L’implication du Stromal Cell-derived Factor-1 alpha dans le remodelage cardiaque une semaine après un infarctus du myocarde

L’injection de cellules souches provenant de la moelle osseuse est reconnue pour améliorer la fonction ventriculaire ainsi que le remodelage cicatriciel après un infarctus du myocarde (IM). Le Stromal Cell-derived factor-1 alpha (SDF-1 alpha), une chimiokine induite par l’ischémie cardiaque, représente une grande importance en raison de son rôle dans le recrutement de cellules inflammatoires et de cellules souches de la moelle osseuse vers les sites endommagés. Quoique les recherches sur le rôle de la chimiokine SDF-1 alpha dans le remodelage ventriculaire se multiplient, son implication dans la phase aiguë du remodelage reste inexplorée. Le but de la présente étude est de déterminer l’effet du SDF-1 alpha sur la taille de la cicatrice, l’hypertrophie cardiaque ainsi que la fonction ventriculaire chez des rats et des souris une semaine après un IM. La stratégie utilisée implique l’administration de l’AMD3100 (1 mg/kg, 24 heures après l’IM, pendant 6 jours), l’antagoniste sélectif du récepteur du SDF-1 alpha, le CXCR4. Ce récepteur est couplé à une protéine G alpha i et induit la migration et la prolifération cellulaire. Chez les rats du groupe IM, l’expression de la chimiokine a été détectée surtout dans les cellules musculaires lisses et les cellules endothéliales des vaisseaux cicatriciels. Le profil d’expression de la chimiokine dans le cœur infarci indique un gradient de concentration vers la cicatrice. Une semaine après l’IM, le traitement avec l’AMD3100 a diminué la taille de la cicatrice, résultant en une amélioration de la fonction ventriculaire et une diminution de l’élévation de l’expression de l’ARNm de l’ANP dans le ventricule gauche non infarci (VGNI). Chez les souris, le traitement avec l’AMD3100 a engendré les mêmes effets, soit une diminution de la taille de la cicatrice ainsi qu’une amélioration de la fonction ventriculaire. La réduction de la taille de la région infarcie chez les souris traitées avec l’AMD3100 est associée avec une atténuation de l’infiltration des neutrophiles dans la région ischémique. Ces résultats suggèrent que le blocage pharmacologique de l’axe SDF-1 alpha/CXCR4 lors de la phase aiguë du remodelage ventriculaire après un IM diminue la taille de la cicatrice et améliore la fonction ventriculaire, en partie, par la diminution de la réaction inflammatoire.

Early growth response protein 1 (Egr-1) expression by Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) involves MAPKs and PKB pathways

Un remodelage vasculaire anormal est à la base de la pathogenèse des maladies cardio-vasculaires (MCV) telles que l’athérosclérose et l’hypertension. Des dysfonctionnements au niveau de la migration, l’hypertrophie et la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sont des évènements cellulaires qui jouent un rôle primordial dans le remodelage vasculaire. L’insulin-like growth factor 1 (IGF-1), puissant facteur mitogène, contribue au développement des MCV, notamment via l’activation des protéines MAPK et PI3-K/PKB, composantes clés impliquées dans les voies de croissance cellulaire. Ces molécules sont également impliquées dans la modulation de l’expression de nombreux facteurs de transcription, incluant le facteur Egr-1. Egr-1 est régulé à la hausse dans différents types de maladies vasculaires impliquant les voies de signalisation de croissance et de stress oxydant qui par ailleurs peuvent être déclenchées par l’IGF-1. Cependant, la question d’une possible modulation de l’expression d’Egr-1 dans les CMLV demeure inabordée; plus spécifiquement, la caractérisation de la voie de signalisation reliant l’action d’IGF-1 à l’expression d’Egr-1 reste à établir. Dans cette optique, l’objectif de cette étude a été d’examiner l’implication de MAPK, PKB et des dérivés réactifs de l’oxygène (DRO) dans l’expression d’Egr-1 induite par l’IGF-1 dans les CMLV. L’IGF-1 a induit une augmentation marquée du niveau protéique de l’Egr-1 en fonction du temps et de la concentration utilisés. Cette augmentation a été inhibée en fonction des doses d’agents pharmacologiques qui ciblent les voies de signalisation de MAPK, PKB et DRO. De plus, l’expression du facteur de transcription, Egr-1, en réponse de l’IGF-1, a été atténuée suite à un blocage pharmacologique des processus cellulaires responsables de la synthèse d’ARN et de synthèse protéique. Pour conclure, on a démontré que l’IGF-1 stimule l’expression d’Egr-1 via les voies de signalisation, impliquant ERK1/2/JNK, PI3K/PKB. On a également proposé que les DRO jouent un rôle important dans ce processus. Dans l’ensemble, nous avons suggéré un nouveau mécanisme par lequel l’IGF-1 promeut la prolifération et l’hypertrophie cellulaire, processus à la base des anomalies vasculaires.

