différenciation prématurée semblent être à l’origine de la perte des CSH Hoxa-/- dans la moelle osseuse. L’analyse du profil transcriptionnel des CSH par séquençage de l'ARN a révélé que les gènes Hoxa sont capables de réguler un vaste réseau de gènes impliqués dans divers processus biologiques. En effet, les gènes Hoxa régulent l’expression de plusieurs gènes codant pour des récepteurs de cytokine. De plus, les gènes Hoxa influencent l’expression de gènes jouant une fonction dans l’architecture de la niche hématopoïétique. L’expression de plusieurs molécules d’adhésion est aussi modulée par les gènes Hoxa, ce qui peut affecter la relation des CSH avec la niche hématopoïétique. L’ensemble de ces résultats démontre que les gènes Hoxa sont d'importants régulateurs de l'hématopoïèse adulte puisqu’ils sont nécessaires au maintien des CSH et des progéniteurs grâce à leurs effets sur plusieurs processus biologiques comme l'apoptose, le cycle cellulaire et les interactions avec la niche.

Rôle des récepteurs Toll-like et de la protéine adaptatrice MyD88 dans la régulation de l’hepcidine et le développement des hyposidérémies associées à l’inflammation

Le fer est un oligo-élément nécessaire pour le fonctionnement normal de toutes les cellules de l'organisme et joue un rôle essentiel dans de nombreuses fonctions biologiques. Cependant, le niveau de fer dans le corps doit être bien réglé, sinon la carence en fer entraine des divers états pathologiques tels que l'anémie et la diminution de l’immunité. D'autre part, une surcharge en fer potentialise la multiplication des germes, aggrave l’infection et la formation de radicaux libres ayant des effets toxiques sur les cellules et leurs composants, ce qui favorise les maladies cardio-vasculaires, l'inflammation et le cancer. L'hepcidine (HAMP), un régulateur négatif de l'absorption du fer, induit la dégradation de la ferroportine (FPN), le seul exportateur connu de fer ce qui réduit sa libération par les macrophages et inhibe son absorption gastro-intestinale. HAMP est synthétisé principalement par les hépatocytes, mais aussi par les macrophages. Cependant, il y a très peu de données sur la façon dont HAMP est régulé au niveau des macrophages. Plus récemment, nous avons constaté que l’induction de l’hepcidin dans le foie par le polysaccharide (LPS) est dépendante de la voie de signalisation médiée par « Toll-like receptor 4 » (TLR4). Grâce au TLR4, le LPS induit l'activation des macrophages qui sécrètent de nombreuses différentes cytokines inflammatoires, y compris Interleukine 6 (IL-6), responsable de l'expression de HAMP hépatique. Dans le premier chapitre de la présente étude, nous avons étudié la régulation de HAMP dans la lignée cellulaire macrophagique RAW264.7 et dans les macrophages péritonéaux murins stimulés par différents ligands des TLRs. Nous avons constaté que TLR2 et TLR4 par l'intermédiaire de la protéine adaptatrice « myeloid differentiation primary response gene 88 » (MyD88) activent l'expression de HAMP dans les cellules RAW264.7 et les macrophages péritonéaux sauvages murins, tandis que cette expression a été supprimée dans les macrophages isolés des souris TLR2-/-, TLR4-déficiente ou MyD88-/-. En outre, nous avons constaté que la production d'IL-6 par les cellules RAW264.7 stimulées avec du LPS a été renforcée par l’ajout des quantités élevées de fer dans le milieu de culture. Au cours de l’inflammation, le niveau de HAMP est fortement augmenté. Ainsi, lorsque l'inflammation persiste, l’expression de HAMP continue à être activée par des cytokines pro-inflammatoires conduisant à une hyposidérémie. Malgré que cette dernière soit considérée comme une défense de l'hôte pour priver les micro-organismes de fer, celle ci cause un développement d'anémies nommées anémies des maladies chroniques. Ainsi, dans le deuxième chapitre de la présente étude, nous avons étudié l'implication des TLRs et leurs protéines adaptatrices MyD88 et TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β (TRIF) dans le développement des hyposidérémies. En utilisant des souris déficientes en MyD88 et TRIF, nous avons montré que les voies de signalisations MyD88 et TRIF sont essentielles pour l’induction de HAMP par le LPS. Malgré l'absence de HAMP, les souris déficientes ont été capables de développer une hyposidérémie, mais la réponse des souris déficientes en MyD88 a été très légère, ce qui indique l'exigence de cette protéine pour assurer une réponse maximale au LPS. En outre, nous avons constaté que la signalisation MyD88 est nécessaire pour le stockage du fer au niveau de la rate, ainsi que l'induction de lipocaline 2 (LCN2), qui est une protéine impliquée dans la fixation du fer pour limiter la croissance bactérienne. Indépendamment de MyD88 ou TRIF, l'activation de TLR4 et TLR3 a conduit, au niveau de la rate, à une diminution rapide de l’expression de FPN et du « Human hemochromatosis protein » (HFE) qui est une protéine qui limite la séquestration du fer cellulaire à partir de la circulation. Cependant, malgré cette baisse d’expression, le manque de la signalisation MyD88 a altéré de manière significative la réponse hyposidérémique. En établissant le rôle des TLRs et de la protéine adaptatrice MyD88 dans la diminution du taux du fer sérique au cours de la réponse inflammatoire, nous avons remarqué qu’en réponse au surcharge en fer les souris déficientes en MyD88 accumulent de manière significative plus de fer hépatique par rapport aux souris sauvages, et cela indépendamment des TLRs. Ainsi, dans le troisième chapitre de la présente étude, nous avons étudié le phénotype observé chez les souris déficientes en MyD88. Nous avons trouvé que l'expression de HAMP chez ces souris a été plus faible que celle des souris de type sauvage. Pour cela, nous avons exploré la signalisation à travers la voie du « Bone Morphogenetic Proteins 6 » (BMP6) qui est considérée comme étant la voie fondamentale de la régulation de HAMP en réponse aux concentrations du fer intracellulaires et extracellulaires et nous avons trouvé que l'expression protéique de Smad4, un régulateur positif de l'expression de HAMP, est significativement plus faible chez les souris MyD88-/- par rapport aux souris sauvages. En outre, on a montré que MyD88 interagit avec « mothers against decapentaplegic, Drosophila, homolog 4 » (Smad4) et que cette interaction est essentielle pour l’induction de HAMP à travers la voie BMP6. En conclusion, notre étude montre que l'expression de HAMP dans les macrophages est régulée principalement par TLR2 et TLR4 à travers la voie MyD88 et que l'accumulation du fer dans les macrophages peut affecter les niveaux des cytokines pro-inflammatoires. En outre, nos analyses démontrent que le développement d’hyposidérémie en réponse au LPS se produit par l'intermédiaire d’un mécanisme dépendant de MyD88 qui est dissociée de la production de cytokines et de HAMP. En plus, nos recherches montrent que MyD88 est nécessaire pour l'expression de Smad4 et cela pour garantir une réponse optimale à travers la signalisation BMP6, conduisant ainsi à une expression adéquate de HAMP. Enfin, la protéine MyD88 joue un rôle crucial dans, la régulation de HAMP au niveau des macrophages, la diminution du taux du fer sérique en réponse au LPS et le maintien de l'homéostasie du fer.

