KATSAUS NORO- JA ROTAVIRUSDIAGNOSTIIKAN MONIMUOTOISUUTEEN SEKÄ NOPEAN RNA-TESTIN KEHITYS NOROVIRUKSELLE

Gastroenteriitti on akuuttitila, jossa oireita ovat esimerkiksi oksentelu ja ripulointi. Yleisimpiä taudin aiheuttajia ovat bakteerit ja virukset. Erityisesti norovirus (NoV) ja rotavirus kykenevät aiheuttamaan laajoja epidemioita. Haasteena näiden diagnostiikassa ovat näytematriisit, jotka häiritsevät määrityksiä. Muita haasteita ovat esimerkiksi kustannustehokkuus ja kiire, sillä yksittäiset infektiot leviävät herkästi epidemiaksi asti. Lisäksi testien olisi sovelluttava sekä kliinisiin laboratorioihin että kenttätyöhön. Immunodiagnostiikkaan perustuvat määritykset ovat rutiinikäytössä tehokkaita seulontatarkoituksessa. Tarkempaa seulontaa varten on ratkaisuksi ehdotettu nukleiinihappodiagnostiikkaa. Menetelmänä se on tehokas ja erittäin spesifinen. Heikkoutena on hitaus ja alhainen soveltuvuus kenttäolosuhteisiin. Tämän takia on kehitetty isotermisiä monistustekniikoita, jotka eivät olisi sidottu kliiniseen laboratorioympäristöön. Yksi tällainen tekniikka on monivaiheinen nukleiinihapposekvenssiin perustuva monistus (NASBA). Tutkielman kokeellisessa osassa tutkittiin lantanidikelaattien komplementaatioon perustuvan reportterimenetelmän soveltuvuutta NASBA-tekniikkaan. Reaaliaikaisen käänteiskopiointipolymeraasiketjureaktion tuloksista havaittiin, että monistumisen kanssa oli haasteita. NoV-reaktiot monistuivat vaihtelevasti ja NASBA-monistuksissa havaittiin, että NoV-reaktiot eivät monistuneet vaikka reaktio-olosuhteita muunnettiin. Syyksi tähän muodostui sekundaarimallinnuksessa templaatin sekundaarirakenteet, jotka muodostuvat NASBA-monistuksen syklisessä vaiheessa. Rakenteet kykenevät hidastamaan ja keskeyttämään käytettyjen entsyymien toimintaa. NASBA-tekniikka on haasteellinen, mutta potentiaalinen tekniikka, jota kyettäisiin käyttämään myös kenttäolosuhteissa. Tekniikan etuja ovat kehitettävyys ja muokattavuus, sillä se ei ole sidottu yhteen tiettyyn leima- tai laiteteknologiaan.

Glycosylation and Glycodiversification in Polyketide Antibiotics: Unraveling Biosynthetic Steps in Nogalamycin Formation

Soil-dwelling Streptomyces bacteria are known for their ability to produce biologically active compounds such as antimicrobial, immunosuppressant, antifungal and anticancer drugs. S. nogalater is the producer of nogalamycin, a potential anticancer drug exhibiting high cytotoxicity and activity against human topoisomerases I and II. Nogalamycin is an anthracycline polyketide comprising a four-ring aromatic backbone,a neutral deoxy sugar at C7, and an amino sugar attached via an O–C bond at C1 and a C–C bond between C2 and C5´´. This kind of attachment of the amino sugar is unusual thus making the structure of the compound highly interesting. The sugar is also associated with the biological activity of nogalamycin, as it facilitates binding to DNA. Furthermore, the sugar moieties of anthracyclines are often crucial for their biological activity. Together the interesting attachment of the amino sugar and the general reliance of polyketides on the sugar moieties for bioactivity have made the study of the biosynthesis of nogalamycin attractive. The sugar moieties are typically attached by glycosyltransferases, which use two substrates: the donor and the acceptor. The literature review of the thesis is focused on the glycosylation of polyketides and the possibilities to alter their glycosylation patterns. My own thesis work revolves around the biosynthesis of nogalamycin. We have elucidated the individual steps that lead to its rather unique structure. We reconstructed the whole biosynthetic pathway in the heterologous host S. albus using a cosmid and a plasmid. In the process, we were able to isolate new compounds when the cosmid, which contains the majority of the nogalamycin gene cluster, was expressed alone in the heterologous host. The new compounds included true intermediates of the pathway as well as metabolites, which were most likely altered by the endogenous enzymes of the host. The biological activity of the most interesting new products was tested against human topoisomerases I and II, and they were found to exhibit such activities. The heterologous expression system facilitated the generation of mutants with inactivated biosynthetic genes. In that process, we were able to identify the functions of the glycosyltransferases SnogE and SnogD, solve the structure of SnogD, discover a novel C1-hydroxylase system comprising SnoaW and SnoaL2, and establish that the two homologous non-heme α-ketoglutarate and Fe2+ dependent enzymes SnoK and SnoN catalyze atypical reactions on the pathway. We demonstrated that SnoK was responsible for the formation of the additional C–C bond, whereas SnoN is an epimerase. A combination of in vivo and in vitro techniques was utilized to unravel the details of these enzymes. Protein crystallography gave us an important means to understand the mechanisms. Furthermore, the solved structures serve as platforms for future rational design of the enzymes.