Caractérisation de l'oncogène MLF1 (Myeloid Leukemia Factor 1)

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Rôle de l’acétylation/déacétylation des histones dans la régulation de l’expression des gènes de la COX-2, iNOS et mPGES-1 dans les tissus articulaires.

L’arthrose ou ostéoarthrose (OA) est l’affection rhumatologique la plus fréquente au monde. Elle est caractérisée principalement par une perte du cartilage articulaire et l’inflammation de la membrane synoviale. L’interleukine (IL)-1ß, une cytokine pro-inflammatoire, joue un rôle très important dans la pathogenèse de l’OA. Elle exerce son action en induisant l’expression des enzymes cyclo-oxygénase 2 (COX-2), prostaglandine E synthétase microsomale 1 (mPGES-1) et l’oxyde nitrique synthétase inductible (iNOS) ainsi que la production de la prostaglandine E2 (PGE2) et de l’oxyde nitrique (NO). Ces derniers (PGE2 et NO) contribuent à la synovite et la destruction du cartilage articulaire par leurs effets pro-inflammatoires, pro-cataboliques, anti-anaboliques, pro-angiogéniques et pro-apoptotiques. Les modifications épigénétiques, telles que la méthylation de l’ADN, et l’acétylation et la méthylation des histones, jouent un rôle crucial dans la régulation de l’expression des gènes. Parmi ces modifications, l’acétylation des histones est la plus documentée. Ce processus est contrôlé par deux types d’enzymes : les histones acétyltransférases (HAT) qui favorisent la transcription et les histones déacétylases (HDAC) qui l’inhibent. L’objectif de ce travail est d’examiner le rôle des enzymes HDAC dans la régulation de l’expression de la COX-2, mPGES-1 et iNOS. Nous avons montré qu’au niveau des chondrocytes, les inhibiteurs des HDAC (iHDAC), trichostatine A (TSA) et butyrate de sodium (NaBu), suppriment l’expression de la COX-2 et iNOS au niveau de l’ARNm et protéique, ainsi que la production de la PGE2 et du NO, induites par l’IL-1ß. L’effet inhibiteur à lieu sans affecter l’activité de liaison à l’ADN du facteur de transcription NF-κB (nuclear factor κ B). La TSA et le NaBu inhibent également la dégradation induite par l’IL-1ß des protéoglycanes au niveau du cartilage. Nous avons également montré, qu’au niveau des fibroblastes synoviaux, les iHDAC, TSA, NaBu et acide valproïque (VA), suppriment l’expression de la mPGES-1 ainsi que la production de la PGE2 induites par l’IL-1ß. En utilisant diverses approches expérimentales, nous avons montré que HDAC4 est impliquée dans l’induction de l’expression de la mPGES-1 par l’IL-1ß. HDAC4 exerce son action, via son activité déacétylase, en augmentant l’activité transcriptionnelle de Egr-1 (early growth factor 1), facteur de transcription principal de l’expression de la mPGES-1. L’ensemble de ces résultats suggère que les inhibiteurs des HDAC pourraient être utilisés dans le traitement de l’OA.

Étude du rôle des gènes TGF-β1 et HSP-70 lors du processus de régénération du membre chez l’axolotl

Les urodèles amphibiens, dont fait partie l’axolotl (Ambystoma mexicanum), ont la capacité de régénérer leurs organes et membres suite à une amputation, tout au long de leur vie. La patte est l’organe dont le processus de régénération est le mieux caractérisé et ce dernier est divisé en deux phases principales. La première est la phase de préparation et commence immédiatement suite à l’amputation. Elle renferme des étapes essentielles au processus de régénération comme la guérison de la plaie et la formation d’une coiffe apicale ectodermique. Par la suite, les fibroblastes du derme et certaines cellules musculaires vont revenir à un état pluripotent via un processus appelé dédifférenciation cellulaire. Une fois dédifférenciées, ces cellules migrent et s’accumulent sous la coiffe apicale pour former le blastème. Lors de la phase de redéveloppement, les cellules du blastème se divisent puis se redifférencient pour régénérer la partie amputée. Fait intéressant, la régénération d’un membre ou la guérison d’une plaie chez l’axolotl ne mène jamais à la formation d’une cicatrice. Afin d’en apprendre plus sur le contrôle moléculaire de la régénération, les gènes Heat-shock protein-70 (Hsp-70) et Transforming growth factor-β1 (Tgf-β1) ont été sélectionnés. Ces gènes jouent un rôle important dans la réponse au stress et lors de la guérison des plaies chez les mammifères. HSP-70 est une chaperonne moléculaire qui est produite pour maintenir l’intégrité des protéines cellulaires lorsqu’un stress se présente. TGF-β1 est une cytokine produite suite à une blessure qui active la réponse inflammatoire et qui stimule la fermeture de la plaie chez les amniotes. Les résultats présentés dans cette thèse démontrent que Hsp-70 est exprimé et régulé lors du développement et de la régénération du membre chez l’axolotl. D’autre part, nos expériences ont mené à l’isolation de la séquence codante pour Tgf-β1 chez l’axolotl. Nos résultats montrent que Tgf-β1 est exprimé spécifiquement lors de la phase de préparation dans le membre en régénération. De plus, le blocage de la voie des Tgf-β avec l’inhibiteur pharmacologique SB-431542, lors de la régénération, mène à l’inhibition du processus. Ceci démontre que la signalisation via la voie des Tgf-β est essentielle à la régénération du membre chez l’axolotl.