La protéine accessoire Vpu du VIH-1 inhibe l'activité antivirale des pDCs à travers un processus ILT7-dépendant

Viral protein U (Vpu) is an accessory protein of HIV‐1 that efficiently targets BST2/Tetherin, a cellular restriction factor that acts as molecular anchor impeding the release of various enveloped viruses from the cell surface. The recently discovered natural receptor of BST2 is ILT7, a molecule exclusively expressed at the surface of the professional type 1 interferon (IFN‐1) producing cells, plasmacytoid dendritic cells (pDCs). The interaction between BST2 and ILT7 has been reported to efficiently induce a repression of IFN­‐1 secretion by pDCs. Here, we investigated the impact of Vpu mediated antagonism of BST2, in regards to this newly described immune function of BST2. Using a system of CD4+ T cell lines infected with wild type or Vpu‐deficient HIV-­1 cultured with peripheral blood mononuclear cells or purified pDCs, we report that the presence of Vpu efficiently reduces IFN-­1 production from sensing pDCs. Furthermore, we observed that this Vpu effect is dependent on the availability of BST2 molecules at the surface of the infected cells, since the Vpu's immunoregulation is abrogated when blocking any potential BST2 trans interaction with anti­‐BST2 antibodies. Similarly, depleting ILT7 from pDCs by means of small interfering RNA treatment equally negates the downregulation of pDC IFN-­1 secretion by Vpu. Finally, the use of recombinant soluble ILT7 competes with pDC‐bound ILT7 for the free BST2 and similarly results in high IFN-­1 production, causing an identical phenotype. Overall, our results demonstrate that Vpu heightens ILT7 activation and subsequent repression of IFN‐1 production by pDCs in response to HIV­‐1 infected CD4+ T cells by promoting it's trans interaction with infected T cell bound BST2, through a yet uncharacterized mechanism. By allowing efficient particle release and restraining pDCs antiviral functions, Vpu exerts a double role on BST2 that seems crucial for the replication and dissemination of HIV‐1.