Suuhygienistiopiskelijoiden kokemuksia Biofilmi-verkko-oppimispelistä

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli kuvata suuhygienistiopiskelijoiden kokemuksia Biofilmi-verkko-oppimispelistä sekä opiskelijoiden arvioita sen hyödyllisyydestä oppimisen kannalta. Lisäksi tutkimuksessa kuvataan opiskelijoiden näkemyksiä pelin kehittämistarpeista. Verkko-oppimispelit soveltuvat hyvin sosiaali- ja terveysalan opetukseen ja edistävät näyttöön perustuvan hoitotyön oppimista. Tutkimuksessa käytettävä Biofilmipeli on tietovisa -tyyppinen pulmapeli, jossa pelaaja vastaa plakin biofilmiin liittyviin monivalintakysymyksiin. Pelissä esitetään kysymyksiä, joiden aihealueina ovat mikrobiologia, plakin biofilmin bakteerit ja niiden merkitys ihmisen suun- ja yleisterveyteen. Peli on tuotettu opinnäytetyönä Turun ammattikorkeakoulussa vuonna 2011 ja sen sisältämät kysymykset perustuvat alan tieteellisesti tutkittuun kirjallisuuteen. Tutkimus toteutettiin kuvailevana kyselytutkimuksena. Tutkimuksen kohdejoukko muodostui neljän eri ammattikorkeakoulun toisen, kolmannen ja neljännen vuosikurssin suuhygienistiopiskelijoista (N=160). Tutkimukseen osallistui 120 suuhygienistiopiskelijaa (n=120). Aineistonkeruu toteutettiin tätä tutkimusta varten laaditulla kyselylomakkeella. Kysely toteutettiin sähköisenä kyselynä Webropol -ohjelman avulla. Kyselyn vastausprosentti oli 75%. Aineisto analysoitiin tilastollisesti ja avoimet kysymykset induktiivisella sisällönanalyysilla. Suuhygienistiopiskelijoiden kokemukset Biofilmipelistä olivat pääosin positiivisia ja verkko-oppimispeli koettiin motivoivaksi ja toimivaksi opetusmenetelmäksi. Suurin osa kyselyyn vastanneista opiskelijoista koki oppivansa pelin avulla uutta ja saavansa pelistä lisää tietoa. Peli koettiin helppokäyttöiseksi ja selkeäksi sekä ulkoasultaan ja kontrastiltaan miellyttäväksi. Pelin esittämät kysymykset koettiin haasteellisiksi ja niihin vastaaminen edellytti selkeästi aikaisempaa tietoa kyseisestä aiheesta. Opiskelijat arvioivat pelin soveltuvan hyvin suuhygienistiopiskelijoille ja olisivat halukkaita käyttämään peliä opetusmenetelmänä myös tulevaisuudessa. Selkeäksi kehittämiskohteeksi opiskelijat havaitsivat kysymyksien oikeiden vastauksien näyttämisen heti, mikäli kysymykseen on vastattu väärin sekä toivoivat selkeämpää ohjeistusta vastausvaihtoehtojen suhteen. Tämän tutkimuksen tuloksia voidaan hyödyntää suunniteltaessa verkko-oppimispelien käyttöä suun terveydenhoitotyön koulutuksessa sekä kyseisen pelin ja muiden terveysalan opiskelijoille suunnattujen verkko-oppimispelien jatkokehittämisessä.