Interactions protéiques et relation dynamique entre phosphorylation / sumoylation / ubiquitination des protéines TIF1α, β et PML: détection in vivo par BRET

Trois protéines de la famille TRIM (Motif TRIpartite), TIF1α, β (Transcriptional Intermediary Factor 1) et PML (ProMyelocytic Leukaemia¬), font l’objet de cette étude. TIF1α est connu comme un coactivateur des récepteurs nucléaires et TIF1β comme le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc dont le prototype étudié ici est ZNF74. PML possède divers rôles dont le plus caractérisé est celui d’être l’organisateur principal et essentiel des PML-NBs (PML-Nuclear Bodies), des macrostructures nucléaires très dynamiques regroupant et coordonnant plus de 40 protéines. Il est à noter que la fonction de TIF1α, β et PML est régulée par une modification post-traductionnelle, la sumoylation, qui implique le couplage covalent de la petite protéine SUMO (Small Ubiquitin like MOdifier) à des lysines de ces trois protéines cibles. Cette thèse propose de développer des méthodes utilisant le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfert) afin de détecter dans des cellules vivantes et en temps réel des interactions non-covalentes de protéines nucléaires mais aussi leur couplage covalent à SUMO. En effet, le BRET n’a jamais été exploré jusqu’alors pour étudier les interactions non-covalentes et covalentes de protéines nucléaires. L’étude de l’interaction de protéines transcriptionnellement actives est parfois difficile par des méthodes classiques du fait de leur grande propension à agréger (famille TRIM) ou de leur association à la matrice nucléaire (ZNF74). L’homo et l’hétérodimérisation de TIF1α, β ainsi que leur interaction avec ZNF74 sont ici testées sur des protéines entières dans des cellules vivantes de mammifères répondant aux résultats conflictuels de la littérature et démontrant que le BRET peut être avantageusement utilisé comme alternative aux essais plus classiques basés sur la transcription. Du fait de l’hétérodimérisation confirmée de TIF1α et β, le premier article présenté ouvre la possibilité d’une relation étroite entre les récepteurs nucléaires et les protéines KRAB- multidoigt de zinc. Des études précédentes ont démontré que la sumoylation de PML est impliquée dans sa dégradation induite par l’As2O3 et dépendante de RNF4, une E3 ubiquitine ligase ayant pour substrat des chaînes de SUMO (polySUMO). Dans le second article, grâce au développement d’une nouvelle application du BRET pour la détection d’interactions covalentes et non-covalentes avec SUMO (BRETSUMO), nous établissons un nouveau lien entre la sumoylation de PML et sa dégradation. Nous confirmons que le recrutement de RNF4 dépend de SUMO mais démontrons également l’implication du SBD (Sumo Binding Domain) de PML dans sa dégradation induite par l’As2O3 et/ou RNF4. De plus, nous démontrons que des sérines, au sein du SBD de PML, qui sont connues comme des cibles de phosphorylation par la voie de la kinase CK2, régulent les interactions non-covalentes de ce SBD mettant en évidence, pour la première fois, que les interactions avec un SBD peuvent dépendre d’un évènement de phosphorylation (“SBD phospho-switch”). Nos résultats nous amènent à proposer l’hypothèse que le recrutement de PML sumoylé au niveau des PML-NBs via son SBD, favorise le recrutement d’une autre activité E3 ubiquitine ligase, outre celle de RNF4, PML étant lui-même un potentiel candidat. Ceci suggère l’existence d’une nouvelle relation dynamique entre phosphorylation, sumoylation et ubiquitination de PML. Finalement, il est suggéré que PML est dégradé par deux voies différentes dépendantes de l’ubiquitine et du protéasome; la voie de CK2 et la voie de RNF4. Enfin une étude sur la sumoylation de TIF1β est également présentée en annexe. Cette étude caractérise les 6 lysines cibles de SUMO sur TIF1β et démontre que la sumoylation est nécessaire à l’activité répressive de TIF1β mais n’est pas impliquée dans son homodimérisation ou son interaction avec la boîte KRAB. La sumoylation est cependant nécessaire au recrutement d’histones déacétylases, dépendante de son homodimérisation et de l’intégrité du domaine PHD. Alors que l’on ne connaît pas de régulateur physiologique de la sumoylation outre les enzymes directement impliquées dans la machinerie de sumoylation, nous mettons en évidence que la sumoylation de TIF1β est positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB et suggérons que ces facteurs transcriptionnels recrutent TIF1β à l’ADN au niveau de promoteur et augmentent son activité répressive en favorisant sa sumoylation.