Dégradation chimique et biologique de neuf contaminants émergents dans les eaux de surfaces et les effluents primaires d’eaux usées municipales

Un protocole inspiré du test de simulation 309 de l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) nous a permis de mesurer la dégradation chimique (excluant la photolyse) dans des eaux de surface de même que la dégradation chimique et biologique de neuf contaminants émergents dans l’effluent d’un décanteur primaire d’eau usée municipale. Les données étaient compatibles avec le modèle de cinétique de pseudo ordre un. Les résultats démontrant une persistance de plus d’un an dans les eaux de surface et de 71 jours dans l’effluent du décanteur primaire suggèrent que les dégradations chimique et biologique ne contribuent pas significativement à la diminution de: atrazine, déséthylatrazine, carbamazépine et diclofénac dans la phase aqueuse des systèmes testés. Les autres composés se sont dégradés à différents niveaux. Le 17ß-estradiol ainsi que l’éthinylestradiol, la noréthindrone, la caféine et le sulfaméthoxazole ont tous été sujet à la dégradation biologique dans les effluents du décanteur primaire d’eau usée avec des constantes de dégradation k et des demi-vies t1/2 mesurées allant respectivement de 0.0082 à 0.59 j-1 et de 1.2 à 85 jours. Les paramètres de cinétique mesurés peuvent être combinés aux concentrations typiques des composés à l’étude dans un décanteur primaire d’eau usée pour y calculer leur vitesse de dégradation. Cependant, puisque les décanteurs primaires dans les usines de traitement d’eaux usées ont généralement des temps de résidence de quelques heures seulement, il est improbable que les neufs contaminants émergents à l’étude diminuent significativement par ces processus durant leur passage dans le compartiment.

Patrons saisonniers de transformation du carbone et efficacité métabolique des communautés bactériennes du golfe d’Amundsen, Arctique canadien

Les réchauffements climatiques associés aux activités anthropiques ont soumis les écosystèmes arctiques à des changements rapides qui menacent leur stabilité à court terme. La diminution dramatique de la banquise arctique est une des conséquences les plus concrètes de ce réchauffement. Dans ce contexte, comprendre et prédire comment les systèmes arctiques évolueront est crucial, surtout en considérant comment les flux de carbone (C) de ces écosystèmes - soit des puits nets, soit des sources nettes de CO2 pour l'atmosphère - pourraient avoir des répercussions importantes sur le climat. Le but de cette thèse est de dresser un portrait saisonnier de l’activité bactérienne afin de déterminer l’importance de sa contribution aux flux de carbone en Arctique. Plus spécifiquement, nous caractérisons pour la première fois la respiration et le recours à la photohétérotrophie chez les microorganismes du golfe d’Amundsen. Ces deux composantes du cycle du carbone demeurent peu décrites et souvent omises des modèles actuels, malgré leur rôle déterminant dans les flux de C non seulement de l’Arctique, mais des milieux marins en général. Dans un premier temps, nous caractérisons la respiration des communautés microbiennes (RC) des glaces de mer. La connaissance des taux de respiration est essentielle à l’estimation des flux de C, mais encore limitée pour les milieux polaires. En effet, les études précédentes dans le golfe d’Amundsen n’ont pas mesuré la RC. Par la mesure de la respiration dans les glaces, nos résultats montrent des taux élevés de respiration dans la glace, de 2 à 3 fois supérieurs à la colonne d'eau, et une production bactérienne jusqu’à 25 fois plus importante. Ces résultats démontrent que la respiration microbienne peut consommer une proportion significative de la production primaire (PP) des glaces et pourrait jouer un rôle important dans les flux biogéniques de CO2 entre les glaces de mer et l’atmosphère (Nguyen et Maranger, 2011). Dans un second temps, nous mesurons la respiration des communautés microbiennes pélagiques du golfe d’Amundsen pendant une période de 8 mois consécutif, incluant le couvert de glace hivernal. En mesurant directement la consommation d'O2, nous montrons une RC importante, mesurable tout au long de l’année et dépassant largement les apports en C de la production primaire. Globalement, la forte consommation de C par les communautés microbiennes suggère une forte dépendance sur recyclage interne de la PP locale. Ces observations ont des conséquences importantes sur notre compréhension du potentiel de séquestration de CO2 par les eaux de l’Océan Arctique (Nguyen et al. 2012). Dans un dernier temps, nous déterminons la dynamique saisonnière de présence (ADN) et d’expression (ARN) du gène de la protéorhodopsine (PR), impliqué dans la photohétérotrophie chez les communautés bactérienne. Le gène de la PR, en conjonction avec le chromophore rétinal, permet à certaines bactéries de capturer l’énergie lumineuse à des fins énergétiques ou sensorielles. Cet apport supplémentaire d’énergie pourrait contribuer à la survie et prolifération des communautés qui possèdent la protéorhodopsine. Bien que détectée dans plusieurs océans, notre étude est une des rares à dresser un portrait saisonnier de la distribution et de l’expression du gène en milieu marin. Nous montrons que le gène de la PR est présent toute l’année et distribué dans des communautés diversifiées. Étonnamment, l’expression du gène se poursuit en hiver, en absence de lumière, suggérant soit qu’elle ne dépend pas de la lumière, ou que des sources de photons très localisées justifie l’expression du gène à des fins sensorielles et de détection (Nguyen et al., soumis au journal ISME). Cette thèse contribue à la compréhension du cycle du C en Arctique et innove par la caractérisation de la respiration et de l’efficacité de croissance des communautés microbiennes pélagiques et des glaces de mer. De plus, nous montrons pour la première fois une expression soutenue de la protéorhodopsine en Arctique, qui pourrait moduler la consommation de C par la respiration et justifier son inclusion éventuelle dans les modélisations du cycle du C. Dans le contexte des changements climatiques, il est clair que l'importance de l’activité bactérienne a été sous-estimée et aura un impact important dans le bilan de C de l'Arctique.

Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires : détermination du rôle des séquences 3' non traduites

Le transport actif de sodium par les cellules épithéliales alvéolaires est le principal mécanisme impliqué dans la régulation du niveau de liquide dans le poumon distal. Le canal épithélial sodique (ENaC) exprimé par les cellules épithéliales alvéolaires est essentiel à la résorption du liquide des poumons à la naissance ainsi que la résolution de l'œdème pulmonaire chez l'adulte. L'activité et l'expression du canal ENaC sont modulées par de nombreux stress pathophysiologiques. L'inflammation pulmonaire constitue un facteur important dans l'inhibition de l'expression du canal ENaC et pourrait favoriser la formation d'œdème pulmonaire. Nous avons précédemment démontré que différentes cytokines pro-inflammatoires, ainsi que les lipopolysaccharides (LPS) de Pseudomonas aeruginosa, inhibent l'expression de l'ARNm αENaC par des mécanismes de régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle. Ces résultats suggèrent que les mécanismes qui modulent la stabilité des ARNm αENaC pourraient jouer un rôle important dans la régulation du niveau d’expression du transcrit en condition inflammatoire. Le principal objectif de mes travaux était de caractériser les mécanismes de modulation de l’ARNm αENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires lors de différents stress pathophysiologiques et déterminer si cette modulation pouvait s’expliquer en partie par une régulation de la stabilité du transcrit. Mes travaux montrent que les LPS et la cycloheximide inhibent l’expression de l’ARNm αENaC de façon similaire via l’activation des voies de signalisation des MAPK ERK1/2 et p38. Cependant, les mécanismes de modulation de l’expression de l'ARNm αENaC sont différents puisque les LPS répriment la transcription du gène, alors que la cycloheximide diminuerait la stabilité du transcrit via des mécanismes post-transcriptionnels impliquant la région 3' non traduite (3'UTR) de l'ARNm αENaC. Pour mieux étudier le rôle du 3'UTR dans ce processus, nous avons développé un modèle Tet-Off nous permettant de mesurer la demi-vie de l’ARNm αENaC indépendamment de l’utilisation d’un inhibiteur de la transcription comme l'actinomycine D (Act. D). Nous avons montré que la demi-vie de l’ARNm αENaC était de 100min, un temps beaucoup plus court que celui rapporté dans la littérature. Nous avons démontré que l’Act. D a un effet stabilisateur important sur l’ARNm αENaC et qu’il ne peut être utilisé pour évaluer la stabilité du transcrit. À l’aide de différents mutants de délétion, nous avons entrepris de déterminer la nature des régions du 3’UTR impliquées dans la modulation de la stabilité du transcrit. Nous avons trouvé que le 3’UTR joue un rôle à la fois de stabilisation (région 3’UTR proximale) et de déstabilisation (région 3’UTR distale) du transcrit. Notre système nous a finalement permis de confirmer que la diminution de l’ARNm αENaC observée en présence de TNF-α s’expliquait en partie par une diminution importante de la stabilité du transcrit induite par cette cytokine. Enfin, nous avons identifié la nature des protéines pouvant se lier au 3’UTR de l’ARNm αENaC et déterminé lesquelles pouvaient moduler la stabilité du transcrit. Des trois protéines candidates trouvées, nous avons confirmé que la surexpression de DHX36 et TIAL1 diminue le niveau de transcrit par un mécanisme impliquant la stabilité du messager. Les travaux présentés ici montrent la complexité des voies de signalisation induites par différents stress sur les cellules épithéliales alvéolaires et montrent comment la stabilité de l’ARNm αENaC et en particulier, les séquences du 3’UTR jouent un rôle important dans la modulation du niveau de transcrit. Le modèle Tet-Off que nous avons développé permet d’estimer le temps de demi-vie réel de l’ARNm αENaC et montre que le 3’UTR du messager joue un rôle complexe dans la stabilisation du messager en condition de base ainsi qu’en condition pro-inflammatoire. Enfin, nous avons identifié deux protéines liant l’ARNm qui pourraient jouer un rôle important dans la modulation de la stabilité du transcrit.

TDP-43 régule la dynamique et la fonction des Granules de Stress via G3BP1

Les Granule de Stress (GS) sont des inclusions cytoplasmiques contenant des protéines et des ARNm qui s’assemblent en réponse à l’exposition à un stress. Leur formation fait partie intégrante de la réponse cellulaire au stress et est considérée comme une étape déterminante pour la résistance au stress et la survie cellulaire. Actuellement, les GS sont reliés à divers pathologies allant des infections virales aux maladies neurovégétatives. L’une d’entre elle, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est particulièrement agressive, caractérisée par une perte des neurones moteurs aboutissant à la paralysie et à la mort du patient en cinq ans en moyenne. Les mécanismes de déclenchement de la pathologie restent encore à déterminer. TDP-43 (TAR DNA binding protein 43) et FUS (Fused in liposarcoma) sont deux protéines reliées à la pathologie qui présentent des similarités de structure et de fonction, suggérant un mécanisme commun de toxicité. TDP-43 et FUS sont toutes les deux recrutées au niveau des GS en condition de stress. Nous avons démontré pour la première fois que la fonction des GS est de protéger les ARNm de la dégradation induite par l’exposition au stress. Cette fonction n’était que suspectée jusqu’alors. De plus nous avons mis en évidence que G3BP1 (Ras GTPase-activating protein-binding protein 1) est l’effectrice de cette fonction via son implication dans la dynamique de formation des GS. TDP-43 étant un régulateur de G3BP1, nous prouvons ainsi que la perte de fonction de TDP-43/G3BP1 aboutit à un défaut de réponse au stress aboutissant à une vulnérabilisation cellulaire. Le mécanisme de toxicité emprunter par FUS diffère de celui de TDP-43 et ne semble pas passer par une perte de fonction dans le cadre de la réponse au stress.

Effets des changements climatiques sur la santé et la sécurité des travailleurs au Québec

Les impacts des changements climatiques sur la population sont nombreux et ont été relativement bien documentés, ce qui n’est pas le cas de ces impacts sur la santé et la sécurité des travailleurs. L’objectif de cette thèse est de documenter les effets négatifs des changements climatiques sur la santé et la sécurité des travailleurs dans une région d’un pays industrialisé à climat tempéré, comme le Québec. Pour y arriver, deux approches ont été utilisées : a) les dangers et les effets sanitaires ont été identifiés par une revue de la littérature validée par des experts nationaux et internationaux, et des priorités de recherche ont été établies à l’aide d’une méthode de consultation itérative, b) des modèles statistiques, utiles à l’estimation des impacts sanitaires des changements climatiques, ont été développés pour apprécier les associations entre la survenue de lésions professionnelles et l’exposition des travailleurs aux chaleurs estivales et à l’ozone troposphérique, deux problématiques préoccupantes pour le Québec. Le bilan des connaissances a mis en évidence cinq catégories de dangers pouvant affecter directement ou indirectement la santé et la sécurité des travailleurs au Québec (vagues de chaleur, polluants de l’air, rayonnements ultraviolets, événements météorologiques extrêmes, maladies vectorielles transmissibles et zoonoses) et cinq conditions pouvant entraîner des modifications dans l’environnement de travail et pouvant ultimement affecter négativement la santé et la sécurité des travailleurs (changements dans les méthodes agricoles et d’élevage, altérations dans l’industrie de la pêche, perturbations de l’écosystème forestier, dégradation de l’environnement bâti et émergence de nouvelles industries vertes). Quant aux modélisations, elles suggèrent que les indemnisations quotidiennes pour des maladies liées à la chaleur et pour des accidents de travail augmentent avec les températures estivales, et que ces associations varient selon l’âge des travailleurs, le secteur industriel et la catégorie professionnelle (manuelle vs autre). Des associations positives statistiquement non significatives entre les indemnisations pour des atteintes respiratoires aiguës et les concentrations d’ozone troposphérique ont aussi été observées. Dans l’ensemble, cette thèse a permis de dégager douze pistes de recherche prioritaires pour le Québec se rapportant à l’acquisition de connaissances, à la surveillance épidémiologique et au développement de méthodes d’adaptation. Selon les résultats de cette recherche, les intervenants en santé au travail et les décideurs devraient déployer des efforts pour protéger la santé et la sécurité des travailleurs et mettre en place des actions préventives en vue des changements climatiques.