Les cellules stromales multipotentes accélèrent la guérison de plaies cutanées chez les souris irradiées via la sécrétion de la chimiokine SDF-1α

Le traitement du cancer à l’aide d’une exposition aux radiations ionisantes (RI) peut mener au développement de plusieurs effets secondaires importants, dont un retard de réparation et de régénération des tissus. Les mécanismes responsables de ces effets demeurent largement inconnus encore aujourd’hui, ce qui a pour effet de limiter le développement d’approches thérapeutiques. À l’aide d’un modèle de guérison de plaie cutanée chez la souris, nous avons cherché à déterminer les mécanismes par lesquels l’exposition aux RI limite la régénération de la peau. Nos résultats démontrent que l’induction de la "stromal-derived growth factor 1α" (SDF-1α), une cytokine normalement surexprimée dans les tissus hypoxiques, est sévèrement diminuée dans les plaies de souris irradiées versus non-irradiées. Ce défaut corrèle avec un retard de guérison des plaies et est encore évident plusieurs mois suivant l’exposition aux RI, suggérant qu’il y a une altération permanente de la capacité de la peau à se réparer. Parce que SDF-1α est secrété principalement par les fibroblastes du derme, nous avons évalué le potentiel des cellules stromales multipotentes (MSCs), qui sont reconnues pour secréter des niveaux élevés de SDF-1α, à accélérer la régénération de la peau chez les souris irradiées. L’injection de MSCs en périphéries des plaies a mené à une accélération remarquable de la guérison de la peau chez les souris exposées aux RI. Les actions des MSCs étaient principalement paracrines, dû au fait que les cellules n’ont pas migré à l’extérieur de leur site d’injection et ne se sont pas différentiées en kératinocytes. L’inhibition spécifique de l’expression de SDF-1α a mené à une réduction drastique de l’efficacité des MSCs à accélérer la fermeture de plaie indiquant que la sécrétion de SDF-1α par les MSCs est largement responsable de leur effet bénéfique. Nous avons découvert aussi qu’un des mécanismes par lequel SDF-1α accélère la guérison de plaie implique l’augmentation de la vascularisation au niveau de la peau blessée. Les résultats présentés dans ce mémoire démontrent collectivement que SDF-1α est une importante cytokine dérégulée au niveau des plaies cutanées irradiées, et que le déclin du potentiel de régénération des tissus qui est observé suivant une exposition au RI peut être renversé, s’il est possible de restaurer le microenvironnement de la blessure avec un support stromal adéquat.

Regulation of BAP1 tumor suppressor complex by post-translational modifications

Le régulateur transcriptionnel BAP1 est une déubiquitinase nucléaire (DUB) dont le substrat est l’histone H2A modifiée par monoubiquitination au niveau des residus lysines 118 et 119 (K118/K119). Depuis les dernières années, BAP1 emerge comme un gene suppresseur de tumeur majeur. En effet, BAP1 est inactivé dans un plethore de maladies humaines héréditaires et sporadiques. Cependant, malgré l’accumulation significative des connaissances concernant l’occurrence, la pénétrance et l’impact des défauts de BAP1 sur le développement de cancers, ses mécanismes d’action et de régulation restent très peu compris. Cette étude est dédiée à la caractérisation moléculaire et fonctionnelle du complexe multi-protéique de BAP1 et se présente parmi les premiers travaux décrivant sa régulation par des modifications post-traductionnelles. D’abord, nous avons défini la composition du corps du complexe BAP1 ainsi que ses principaux partenaires d’interaction. Ensuite, nous nous sommes spécifiquement intéressés a investiguer d’avantage deux principaux aspects de la régulation de BAP1. Nous avons d’abord décrit l’inter-régulation entre deux composantes majeures du complexe BAP1, soit HCF-1 et OGT. D’une manière très intéressante, nous avons trouvé que le cofacteur HCF-1 est un important régulateur des niveaux protéiques d’OGT. En retour, OGT est requise pour la maturation protéolytique de HCF-1 en promouvant sa protéolyse par O-GlcNAcylation, un processus de régulation très important pour le bon fonctionnement de HCF-1. D’autre part, nous avons découvert un mécanisme unique de régulation de BAP1 médiée par l’ubiquitine ligase atypique UBE2O. en effet, UBE2O se caractérise par le fait qu’il s’agit aussi bien d’une ubiquitine conjuratrice et d’une ubiquitine ligase. UBE2O, multi-monoubiquitine BAP1 au niveau de son domaine NLS et promeut son exclusion du noyau, le séquestrant ainsi dans le cytoplasme. De façon importante, nos travaux ont permis de mettre de l’emphase sur le rôle de l’activité auto-catalytique de chacune de ces enzymes, soit l’activité d’auto-déubiquitination de BAP1 qui est requise pour la maintenance de sa localisation nucléaire ainsi que l’activité d’auto-ubiquitination d’UBE2O impliquée dans son transport nucléo-cytoplasmique. De manière significative, nous avons trouvé que des défauts au niveau de l’auto-déubiquitination de BAP1 due à des mutations associées à certains cancers indiquent l’importance d’une propre regulation de cette déubiquitinase pour les processus associés à la suppression de tumeurs.