Vers une prise en charge améliorée des patients avec glycogénose : nouvelles approches diagnostique et thérapeutique

Les glycogénoses sont des maladies touchant la synthèse ou la dégradation du glycogène. Un diagnostic précoce et une diète optimale, incluant la prévention des hypoglycémies, sont d’une importante cruciale pour le devenir des patients. Les présents travaux visaient la confirmation génétique de glycogénose chez des patients inuits du Nunavik ainsi que l’évaluation de l’impact sur le sommeil et la qualité de vie d’une nouvelle thérapie nutritionnelle, GlycosadeTM, dans une cohorte de patients montréalaise. Par séquençage d’exome, nous avons identifié la mutation causale de glycogénose au Nunavik, permettant un diagnostic précoce et un dépistage des membres de la famille. Nous avons aussi introduit une fécule de maïs à action prolongée et évalué prospectivement le sommeil et la qualité de vie des patients avec glycogénose avant et après ce traitement. Nous avons mis en évidence des troubles de sommeil chez les patients et avons discuté du GlycosadeTM comme d’une option thérapeutique prometteuse.

Analyse par spectrométrie de masse des antibiotiques vétérinaires liés à l’élevage porcin

L’élevage des porcs représente une source importante de déversement d’antibiotiques dans l’environnement par l’intermédiaire de l’épandage du lisier qui contient une grande quantité de ces molécules sur les champs agricoles. Il a été prouvé que ces molécules biologiquement actives peuvent avoir un impact toxique sur l’écosystème. Par ailleurs, elles sont aussi suspectées d’engendrer des problèmes sanitaires et de contribuer à la résistance bactérienne pouvant mener à des infections difficilement traitables chez les humains. Le contrôle de ces substances dans l’environnement est donc nécessaire. De nombreuses méthodes analytiques sont proposées dans la littérature scientifique pour recenser ces composés dans plusieurs types de matrice. Cependant, peu de ces méthodes permettent l’analyse de ces contaminants dans des matrices issues de l’élevage agricole intensif. Par ailleurs, les méthodes analytiques disponibles sont souvent sujettes à des faux positifs compte tenu de la complexité des matrices étudiées et du matériel utilisé et ne prennent souvent pas en compte les métabolites et produits de dégradation. Enfin, les niveaux d’analyse atteints avec ces méthodes ne sont parfois plus à jour étant donné l’évolution de la chimie analytique et de la spectrométrie de masse. Dans cette optique, de nouvelles méthodes d’analyses ont été développées pour rechercher et quantifier les antibiotiques dans des matrices dérivées de l’élevage intensif des porcs en essayant de proposer des approches alternatives sensibles, sélectives et robustes pour quantifier ces molécules. Une première méthode d’analyse basée sur une technique d’introduction d’échantillon alternative à l’aide d’une interface fonctionnant à l’aide d’une désorption thermique par diode laser munie d’une source à ionisation à pression atmosphérique, couplée à la spectrométrie de masse en tandem a été développée. L’objectif est de proposer une analyse plus rapide tout en atteignant des niveaux de concentration adaptés à la matrice étudiée. Cette technique d’analyse couplée à un traitement d’échantillon efficace a permis l’analyse de plusieurs antibiotiques vétérinaires de différentes classes dans des échantillons de lisier avec des temps d’analyse courts. Les limites de détection atteintes sont comprises entre 2,5 et 8,3 µg kg-1 et sont comparables avec celles pouvant être obtenues avec la chromatographie liquide dans une matrice similaire. En vue d’analyser simultanément une série de tétracyclines, une deuxième méthode d’analyse utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) a été proposée. L’utilisation de la HRMS a été motivée par le fait que cette technique d’analyse est moins sensible aux faux positifs que le triple quadripôle traditionnel. Des limites de détection comprises entre 1,5 et 3,6 µg kg-1 ont été atteintes dans des échantillons de lisier en utilisant un mode d’analyse par fragmentation. L’utilisation de méthodes de quantifications ciblées est une démarche intéressante lorsque la présence de contaminants est suspectée dans un échantillon. Toutefois, les contaminants non intégrés à cette méthode d’analyse ciblée ne peuvent être détectés même à de fortes concentrations. Dans ce contexte, une méthode d’analyse non ciblée a été développée pour la recherche de pharmaceutiques vétérinaires dans des effluents agricoles en utilisant la spectrométrie de masse à haute résolution et une cartouche SPE polymérique polyvalente. Cette méthode a permis l’identification d’antibiotiques et de pharmaceutiques couramment utilisés dans l’élevage porcin. La plupart des méthodes d’analyse disponibles dans la littérature se concentrent sur l’analyse des composés parents, mais pas sur les sous-produits de dégradation. L’approche utilisée dans la deuxième méthode d’analyse a donc été étendue et appliquée à d’autres classes d’antibiotiques pour mesurer les concentrations de plusieurs résidus d’antibiotiques dans les sols et les eaux de drainage d’un champ agricole expérimental. Les sols du champ renfermaient un mélange d’antibiotiques ainsi que leurs produits de dégradation relatifs à des concentrations mesurées jusqu’à 1020 µg kg-1. Une partie de ces composés ont voyagé par l’intermédiaire des eaux de drainage du champ ou des concentrations pouvant atteindre 3200 ng L-1 ont pu être relevées.

La génétique inverse dans l'étude des réovirus: Progrès, obstacles et développements futurs

En génétique dite « classique », l’examen d’un phénotype conduit à l’étude des gènes impliqués dans son obtention. La génétique inverse est une méthode expérimentale très puissante dans laquelle, au contraire, le matériel génétique est modifié et utilisé pour reconstruire un organisme complet, afin de déterminer le résultat de ces modifications. Cette approche est spécialement bien adaptée à l'étude des virus, compte tenu de la relative simplicité et de la petite taille de leurs génomes; l’obstacle principal demeure de récupérer des virus infectieux à partir de génomes viraux clonés. Au cours des années, cet exploit a été accompli pour des représentants de presque toutes les familles de virus de mammifères. Jusqu’à récemment, les Reoviridae, virus à génome d'ARN bicaténaire segmenté, faisaient toutefois exception. Dans cette revue, les progrès réalisés vers la mise au point de la génétique inverse pour l'étude du réovirus seront discutés. La génétique inverse pourrait avoir un impact majeur dans l'optimisation de nouvelles souches de réovirus pour leur utilisation en thérapie comme agents oncolytiques et pour le développement de vaccins dans le cas des rotavirus et des orbivirus. Les travaux actuels font toutefois ressortir les limites de l'approche, la nécessité d’une analyse prudente des résultats obtenus, ainsi que le besoin de développer des systèmes plus efficaces et polyvalents.

Déterminer le lien entre l’hyperglycémie et/ou l’hypoinsulinémie et la dégradation clinique observée avant le diagnostic du Diabète Associé à la Fibrose Kystique.

La Fibrose kystique (FK) est une maladie génétique qui se traduit par une destruction progressive des poumons et éventuellement, à la mort. La principale complication secondaire est le diabète associé à la FK (DAFK). Une dégradation clinique (perte de poids et de la fonction pulmonaire) accélérée est observée avant le diagnostic. L’objectif principal de mon projet de doctorat est de déterminer, par l’intermédiaire du test d’hyperglycémie provoquée par voie orale (HGPO), s’il existe un lien entre l’hyperglycémie et/ou l’hypoinsulinémie et la dégradation clinique observée avant le diagnostic du DAFK. Nous allons ainsi évaluer l’importance des temps intermédiaires de l’HGPO afin de simplifier le diagnostic d’une dysglycémie ainsi que d’établir des nouveaux marqueurs indicateurs de patients à risque d’une détérioration clinique. L’HGPO est la méthode standard utilisée dans la FK pour le diagnostic du DAFK. Nous avons démontré que les valeurs de glycémie obtenues au temps 90-min de l’HGPO seraient suffisantes pour prédire la tolérance au glucose des patients adultes avec la FK, autrement établie à l’aide des valeurs à 2-h de l’HGPO. Nous proposons des glycémies à 90-min de l’HGPO supérieure à 9.3 mmol/L et supérieure à 11.5 mmol/L pour détecter l’intolérance au glucose et le DAFK, respectivement. Une cause importante du DAFK est un défaut de la sécrétion d’insuline. Les femmes atteintes de la FK ont un risque plus élevé de développer le DAFK que les hommes, nous avons donc exploré si leur sécrétion était altérée. Contrairement à notre hypothèse, nous avons observé que les femmes avec la FK avaient une sécrétion d’insuline totale plus élevée que les hommes avec la FK, mais à des niveaux comparables aux femmes en santé. Le groupe de tolérance au glucose récemment proposé et nommé indéterminé (INDET : 60-min HGPO > 11.0 mais 2h-HGPO <7.8mmol/L) est à risque élevé de développer le DAFK. Par contre, les caractéristiques cliniques de ce groupe chez les patients adultes avec la FK n’ont pas été établies. Nous avons observé que le groupe INDET a une fonction pulmonaire réduite et similaire au groupe DAFK de novo et aucun des paramètres glucidiques et insulinémiques expliqueraient cette observation. Dans une population pédiatrique de patients avec la FK, une association a été rapportée entre une glycémie élevée à 60-min de l’HGPO et une fonction pulmonaire diminuée. Dans notre groupe de patients adultes avec la FK, il existe une association négative entre la glycémie à 60-min de l’HGPO et la fonction pulmonaire et une corrélation positive entre l’insulinémie à 60-min de l’HGPO et l’indice de masse corporelle (IMC). De plus, les patients avec une glycémie à 60-min HGPO > 11.0 mmol/L ont une fonction pulmonaire diminuée et une sensibilité à l’insuline basse alors que ceux avec une insulinémie à 60-min HGPO < 43.4 μU/mL ont un IMC ainsi qu’une fonction pulmonaire diminués. En conclusion, nous sommes le premier groupe à démontrer que 1) le test d’HGPO peut être raccourci de 30 min sans compromettre la catégorisation de la tolérance au glucose, 2) les femmes avec la FK démontrent une préservation de leur sécrétion de l’insuline, 3) le groupe INDET présente des anomalies précoces de la fonction pulmonaire comparable au groupe DAFK de novo et 4) la glycémie et l’insuline à la première heure de l’HGPO sont associées aux deux éléments clefs de la dégradation clinique. Il est crucial d’élucider les mécanismes pathophysiologiques importants afin de mieux prévoir la survenue de la dégradation clinique précédant le DAFK.