Role of Nuclear Angiotensin-II Receptor Mediated Signalling in Cardiovascular Remodelling

Le remodelage cardiaque est le processus par lequel la structure ou la fonction cardiaque change en réponse à un déséquilibre pathophysiologique tel qu'une maladie cardiaque, un contexte d'arythmie prolongée ou une modification de l'équilibre hormonal. Le système rénine-angiotensine (SRA) est un système hormonal largement étudié et il est impliqué dans de nombreuses activités associées au remodelage cardiovasculaire. L’existence d'un système circulatoire couplé à un système de tissus locaux est une représentation classique, cependant de nouvelles données suggèrent un SRA indépendant et fonctionnellement actif à l'échelle cellulaire. La compréhension de l'activité intracellulaire du SRA pourrait mener à de nouvelles pistes thérapeutiques qui pourraient prévenir un remodelage cardiovasculaire défavorable. L'objectif de cette thèse était d'élucider le rôle du SRA intracellulaire dans les cellules cardiaques. Récemment, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), les protéines G et leurs effecteurs ont été détectés sur des membranes intracellulaires, y compris sur la membrane nucléaire, et les concepts de RCPG intracellulaires fonctionnels sont en voie d'être acceptés comme une réalité. Nous avons dès lors fait l'hypothèse que la signalisation du SRA délimitant le noyau était impliquée dans le contrôle de l'expression des gènes cardiaques. Nous avons démontré la présence de récepteurs d'angiotensine de type-1 (AT1R) et de type-2 (AT2R) nucléaires dans les cardiomyocytes ventriculaires adultes et dans une fraction nucléaire purifiée de tissu cardiaque. Des quantités d'Ang II ont été détectées dans du lysat de cardiomyocytes et des microinjections d'Ang-II-FITC ont donné lieu à des liaisons préférentielles aux sites nucléaires. L'analyse transcriptionnelle prouve que la synthèse d'ARN de novo dans des noyaux isolés stimulés à l'Ang-II, et l'expression des ARNm de NF-κB étaient beaucoup plus importants lorsque les noyaux étaient exposés à de l'Ang II par rapport aux cardiomyocytes intacts. La stimulation des AT1R nucléaires a engendré une mobilisation de Ca2+ via les récepteurs de l'inositol trisphosphate (IP3R), et le blocage des IP3R a diminué la réponse transcriptionnelle. Les méthodes disponibles actuellement pour l'étude de la signalisation intracrine sont limitées aux méthodes indirectes. L'un des objectifs de cette thèse était de synthétiser et caractériser des analogues d'Ang-II cellule-perméants afin d’étudier spécifiquement dans les cellules intactes l'activité intracellulaire du SRA. Nous avons synthétisé et caractérisé pharmacologiquement des analogues photosensibles Ang-II encapsulée en incorporant un groupement 4,5-diméthoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) photoclivable sur les sites actifs identifiés du peptide. Chacun des trois analogues d'Ang II encapsulée synthétisés et purifiés: [Tyr(DMNB)4]Ang-II, Ang-II-ODMNB et [Tyr(DMNB)4]Ang-II-ODMNB a montré une réduction par un facteur deux ou trois de l'affinité de liaison envers AT1R et AT2R dans les dosages par liaison compétitive et une activité réduite dans la contraction de l'aorte thoracique. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans des cellules HEK a augmenté la phosphorylation d'ERK1/2 (via AT1R) et la production de cGMP (via AT2R) alors que dans les cardiomyocytes isolés elle générait une augmentation de Ca2+ nucléoplasmique et initiait la synthèse d'ARNr 18S et d'ARNm du NF-κB. Les fibroblastes sont les principaux générateurs de remodelage cardiaque structurel, et les fibroblastes auriculaires sont plus réactifs aux stimuli profibrotiques que les fibroblastes ventriculaires. Nous avons émis l'hypothèse que l’Ang-II intracellulaire et l'activation des AT1R et AT2R nucléaires associés contrôlaient les profils d'expression des gènes des fibroblastes via des systèmes de signalisation distincts et de ce fait jouaient un rôle majeur dans le développement de la fibrose cardiaque. Nous avons remarqué que les fibroblastes auriculaires expriment l’AT1R et l’AT2R nucléaire et l'Ang-II au niveau intracellulaire. L’expression d'AT1R nucléaire a été régulés positivement dans les cas d’insuffisance cardiaque (IC), tandis que l'AT2R nucléaire a été glycosylé post-traductionnellement. La machinerie protéique des protéines G, y compris Gαq/11, Gαi/3, et Gβ, a été observée dans des noyaux isolés de fibroblastes. AT1R et AT2R régulent l'initiation de la transcription du fibroblaste via les voies de transduction de signal d'IP3R et du NO. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans une culture de fibroblastes auriculaire déclenche la libération de Ca2+ nucléoplasmique, la prolifération, et la synthèse et sécrétion de collagène qui ne sont pas inhibées par les bloqueurs d'AT1R et/ou AT2R extracellulaires.

Implicating the mechanisms of ADP-ribosylation factor activation in the resistance of invasive breast cancer cells to EGFR tyrosine kinase inhibitors

ADP-ribosylation factor-1 (ARF1) est une petite GTPase principalement connue pour son rôle dans la formation de vésicules au niveau de l’appareil de Golgi. Récemment, dans des cellules de cancer du sein, nous avons démontré qu’ARF1 est aussi un médiateur important de la signalisation du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) contrôlant la prolifération, la migration et l'invasion cellulaire. Cependant, le mécanisme par lequel l’EGFR active la GTPase ainsi que le rôle de cette dernière dans la régulation de la fonction du récepteur demeure inconnue. Dans cette thèse, nous avions comme objectifs de définir le mécanisme d'activation de ARF1 dans les cellules de cancer du sein hautement invasif et démontrer que l’activation de cette isoforme de ARF joue un rôle essentiel dans la résistance de ces cellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nos études démontrent que les protéines d’adaptatrices Grb2 et p66Shc jouent un rôle important dans l'activation de ARF1. Alors que Grb2 favorise le recrutement d’ARF1 à l'EGFR ainsi que l'activation de cette petite GTPase, p66Shc inhibe le recrutement du complexe Grb2-ARF1 au récepteur et donc contribue à limiter l’activation d’ARF1. De plus, nous démontrons que ARF1 favorise la résistance aux inhibiteurs des tyrosines kinases dans les cellules de cancer du sein hautement invasif. En effet, une diminution de l’expression de ARF1 a augmenté la sensibilité descellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nous montrons également que de hauts niveaux de ARF1 contribuent à la résistance des cellules à ces médicaments en améliorant la survie et les signaux prolifératifs à travers ERK1/2, Src et AKT, tout en bloquant les voies apoptotiques (p38MAPK et JNK). Enfin, nous mettons en évidence le rôle de la protéine ARF1 dans l’apoptose en réponse aux traitements des inhibiteurs de l’EGFR. Nos résultats indiquent que la dépletion d’ARF1 promeut la mort cellulaire induite par gefitinib, en augmentant l'expression de facteurs pro-apoptotiques (p66shc, Bax), en altérant le potentiel de la membrane mitochondriale et la libération du cytochrome C. Ensemble, nos résultats délimitent un nouveau mécanisme d'activation de ARF1 dans les cellules du cancer du sein hautement invasif et impliquent l’activité d’ARF1 comme un médiateur important de la résistance aux inhibiteurs EGFR.

clc is co-expressed with clf or cntfr in developing mouse muscles

Affiliation: Jean-François Gauchat : Département de Pharmacologie, Faculté de médecine, Université de Montréal

Sleep bruxism is associated with a rise in blood pressure

Objectifs : Le bruxisme survenant au cours du sommeil est un trouble du mouvement caractérisé par du grincement de dents et l’activité rythmique des muscles masticateurs (ARMM). Le bruxisme/ARMM est souvent associé à des mouvements du corps et des à éveils corticaux. Une séquence d’activation précède le ARMM/bruxisme. Ces événements incluent une augmentation des variables suivants : l’activité sympathique (-4 minutes), les activités encéphalographique (-4 second), le fréquence cardiaque, l’amplitude de la respiration (-1 second) et l’activité des muscle suprahyoïdiens (-0.8 second). La présente étude a examiné l’association entre le bruxisme et les changements de la pression artérielle. Méthodes: Dix sujets avec le bruxisme (5 hommes, 5 femmes, âge moyen = 26 ± 1,8) ont complétés 3 nuits de polysomnographie qui comprenait l'enregistrement non invasive de la pression artérielle. La première nuit a servi de dépistage et d’habituation au laboratoire. L'analyse a été réalisée sur les deuxièmes et troisièmes nuits enregistrements. Seuls les épisodes de bruxisme isolés survenant au cours du stade 2 du sommeil ont été utilisés pour l’analyse, pour un total de 65 épisodes. Les mesures des pressions systolique et diastolique ont été prises 20 battements avant et 23 battements après l'apparition de chaque épisode bruxisme lors du sommeil. Les épisodes de bruxisme ont été classés comme suit: 1) bruxisme avec éveil cortical; 2) bruxisme avec mouvement du corps (MC), 3) bruxisme avec éveil cortical et MC. Une quatrième catégorie, bruxisme seul, a également été analysée, mais utilisée comme donnée préliminaire puisque la catégorie se composait de seulement 4 épisodes de bruxisme. Résultats: Les deux pressions systolique et diastolique ont augmenté avec les épisodes de bruxisme. Cette augmentation a été statistiquement significative pour la pression systolique et diastolique pour les épisodes de bruxisme avec éveil cortical et/ou MC (p ≤ 0,05). L’augmentation moyenne de la pression (systolique / diastolique ± SE) a été : 28,4 ± 2,4/13,2 ± 1,5 mm Hg pour le bruxisme avec éveil cortical; 30,7 ± 1,6/19.4 ± 2.3 mm Hg pour bruxisme avec MC; 26.4 ± 2,8 / 14,6 ± 2.0mm Hg pour bruxisme avec éveil cortical et MC; 22,9 ± 5,2/12,4 ± 3,3mm Hg pour les épisodes de bruxisme seuls. Conclusion: Le bruxisme du sommeil est associé à des hausses de la pression artérielle pendant le sommeil. Cette hausse est supérieure dans les épisodes de bruxisme associés à un éveil cortical et / ou MC, qui sont souvent associés avec les événements bruxisme. Ces résultats sont en accord avec nos observations antérieures, où le bruxisme est précédé par une augmentation de l'activité sympathique et de la tachycardie sinusale.