Influence de l'ubiquitylation initiale des substrats SH3 sur leur régulation par la ligase Itch

Ce projet de recherche explore un nouveau mécanisme de régulation de l’activité du domaine HECT de la ligase Itch. Ce domaine est responsable de la polyubiquitylation des protéines impliquant le plus souvent leur dégradation par le protéasome. Itch est une ligase de l’ubiquitine de la famille CWH contenant un domaine HECT catalytique en C-terminal, quatre domaines WW, et un domaine C2 N-terminal qui est important pour sa localisation cellulaire. Les ligases CWH interagissent par leur domaine WW avec leurs ligands. Un mécanisme proposé pour ces ligases est que la première molécule d’ubiquitine liée au substrat active le domaine HECT de manière à former une chaine d’ubiquitine sur le substrat. Itch a une particularité dans la famille CWH, car elle possède un domaine riche en proline qui lui permet d’interagir avec plusieurs protéines à domaine SH3. Dans cette étude, nous avons déterminé l’effet de l’ubiquitylation initiale des protéines SH3 sur l’activité du domaine HECT de la ligase Itch, et sur la régulation de ces substrats.

Caractérisation des interactions établies par la région riche en prolines de la ligase de l’ubiquitine Itch.

Itch est un membre de la famille des ligases de l’ubiquitine de type CWH (C2-WW- HECT) impliqué dans le contrôle de la signalisation inflammatoire, des facteurs de transcription et le tri des récepteurs membranaires. La fonction d’Itch implique généralement sa capacité à induire la dégradation de ses substrats. Pour accomplir cette fonction, Itch doit d’abord interagir avec ses cibles. Itch possède quatre domaines WW lui permettant d’accomplir la majorité de ses fonctions. En plus de ces domaines, Itch possède une PRR (région riche en prolines) unique parmi les ligases CWH. Cette région est bien conservée chez les vertébrés, ce qui suggère son importance. Cette région permet à Itch d’interagir avec des protéines contenant un domaine SH3 (Src homology 3). Plusieurs partenaires SH3 furent identifiés, cependant l’on connait peu de choses concernant la fonction et l’établissement de ces complexes. Dans ce projet, nous avons analysé les propriétés de liaison d’un sous-groupe de protéines à domaine SH3 impliquées dans l’endocytose et la signalisation cellulaire. Nos travaux ont permis d’identifier de nouveaux partenaires et aussi de déterminer que différents domaines SH3 ciblent la même région riche en prolines, mais impliquent des résidus distincts. Ces résultats démontrent la variété des propriétés de liaison démontrées par la PRR d’Itch et sa préférence marquée pour l’Endophiline. Parmi les partenaires identifiés, Grb2 (Growth factor receptor-bound protein 2) est particulièrement intéressant en raison de son rôle crucial dans la signalisation cellulaire. Nous avons démontré ici qu’Itch ubiquityle Grb2, mais ne cause pas sa dégradation, contrairement à l’Endophiline. Nos travaux démontrent que la PRR d’Itch est versatile quant à ses interactions et leurs conséquences.

Régulation protéasome-dépendante de l'activité transcriptionnelle des récepteurs des estrogènes

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.