Le rôle de la signalisation Wnt dans le phénotype anormal des ostéoblastes ostéoarthrosiques

L’ostéoarthrose (OA) est une pathologie de forte incidence affectant les articulations. Elle est caractérisée principalement par une dégradation du cartilage articulaire, un déséquilibre au niveau du remodelage osseux et une sclérose de l’os sous-chondral. L’étiologie de cette pathologie reste encore méconnue, cependant il semble de plus en plus que tous les tissus composant l’articulation soient affectés dans cette pathologie. L’importance du rôle de l’os dans le développement de l’OA est incontestable et représente donc une cible thérapeuthique intéressante. Des études effectuées par tomodensitométrie ont démontré une structure et une organisation anormales du tissu osseux des patients OA. Parallèlement, les cultures primaires d’ostéoblastes (Ob) humains OA issus de l’os sous-chondral démontrent un phénotype altéré et une faible minéralisation in vitro. La signalisation Wnt, essentielle dans l’embryogenèse, a montré avoir un rôle clé dans la régulation de l’ostéogenèse en régulant notamment la différenciation terminale des Ob. Le facteur de croissance transformant-β1 (TGF-β1), un facteur agissant notamment sur la prolifération et sur le début de la différenciation des Ob, est surexprimé par les Ob OA et pourrait moduler cette signalisation. Aussi, deux populations de patients OA peuvent être différenciées in vitro par la production de prostaglandines E2 (PGE2) par leurs Ob et les PGE2, dans une étude sur le cancer colorectal, ont montré moduler la signalisation Wnt. Notre hypothèse de travail est que l’activation de la voie de signalisation Wnt/β-caténine est diminuée dans les Ob OA. Cette diminution est responsable de la sous-minéralisation et de l’altération du phénotype des Ob humains OA. Par ailleurs, DKK2, dont l’expression est contrôlée par TGF-β1, est responsable de la diminution de l’activité Wnt/β-caténine et les PGE2 peuvent en partie corriger cette situation. L’objectif général de cette étude est d’une part, de démontrer le rôle de TGF-β1, DKK2 et de PGE2 sur l’altération de la signalisation Wnt/β-caténine et d’autre part, de démontrer le lien entre TGF-β1 et DKK2 et l’effet de ces derniers sur le phénotype des Ob. Dans cette étude on a montré que la signalisation canonique Wnt est altérée dans les Ob OA et que cela était responsable de l’altération du phénotype des Ob OA. On a montré, parmi les acteurs de la signalisation Wnt, que l’expression de l’antagoniste Dickkopf-1 (DKK1) était relativement similaire entre les Ob OA et normaux contrairement à celle de l’antagoniste DKK2 qui était augmentée et à celle de l’agoniste Wnt7B qui était diminuée dans les Ob OA. On a également montré que les PGE2 pouvaient potentialiser l’activité de la signalisation Wnt dans les Ob OA. L’inhibition de DKK2 a permis d’augmenter l’activité de la signalisation Wnt et de corriger le phénotype anormal ainsi que d’augmenter la minéralisation des Ob OA. L’inhibition de TGF-β1, un facteur aussi surexprimé dans les Ob OA, a également permis la correction du phénotype et l’augmentation de la minéralisation dans les Ob OA. L’inhibition de TGF-β1 a aussi menée à l’inhibition de DKK2. Le contraire ne fût pas observé démontrant ainsi la régulation de DKK2 par TGF-β1. En conclusion, la signalisation canonique Wnt est diminuée dans les Ob OA et cela est dû au niveau élevé de DKK2 dans ces Ob. TGF-β1 régule positivement DKK2 et donc la surexpression de TGF-β1 entraîne celle de DKK2 ce qui a pour conséquences d’altérer le phénotype des Ob. Les PGE2 ont aussi montré pouvoir potentialiser l’activité de la signalisation Wnt et auraient donc un rôle positif. Ensemble, ces données suggèrent que ces altérations au niveau des Ob OA pourraient être responsables de la structure osseuse anormale observée chez les patients OA.

Structure quaternaire des récepteurs de chimiokines CXCR4 et CCR2 et interaction avec leurs effecteurs

Thèse réalisée en cotutelle avec l'université Montpellier2 dans le laboratoire de pharmacologie moléculaire de Jean-Philippe Pin à l'institut de génomique fonctionnelle (IGF), Montpellier, France.

Mass spectrometry as a tool to dissect the role of chromatin assembly factors in regulating nucleosome assembly

L'assemblage des nucléosomes est étroitement couplée à la synthèse des histones ainsi qu’à la réplication et la réparation de l’ADN durant la phase S. Ce processus implique un mécanisme de contrôle qui contribue soigneusement et de manière régulée à l’assemblage de l’ADN en chromatine. L'assemblage des nucléosomes durant la synthèse de l’ADN est crucial et contribue ainsi au maintien de la stabilité génomique. Cette thèse décrit la caractérisation par spectrométrie de masse(SM) des protéines jouant un rôle critique dans l’assemblage et le maintien de la structure chromatinienne. Plus précisément, la phosphorylation de deux facteurs d’assemblage des nucléosome, le facteur CAF-1, une chaperone d’histone qui participe à l'assemblage de la chromatine spécifiquement couplée à la réplication de l'ADN, ainsi que le complexe protéique Hir, jouant de plus un rôle important dans la régulation transcriptionelle des gènes d’histones lors de la progression normale du cycle cellulaire et en réponse aux dommages de l'ADN, a été examiné. La caractérisation des sites de phosphorylation par SM nécéssite la séparation des protéines par éléctrophorèse suivi d’une coloration a l’argent. Dans le chapitre 2, nous demontrons que la coloration à l’argent induit un artéfact de sulfatation. Plus précisément, cet artéfact est causé par un réactif spécifiquement utilisé lors de la coloration. La sulfatation présente de fortes similitudes avec la phosphorylation. Ainsi, l’incrément de masse observé sur les peptides sulfatés et phosphorylés (+80 Da) nécéssite des instruments offrant une haute résolution et haute précision de masse pour différencier ces deux modifications. Dans les chapitres 3 et 4, nous avons d’abord démontré par SM que Cac1, la plus grande sous-unité du facteur CAF-1, est cible de plusieurs sites de phosphorylation. Fait intéréssant, certains de ces sites contiennent des séquences consensus pour les kinases Cdc7-Dbf4 et CDKs. Ainsi, ces résultats fournissent les premières évidences que CAF-1 est potentiellement régulé par ces deux kinases in vivo. La fonction de tous les sites de phosphorylation identifiés a ensuite été évaluée. Nous avons démontré que la phosphorylation de la Ser-503, un site consensus de la DDK, est essentielle à la répréssion transcriptionelle des gènes au niveau des télomères. Cependant, cette phosphorylation ne semble pas être nécéssaire pour d’autres fonctions connues de CAF-1, indiquant que le blocage de la phsophorylation de Cac1 Ser-503 affecte spécifiquement la fonction de CAF-1 aux structures hétérochromatiques des télomères. Ensuite, nous avons identifiés une intéraction physique entre CAF-1 et Cdc7-Dbf4. Des études in vitro ont également demontré que cette kinase phosphoryle spécifiquement Cac1 Ser-503, suggérant un rôle potential pour la kinase Cdc7-Dbf4 dans l’assemblage et la stabilité de la structure hétérochromatique aux télomères. Finalement, les analyses par SM nous ont également permi de montrer que la sous-unité Hpc2 du complexe Hir est phosphorylée sur plusieurs sites consensus des CDKs et de Cdc7-Dbf4. De plus, la quantification par SM d’un site spécifique de phosphorylation de Hpc2, la Ser-330, s’est révélée être fortement induite suite à l’activation du point de contrôle de réplication (le “checkpoint”) suite au dommage a l’ADN. Nous montrons que la Ser-330 de Hpc2 est phopshorylée par les kinases de point de contrôle de manière Mec1/Tel1- et Rad53-dépendante. Nos données préliminaires suggèrent ainsi que la capacité du complex Hir de réguler la répréssion transcriptionelle des gènes d'histones lors de la progression du cycle cellulaire normal et en réponse au dommage de l'ADN est médiée par la phosphorylation de Hpc2 par ces deux kinases. Enfin, ces deux études mettent en évidence l'importance de la spectrométrie de masse dans la caractérisation des sites de phosphorylation des protéines, nous permettant ainsi de comprendre plus précisement les mécanismes de régulation de l'assemblage de la chromatine et de la synthèse des histones.